肽混合物的制作方法

肽混合物的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種適于引起免疫應答的肽混合物。其包含第一肽和第二肽，所述第一肽和第二肽各自對應于RAS蛋白的片段。所述第一肽和第二肽中的每種包含包括RAS蛋白的位置13的至少8個氨基酸的區域。所述第一肽和第二肽的所述區域中的每個獨立地具有不在所述位置13處的與RAS蛋白的相應區域相同的至少6個氨基酸殘基。所述第一肽和所述第二肽中的每種在對應于所述位置13的氨基酸處具有點突變。所述第一肽的點突變不同于所述第二肽的點突變。
【專利說明】狀混合物 發明領域
[0001] 本發明提供用于引起免疫應答的包含RAS蛋白的肽的肽混合物，用于引起免疫應 答的RAS蛋白的肽，以及包含對遞呈在MHC分子上時的此種肽具有特異性的T細胞的T細胞混 合物和T細胞制劑。本發明還涉及包含這樣的肽混合物和T細胞混合物及制劑的藥物制劑， 這樣的肽混合物、肽和T細胞混合物及制劑用于預防和/或治療癌癥的用途，以及選擇用于 治療癌癥的肽混合物、肽、T細胞混合物和T細胞制劑的方法。
[0002] 發明背景
[0003] 癌癥發作的遺傳背景是原癌基因、癌基因和腫瘤抑制基因的改變。原癌基因是具 有變成癌基因的潛能的細胞的正常基因。所有癌基因都編碼蛋白質并且通過蛋白質來行使 功能。在大部分情況中，其被證明是信號轉導通路的組分。在自然中癌基因通過點突變或易 位而由原癌基因產生，由此導致載有所述突變的細胞的狀態轉變。癌癥通過涉及癌基因和 腫瘤抑制細胞的若干突變事件的多步過程而發展。
[0004] 在其最簡單的形式中，原癌基因中的單堿基置換可能導致編碼的蛋白質有一個氨 基酸不同。
[0005] 在涉及鼠腫瘤的實驗模型中，已經證明細胞內"自我蛋白質的點突變可能產生 由與正常的肽具有單個氨基酸差異的肽組成的腫瘤排斥抗原。在腫瘤細胞表面上的主要組 織相容性(MHC)分子的背景中識別這些肽的T細胞能夠殺死腫瘤細胞并因此將腫瘤排出宿 主。（Βοοη,Τ.等，Cell 1989，Vol. 58，ρ· 293-303)
[0006] 在近三十年，進行了大量努力以分析人腫瘤抗原的抗體。已經表明此種抗體可以 用于診斷和治療用途兩者，例如連同抗癌劑一起。一個問題是抗體僅能夠結合暴露在腫瘤 細胞的表面上的腫瘤抗原。因為此原因，產生基于身體免疫系統的癌癥治療的努力不如預 期的成功。
[0007] 抗體典型地識別天然構象的游離抗原并且可以有效地識別暴露在抗原表面上幾 乎任何位點。相對于由Β細胞產生的抗體，Τ細胞僅識別在MHC分子背景中的抗原，所述抗原 在人中被稱為HLA(人白細胞抗原），并且所述識別僅在適當的抗原加工之后，所述抗原加工 通常由蛋白質的蛋白水解片段化組成，其產生適配到MHC分子的溝中的肽。這使得T細胞能 夠識別來源于胞內蛋白質的肽。T細胞可以因此識別來源于腫瘤細胞中的任何地方的異常 肽（當其被MHC分子展示在腫瘤細胞表面上時）。隨后T細胞可以被激活以消滅帶有異常肽的 腫瘤細胞。
[0008] T細胞可以通過多種機制控制癌癥的發展和生長。細胞毒性T細胞，HLA I類限制性 CD8+和HLA II類限制性CD4+，可以直接殺死帶有適當的腫瘤抗原的腫瘤細胞。需要CD4+輔 助T細胞來誘導和保持細胞毒性T細胞反應以及抗體反應，并且誘導巨噬細胞和淋巴因子活 化的殺傷細胞(LAK細胞)殺傷。
[0009] 已經鑒定了很多癌基因及其蛋白質產物。此外，已經證明健康人的T細胞庫 (repertoire)包括對被遞呈在適當的HLA分子上時的來源于一種p21RAS癌基因產物的合成 的肽片段具有特異性的T細胞。此外，預期全部癌癥中的約20%與RAS癌基因的突變相關。
[0010] 由于以下風險，即肽混合物中的一些肽是免疫顯性的并且因此抑制其他肽的HLA 遞呈，所以對將所述混合物用于患者的疫苗接種存在很大的擔心（Pion S等，Blood， 1999Feb 1;93(3):?952-62)。由體外進行的實驗已知，多種突變的1^3肽可以競爭結合負責 向相關T細胞的遞呈的HLA分子，并且具有相同長度但是表現不同突變的肽可以以不同程度 的效力抑制表現另一種突變的肽的結合和識別（T . G e d d e - D a h 1 111等，H u m a η Immunol · 1994，33，p· 266-274,以及B.H. Johanssen等，Scand.J. Immunol. , 1994,33,p.607-612)。由這些事實，免疫顯性問題已被認為是突變RAS肽疫苗的一個問題。
[0011] W0 92/14756公開了引起T細胞免疫性的癌基因蛋白質產物的合成的肽和片段，其 用于針對與RAS相關的癌癥的疫苗和用于治療癌癥的組合物。所述肽必須對應于由癌細胞 遞呈的癌基因的活性片段并且在對應于癌基因突變的一個或多個位置處包括突變。該文獻 公開了在RAS蛋白的位置12、13和61處的突變并且僅具體公開了612六、612￥、612(：、6125、 6121(、6120、6121?、〇611?、〇611(、〇6比、〇61!1、613￥和6130突變。此外，雖然該文獻提及疫苗可以 包含具有在癌基因蛋白質中發現的最常見的突變的肽的選擇，但是其沒有提示任何具體的 組合。
[0012] W0 00/66153討論了用于癌癥疫苗的引起T細胞免疫性的合成的肽混合物。所述肽 混合物由RAS p21突變體肽組成并且該文獻僅具體公開了G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、 612￥、〇61!1、〇611(、〇611^、〇611?和6130突變。該文獻還公開了由肽混合物引起的免疫應答顯著 高于由單個肽引起的免疫應答;然而，其沒有啟示可以使用除了其中所公開的那些以外的 任何其他的肽組合。
[0013] GB 2328689公開了能夠誘導特異性細胞毒性T細胞反應（CD 8+)的肽，其包含 p21ras原癌基因蛋白質的8至10個氨基酸(包括p21RAS原癌基因蛋白質的位置12和/或13或 位置61)并且在位置12、13或61具有氨基酸置換。該文獻還公開了所述肽可以用作癌癥疫苗 并且可以在用于抗癌治療的組合物中使用。然而，沒有公開特別有用的具體肽混合物。
[0014] 此外，這些文獻都沒有討論具體的肽如何與具體類型的癌癥相關，并且沒有解決 包含多種肽的混合物中的肽的冗余。
[0015] Gjertsen等（Int.J.Cancer 2001，92，p.441_450)公開了涉及用合成的突變體RAS 肽連同粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子給患有胰腺的腺癌的患者進行疫苗接種的I/II期試 驗。該試驗使用單個肽疫苗或四種突變體肽的混合物。組合疫苗由四種在胰腺癌中發現的 最常見的K-RAS突變組成，即具有G12V、G12D、G12C或G12R突變的肽。然而，該文獻沒有公開 可用的任何其他肽組合，沒有公開與癌癥相關的任何其他RAS蛋白突變，并且沒有討論具體 的肽如何與具體類型的癌癥相關。
[0016] Wed6n等（Int. J.Cancer 2010,128(5)，ρ· 1120-1128)報道了用合成的突變體RAS 肽進行疫苗接種的患有胰腺癌的患者的長期隨訪。所述疫苗由單個的RAS肽或七種RAS肽的 混合物組成。特別的，用于該試驗的七種RAS肽具有G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12VS G13D突變。然而，該文獻沒有討論具體的肽如何與具體類型的癌癥相關，并且沒有公開可用 的任何其他肽組合。
[0017] Hunger等（Exp .Dermatol .2001,10:161-167)報道了 以安全性作為第一終點并且 以RAS肽的免疫原性作為第二終點的RAS肽的體內免疫原性的臨床前導性研究。用具有四密 碼子61突變的N-ras肽9殘基49-73)對黑素瘤患者進行皮內免疫。八名患者顯示陽性的DTH 反應。然而，該文獻沒有討論具體的肽如何與具體類型的癌癥相關，并且沒有公開可用的任 何其他肽組合。
[0018] Prior等（Cancer Res.2012,72(10)，p.2457-2467)公開了不同類型的癌癥與特定 RAS同種型的突變相關并且各同種型具有不同的密碼子突變特征。此外，Prior等公開了在 RAS蛋白的位置12、13和61中出現總計18種突變，每個位置出現六種突變。該綜述還討論了 這些突變對RAS功能的影響以及導致RAS同種型突變的差異模式的潛在機制。然而，該文獻 沒有涉及癌癥的治療或預防，或疫苗內的免疫顯性和冗余的問題。此外，沒有公開針對癌癥 的疫苗或治療，并且該文獻沒有公開可用的任何其他肽組合。
[0019]因此，需要提供進一步的且更有效的癌癥疫苗和/或治療。特別地，需要提供靶向 特定癌癥的疫苗和/或治療，所述疫苗和/或治療克服了免疫顯性和冗余的問題，并且是成 本有效的。
[0020] 發明概述
[0021] 本發明提供用于解決以上討論的問題的方案，因為現在已經發現包含至少兩種在 對應于RAS蛋白的位置13的氨基酸處具有點突變的肽(其中每種肽具有不同的突變)的肽混 合物可以用作針對與RAS蛋白突變相關的癌癥的疫苗和/或用于與RAS蛋白突變相關的癌癥 的治療。特別地，已經發現至少一些本發明的肽混合物可以用作針對超過99%的與RAS蛋白 突變相關的癌癥的疫苗和/或用于超過99 %的與RAS蛋白突變相關的癌癥的治療。本發明的 肽混合物減輕了免疫顯性的問題并且減少了藥物組合物內的活性成分的冗余，由此使得所 述肽混合物成為更加成本有效的疫苗和/或治療。此外，本發明允許靶向具體類型癌癥的疫 苗接種和/或治療以及選擇靶向具體類型癌癥的肽混合物的方法。
[0022]因此，在本發明的第一方面，提供適于引起免疫應答的肽混合物，其包含第一肽和 第二肽，第一肽和第二肽各自對應于RAS蛋白的片段，其中
[0023] 第一肽和第二肽中的每種包含包括RAS蛋白的位置13的至少8個氨基酸的區域，
[0024] 第一肽和第二肽的所述區域中的每個獨立地具有不在所述位置13處的與RAS蛋白 的相應區域相同的至少6個氨基酸殘基，
[0025] 第一肽和第二肽中的每種在對應于所述位置13的氨基酸處具有點突變，并且
[0026] 第一肽的點突變不同于第二肽的點突變。
[0027] 有利地，所述點突變中的每個獨立地選自613六、613(：、6130、6131?、6133或613￥突 變。
[0028] 優選地，肽混合物還包含至少一種另外的肽，所述至少一種另外的肽對應于RAS蛋 白的片段，所述RAS蛋白的片段包含至少8個氨基酸的區域，所述區域包括RAS蛋白的位置 12,其中所述至少一種另外的肽的所述區域中的每個獨立地具有不在所述位置12處的與 RAS蛋白的相應區域相同的至少6個氨基酸殘基，并且其中在對應于RAS蛋白的位置12的氨 基酸處存在點突變;和/或至少一種另外的肽，所述至少一種另外的肽對應于RAS蛋白的片 段，所述RAS蛋白的片段包含至少8個氨基酸的區域，所述區域包括RAS蛋白的位置61，其中 所述至少一種另外的肽的所述區域中的每個獨立地具有不在所述位置61處的與RAS蛋白的 相應區域相同的至少6個氨基酸殘基，并且其中在對應于RAS蛋白的位置61的氨基酸處存在 點突變。
[0029] 方便地，在對應于RAS蛋白的位置12的氨基酸處的點突變選自G12A、G12C、G12D、 G12R、G12S或G12V突變和/或在對應于RAS蛋白的位置61的氨基酸處的點突變選自Q61E、 〇61!1、〇611(、〇611^、〇61?或〇611?突變。
[0030]有利地，第一肽或第二肽的點突變是G13C突變。
[0031]方便地，第一肽或第二肽的點突變是G13R突變。
[0032]優選地，第一肽或第二肽的點突變是G13D突變。
[0033]方便地，第一肽或第二肽的點突變是G13V突變。
[0034] 有利地，第一肽和/或第二肽的點突變選自G13C、G13D、G13R和G13V突變。
[0035]優選地，第一肽是具有G13C突變的肽并且第二肽是具有G13D突變的肽，并且所述 至少一種另外的肽包括：
[0036]具有G12A突變的肽，
[0037]具有G12C突變的肽，
[0038]具有G12D突變的肽，
[0039]具有G12R突變的肽，
[0040]具有G12S突變的肽，和 [00411具有G12V突變的肽。
[0042]有利地，第一肽是具有G13R突變的肽并且第二肽是具有G13V突變的肽，并且所述 至少一種另外的肽包括：
[0043]具有Q61H突變的肽，
[0044]具有Q61K突變的肽，
[0045]具有Q61L突變的肽，和 [0046]具有Q61R突變的肽。
[0047]方便地，肽混合物包含至少第三肽。
[0048]優選地，第三肽是對應于RAS蛋白的片段的肽，所述RAS蛋白的片段包含至少8個氨 基酸的區域，所述區域包括RAS蛋白的位置13,第三肽的所述區域具有不在位置13處的與 RAS蛋白的相應區域相同的至少6個氨基酸殘基，并且在對應于RAS蛋白的位置13的氨基酸 處存在點突變，所述點突變不同于第一肽和第二肽的點突變。
[0049] 方便地，第三肽的點突變選自G13C、G13D、G13R和G13V突變。
[0050]有利地，肽混合物包含最多8種不同的肽。
[0051]方便地，肽混合物進一步由第三肽和第四肽組成，第三肽和第四肽各自對應于RAS 蛋白的片段，其中：
[0052]第三肽和第四肽中的每種包含包括RAS蛋白的位置13的至少8個氨基酸的區域， [0053]第三肽和第四肽的所述區域中的每個獨立地具有不在所述位置13處的與RAS蛋白 的相應區域相同的至少6個氨基酸殘基，
[0054]第三肽和第四肽中的每種在對應于所述位置13的氨基酸處具有點突變，并且 [0055]所述肽中的每種的點突變不同于其他肽的點突變，其中 [0056]第一肽是具有G13R突變的肽，
[0057]第二肽是具有G13A突變的肽，
[0058]第三肽是具有G13S突變的肽，并且 [0059]第四肽是具有G13V突變的肽。
[0060] 在本發明的第二方面，提供適于引起免疫應答的肽混合物，其包含至少五種肽，所 述五種肽各自對應于RAS蛋白的片段，其中：
[0061] 所述至少五種肽中的每種包含至少8個氨基酸的區域并且包括RAS蛋白的位置13，
[0062] 所述至少五種肽的所述區域中的每個獨立地具有不在所述位置13處的與RAS蛋白 的相應區域相同的至少6個氨基酸殘基，
[0063] 所述肽中的每種在對應于所述位置13的氨基酸處具有點突變，所述點突變選自 613厶、613(：、6130、6131?、6135或613￥突變，并且
[0064] 每種肽的點突變不同于其他肽的點突變。
[0065] 在本發明的第三方面，提供適于引起免疫應答的肽混合物，其由六種肽組成，所述 六種肽各自對應于RAS蛋白的片段，其中：
[0066]每種肽包含至少8個氨基酸的區域，所述區域包括RAS蛋白的位置12，
[0067] 所述肽的所述區域中的每個獨立地具有不在所述位置12處的與RAS蛋白的相應區 域相同的至少6個氨基酸殘基，
[0068] 所述肽中的每種在對應于所述位置12的氨基酸處具有點突變，所述點突變選自 612厶、612(：、6120、6121?、6125或612￥突變，并且
[0069] 每種肽的點突變不同于其他肽的點突變。
[0070] 在本發明的第四方面，提供適于引起免疫應答的肽混合物，其由六種肽組成，所述 六種肽各自對應于RAS蛋白的片段，其中：
[0071] 每種肽包含至少8個氨基酸的區域，所述區域包括RAS蛋白的位置61，
[0072] 所述肽的所述區域中的每個獨立地具有不在所述位置61處的與RAS蛋白的相應區 域相同的至少6個氨基酸殘基，
[0073] 所述肽中的每種在對應于所述位置61的氨基酸處具有點突變，所述點突變選自 〇6比、〇61!1、〇611(、〇611^、〇61?或〇611?突變，并且
[0074] 每種肽的點突變不同于其他肽的點突變。
[0075] 在本發明的第五方面，提供適于引起免疫應答的肽混合物，其由第一肽、第二肽、 第三肽和第四肽組成，所述第一肽、第二肽、第三肽和第四肽各自對應于RAS蛋白的片段，其 中第一肽、第二肽和第三肽中的每種包含包括RAS蛋白的位置12的至少8個氨基酸的區域， 第四肽包含包括RAS蛋白的位置13的至少8個氨基酸的區域，第一肽、第二肽、第三肽和第四 肽的所述區域中的每個分別獨立地具有不在所述位置12或13處的與RAS蛋白的相應區域相 同的至少6個氨基酸殘基，第一肽、第二肽、第三肽和第四肽中的每種分別在對應于所述位 置12或13的氨基酸處具有點突變，并且
[0076]第一肽是具有G12A突變的肽，
[0077]第二肽是具有G12R突變的肽，
[0078]第三肽是具有G12S突變的肽，并且 [0079]第四肽是具有G13C突變的肽。
[0080] 有利地，在本發明的所有方面，在包括位置12、13或61的所述區域外的每種肽與 RAS蛋白具有至少75 %序列同一性。
[0081] 在本發明的第六方面，提供用作疫苗或藥物并且對應于RAS蛋白的片段的肽，其 中：
[0082] 所述肽包含包括RAS蛋白的位置13的至少8個氨基酸的區域，
[0083] 所述區域具有不在所述位置13處的與RAS蛋白的相應區域相同的至少6個氨基酸 殘基，并且
[0084]所述肽在對應于所述位置13的氨基酸處具有G13C或G13R點突變。
[0085] 在本發明的第七方面，提供適于引起免疫應答并且對應于RAS蛋白的片段的肽，其 中：
[0086] 所述肽包含包括RAS蛋白的位置13的至少8個氨基酸的區域，
[0087] 所述區域具有不在所述位置13處的與RAS蛋白的相應區域相同的至少6個氨基酸 殘基，并且
[0088]所述肽在對應于所述位置13的氨基酸處具有G13C或G13R點突變。
[0089] 在本發明的第八方面，提供適于引起免疫應答并且對應于RAS蛋白的片段的肽，其 中：
[0090] 所述肽包含包括RAS蛋白的位置13的至少8個氨基酸的區域，
[0091] 所述區域具有不在所述位置13處的與RAS蛋白的相應區域相同的至少6個氨基酸 殘基，
[0092]所述肽包含不超過30個氨基酸殘基，并且
[0093]所述肽在對應于所述位置13的氨基酸處具有G13C或G13R點突變。
[0094] 在本發明的第九方面，提供T細胞混合物或T細胞制劑，所述T細胞混合物包含對根 據上述的第一至第五方面中的任一方面的肽混合物之一中的各種肽具有特異性的T細胞， 所述T細胞制劑包含對遞呈在MHC分子上時的以上所述的根據本發明的第六方面使用的肽 或根據第七或第八方面的肽之一具有特異性的T細胞。
[0095] 在本發明的第十方面，提供藥物組合物，所述藥物組合物包含根據上述的第一至 第五方面中的任一方面的肽混合物，根據上述第六方面使用的肽，根據上述第七或第八方 面的肽或根據上述第九方面的T細胞混合物或T細胞制劑以及藥用載體、稀釋劑和/或賦形 劑。
[0096] 優選地，上述的各方面中的任一方面的肽混合物、肽、使用的肽、T細胞混合物、T細 胞制劑或藥物組合物用于預防和/或治療癌癥。
[0097] 方便地，所述癌癥是腎上腺癌、自主神經節癌、膽管癌、骨癌、乳腺癌、中樞神經系 統癌、宮頸癌、結直腸癌、子宮內膜癌、造血器官(haematopoietic)癌、淋巴癌、腎癌、大腸 癌、肝癌、肺癌、食管癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、唾液腺癌、皮膚癌、小腸癌、胃癌、睪丸 癌、胸腺癌、甲狀腺癌、上呼吸消化道癌和尿道癌和/或惡性黑素瘤。
[0098] 有利地，所述癌癥是結直腸癌、肺癌和/或胰腺癌。
[0099] 方便地，根據上述的各方面的肽混合物、肽、使用的肽、T細胞混合物、T細胞制劑或 藥物組合物用于預防和/或治療惡性黑素瘤。
[0100] 在本發明的第十一方面，提供治療或預防癌癥的方法，所述方法包括:施用上述的 根據第一至第五方面中的任一方面的肽混合物，根據第六方面使用的肽，根據第七或第八 方面的肽，根據第九方面的T細胞混合物或T細胞制劑或根據第十方面的藥物組合物。
[0101] 在本發明的第十二方面，提供肽混合物、用作疫苗或藥物的肽、肽、T細胞混合物、T 細胞制劑或藥物組合物，其用于包括以下步驟的方法：
[0102] i)鑒定存在于取自患者的樣品中的RAS蛋白突變；
[0103] ii)選擇包含含有對應于所述樣品中鑒定的RAS蛋白突變中的至少一個的點突變 的肽的根據上述的第一至第五方面中的任一方面的肽混合物;或選擇包含對應于所述樣品 中鑒定的RAS蛋白突變中的至少一個的點突變的根據上述第六方面使用的肽;或選擇包含 對應于所述樣品中鑒定的RAS蛋白突變中的至少一個的點突變的根據上述的第七或第八方 面的肽;或選擇包含對遞呈在MHC分子上時包含對應于所述樣品中鑒定的RAS蛋白突變中的 至少一個的點突變的肽具有特異性的T細胞的根據上述的第九方面的T細胞混合物或T細胞 制劑;或選擇根據上述的第十方面的藥物組合物，所述藥物組合物包含含有對應于所述樣 品中鑒定的RAS蛋白突變中的至少一個的點突變的肽混合物、用作疫苗或藥物的肽或肽，或 包含對遞呈在MHC分子上時包含對應于所述樣品中鑒定的RAS蛋白突變中的至少一個的點 突變的肽具有特異性的T細胞的T細胞混合物或T細胞制劑，以及
[0104] i i i)向患者施用肽混合物、使用的肽、肽、T細胞混合物或T細胞制劑。
[0105] 在本發明的第十三方面，提供選擇用于向患者施用的肽混合物、用作疫苗或藥物 的肽、肽、T細胞混合物、T細胞制劑或藥物組合物的方法，所述方法包括：
[0106] i)鑒定存在于取自患者的樣品中的RAS蛋白突變;和
[0107] ii)選擇包含含有對應于所述樣品中鑒定的RAS蛋白突變中的至少一個的點突變 的肽的根據上述的第一至第五方面中的任一方面的肽混合物;或選擇根據上述的第六方面 使用的肽;或選擇根據上述的第七或第八方面的肽;或選擇包含對遞呈在MHC分子上時包含 對應于所述樣品中鑒定的RAS蛋白突變中的至少一個的點突變的肽具有特異性的T細胞的 根據上述的第九方面的T細胞混合物或T細胞制劑;或選擇根據上述的第十方面的藥物組合 物，所述藥物組合物包含含有對應于所述樣品中鑒定的RAS蛋白突變中的至少一個的點突 變的肽混合物、用作疫苗或藥物的肽或肽，或包含對遞呈在MHC分子上時包含對應于所述樣 品中鑒定的RAS蛋白突變中的至少一個的點突變的肽具有特異性的T細胞的T細胞混合物或 T細胞制劑。
[0108] 在本發明的第十四方面，提供根據上述的第一至第五方面中的任一方面的肽混合 物、根據上述的第六方面使用的肽或根據上述的第七或第八方面的肽用于制備根據上述的 第九方面的T細胞混合物或T細胞制劑的用途。
[0109] 上述的肽混合物、使用的肽和肽通常分離自其天然環境。
[0110]術語"肽"，當在本文中使用時，是指作為較長的蛋白質的片段(或具有對應于較長 的蛋白質的片段的序列）的氨基酸殘基的聚合物。該術語還適用于這樣的氨基酸聚合物，其 中一個或多個氨基酸殘基是修飾的殘基，或非天然存在的殘基，如相應的天然存在的氨基 酸的人工化學擬似物，以及天然存在的氨基酸聚合物。
[0111] 兩個序列之間的百分比"同一性"可以使用BLASTP算法版本2.2.2(Altschul， Stephen F.,Thomas L.Madden,Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang,Zheng Zhang, Webb Miller和David J.Lipman(1997)，"Gapped BLAST and PSI_BLAST:a new generation of protein database search programs"，Nucleic Acids Res .25:3389-3 4 0 2 )使用默認參數來確定。特別地，可以在互聯網上使用U R L h 11 p : / / www · neb i. nlm · nih · gov/b last/來訪問 BLAST算法。
[0112] 術語"免疫應答"，當在本文中使用時，在一些實施方案中是指在主要組織相容性 (MHC)分子將肽遞呈在細胞表面上后T細胞介導的免疫應答，并且特別地是指在肽的遞呈后 的Τ細胞的激活。
[0113] 術語"RAS蛋白"，當在本文中使用時，是指由ras原癌基因編碼的那類小GTP酶蛋白 并且包括RAS蛋白的全部三種同種型：HRAS、KRAS和NRAS。在一些實施方案中，術語"RAS蛋 白"是指對應于UniProtKB/Swiss-Prot登錄號P01112.1并且如SEQ ID N0:33中所示的蛋白 質。
[0114] 術語"RAS蛋白的位置13"，當在本文中使用時，是指從N端數起，形成野生型RAS蛋 白的一級結構的氨基酸鏈中的第十三個氨基酸。
[0115] 術語"RAS蛋白的位置12"，當在本文中使用時，是指從N端數起，形成野生型RAS蛋 白的一級結構的氨基酸鏈中的第十二個氨基酸。
[0116] 術語"RAS蛋白的位置61"，當在本文中使用時，是指從N端數起，形成野生型RAS蛋 白的一級結構的氨基酸鏈中的第六十一個氨基酸。
[0117] 術語"對應于位置13的氨基酸"，當在本文中使用時，表示RAS蛋白的肽中的位于所 述肽的氨基酸鏈中在對應于RAS蛋白的氨基酸序列的第十三個氨基酸(從N端數起）的位置 處的氨基酸。術語"對應于位置12的氨基酸"和"對應于位置61的氨基酸"具有相應的含義。
[0118] 術語"肽混合物"，當在本文中使用時，是指被混合但未化學結合的兩個以上的肽。 所述混合物可以作為干粉、溶液、懸浮液或膠體呈現，并且可以是均質的或異質的。
[0119] 術語"RAS蛋白突變"，當在本文中使用時，是指在存在于取自受試者的樣品中的 RAS蛋白中存在的一個或多個點突變。
[0120] 術語"點突變"，當在本文中使用時，是指蛋白質產物的多肽鏈中的單個氨基酸殘 基被不同的氨基酸殘基代替。
[0121]術語，例如，"G12V突變"，當在本文中使用時，是指使得野生型RAS蛋白的位置12處 的甘氨酸(G)被纈氨酸(V)代替的點突變。類似的定義適用于類似的術語，如G13C、G13R、 Q61H 等。
[0122] 術語"藥物組合物"，當在本文中使用時，表示適用于出于治療目的而向目標人或 動物受試者施用的藥物制劑。
[0123] 附圖簡述
[0124] 圖1是這樣的圖，其顯示存在于所有癌癥中的RAS突變的發生率。
[0125] 圖2是這樣的圖，其顯示對應于本發明的兩種肽混合物(TG02和TG03)中的肽的在 所有癌癥中的RAS突變的相應發生率。
[0126] 圖3是這樣的圖，其顯示對應于本發明的兩種肽混合物(TG02和TG03)中的肽的在 肺癌中的RAS突變的相應發生率。
[0127] 圖4是這樣的圖，其顯示對應于本發明的兩種肽混合物(TG02和TG03)中的肽的在 結直腸癌中的RAS突變的相應發生率。
[0128] 圖5是這樣的圖，其顯示對應于本發明的兩種肽混合物(TG02和TG03)中的肽的在 惡性黑素瘤中的RAS突變的相應發生率。
[0129] 圖6是這樣的圖，其顯示在健康供體中，對三輪的利用具有G13C突變的RAS肽（SEQ IDN0:19)和具有G13R突變的RAS肽(SEQIDN0 :27)的混合物的體外刺激的增殖的T細胞響 應。APC:抗原遞呈細胞(PBMC)，CPM:計數/分鐘。
[0130] 圖7是這樣的圖，其顯示在健康供體中，對三輪的利用由G13C肽（SEQ ID NO: 19)， G13D肽（SEQ ID N0:20)，G12A肽（SEQ ID N0:21)，G12C肽（SEQ ID N0:22)，G12D肽（SEQ ID N0:23)，G12R肽（SEQIDN0:24)，G12S肽（SEQIDN0:25)，G12V肽（SEQIDN0:26)和G13R肽 (SEQ ID NO: 27)組成的RAS肽混合物的體外刺激的增殖的T細胞響應。APC:抗原遞呈細胞 (PBMC)，CPM:計數 / 分鐘。
[0131] 圖8是這樣的圖，其顯示在健康供體中，在利用TG02+13R的三輪體外刺激后，對 G13C RAS肽(SEQ ID從):19)的1'細胞響應<^?(：:抗原遞呈細胞(？81〇,0?]\1 :計數/分鐘。
[0132] 圖9是這樣的圖，其顯示取自用RAS肽混合物（TG02;小鼠#4和#7)和TG02 + Viscogel?(小鼠#24、#29和#30)接種的小鼠的脾細胞的增殖性反應。ConA:伴刀豆球蛋白A (陽性對照）。
[0133] 序列表簡述
[0134] SEQ ID N0:1顯示具有G13C突變的RAS肽的氨基酸序列。
[0135] SEQ ID從):2顯示具有6131?突變的1^5肽的氨基酸序列。
[0136] SEQ ID從):3顯示具有6130突變的1^5肽的氨基酸序列。
[0137] SEQ ID從):4顯示具有613￥突變的1^5肽的氨基酸序列。
[0138] SEQ ID從):5顯示具有6134突變的1^3肽的氨基酸序列。
[0139] SEQ ID從):6顯示具有6135突變的1^5肽的氨基酸序列。
[0140] SEQ ID從):7顯示具有6124突變的1^3肽的氨基酸序列。
[0141] SEQ ID從):8顯示具有612(：突變的1^5肽的氨基酸序列。
[0142] SEQ ID從):9顯示具有6120突變的1^3肽的氨基酸序列。
[0143] SEQ ID從)：10顯示具有6121?突變的1^3肽的氨基酸序列。
[0144] SEQ ID從):11顯示具有6123突變的1^3肽的氨基酸序列。
[0145] SEQ ID從):12顯示具有612￥突變的1^3肽的氨基酸序列。
[0146] SEQ ID從)：13顯示具有〇611?突變的1^3肽的氨基酸序列。
[0147] SEQ ID從)：14顯示具有〇611(突變的1^3肽的氨基酸序列。
[0148] SEQ ID從)：15顯示具有〇61!1突變的1^3肽的氨基酸序列。
[0149] SEQ ID從)：16顯示具有〇611^突變的1^3肽的氨基酸序列。
[0150] SEQ ID從)：17顯示具有〇6把突變的1^3肽的氨基酸序列。
[0151] SEQ ID從):18顯示具有〇61?突變的1^5肽的氨基酸序列。
[0152] SEQ ID從)：19顯示具有613(：突變的了602的1^3肽的氨基酸序列。
[0153] SEQ ID從):20顯示具有6130突變的了602的1^3肽的氨基酸序列。
[0154] SEQ ID N0:21顯示具有G12A突變的TG02的RAS肽的氨基酸序列。
[0155] SEQ ID從):22顯示具有612(：突變的了602的1^肽的氨基酸序列。
[0156] SEQ ID從):23顯示具有6120突變的了602的1^肽的氨基酸序列。
[0157] SEQ ID從):24顯示具有6121?突變的了602的1^肽的氨基酸序列。
[0158] SEQ ID從):25顯示具有6123突變的了602的1^肽的氨基酸序列。
[0159] SEQ ID從):26顯示具有612￥突變的了602的1^3肽的氨基酸序列。
[0160] SEQ ID從):27顯示具有6131?突變的了603的1^3肽的氨基酸序列。
[0161] SEQ ID從):28顯示具有613￥突變的了603的1^3肽的氨基酸序列。
[0162] SEQ ID從):29顯示具有0611?突變的了603的1^3肽的氨基酸序列。
[0163] SEQ ID從):30顯示具有0611(突變的了603的1^3肽的氨基酸序列。
[0164] SEQ ID從):31顯示具有061!1突變的了603的1^3肽的氨基酸序列。
[0165] SEQ ID從):32顯示具有0611^突變的了603的1^3肽的氨基酸序列。
[0166] SEQ ID NO:33顯示野生型RAS蛋白的全長氨基酸序列。
[0167] 發明詳述
[0168] 本發明總體上涉及肽混合物，所述肽混合物包含RAS蛋白的至少第一肽和第二肽， 所述第一肽和第二肽包含包括RAS蛋白的位置13的至少8個氨基酸的區域，其中所述至少第 一肽和第二肽中的每種在位置13處具有點突變，并且其中位置13突變彼此不同。
[0169] 本發明的混合物中的肽可以是HRAS、KRAS或NRAS中的任一種的肽。這三種RAS同種 型在負責GDP/GTP結合的所有區域(即，在癌癥中經歷突變的區域)中都具有序列同一性。
[0170] 在一些實施方案中，第一肽和第二肽中的每種獨立地包含至少8、至少9、至少10、 至少12、至少16、至少17、至少18、至少20、至少24或至少30個氨基酸。在優選的實施方案中， 第一肽和第二肽中的每種包含至少8個氨基酸。在其他優選的實施方案中，第一肽和第二肽 中的每種包含至少17個氨基酸。
[0171 ]在一些實施方案中，第一肽和第二肽中的每種獨立地具有不超過30個氨基酸。例 如，在某些實施方案中，第一肽和第二肽中的每種獨立地包含不超過28、26、24、22、20、18、 17、16、14、12、10或8個氨基酸。在一些實施方案中，第一肽和第二肽中的每種包含不超過17 個氨基酸。
[0172]在一些實施方案中，第一肽和第二肽中的每種獨立地在除了包括位置13的區域以 外的位置處與RAS蛋白具有至少20%、至少25%、至少30%、至少37%、至少50%、至少60%、 至少66%、至少75%、至少85%、至少95%、至少99%或100%序列同一性。在一些實施方案 中，第一肽和第二肽中的每種獨立地在除了包括位置13的區域以外的位置處與SEQ ID N0: 1-6之一具有至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少66%、至 少75%、至少85%、至少95%、至少99%或100%序列同一性。在優選的實施方案中，第一肽 和第二肽中的每種獨立地在除了包括位置13的區域以外的位置處與SEQ ID N0:1-6之一具 有至少95%序列同一性。在其他實施方案中，第一肽和第二肽中的每種獨立地在除了包括 位置13的區域以外的位置處與SEQ ID N0:1-6之一具有100%序列同一性。在一些實施方案 中，第一肽在除了包括位置13的區域以外的位置處與SEQ ID N0:1-6之一具有百分比序列 同一性并且第二肽在除了包括位置13的區域以外的位置處與SEQ ID N0:1-6中不同的一個 具有不同的百分比序列同一性。在其他實施方案中，第一肽在除了包括位置13的區域以外 的位置處與SEQ ID N0:1-6之一具有百分比序列同一性并且第二肽在除了包括位置13的區 域以外的位置處與SEQ ID N0:1-6中不同的一個具有相同的百分比序列同一"性。在所有實 施方案中，第一肽和第二肽中的每種都能夠引起免疫應答。
[0173]肽混合物中的第一肽和第二肽中的每種在RAS蛋白的位置13處具有點突變，其中 第一肽中的點突變不同于第二肽中的點突變。野生型RAS蛋白在位置13處包含甘氨酸(G)。 因此，位置13處的突變可以是從甘氨酸到任何其他氨基酸的點突變。然而，發現G13A、G13C、 G13D、G13R、G13S和G13V突變與癌癥尤其相關。因此，在優選的實施方案中，第一肽和第二肽 中的每種的點突變獨立地是613六、613(：、6130、6131?、6135或613￥突變中的一個。在更優選的 實施方案中，第一肽和第二肽中的一個的位置13處的點突變獨立地是G13C或G13R突變。在 特別優選的實施方案中，第一肽或第二肽中的一個的位置13處的點突變是G13C突變。在其 他特別優選的實施方案，第一肽或第二肽中的一個的位置13處的點突變是G13R突變。
[0174] 在一些實施方案中，第一肽或第二肽的位置13處的點突變是G13C突變并且另一個 肽的位置13處的點突變是Gl 3D突變。
[0175] 在其他實施方案中，第一肽或第二肽的位置13處的點突變是G13R突變并且另一個 肽的位置13處的點突變是Gl 3V突變。
[0176] 在另外的實施方案中，第一肽或第二肽的位置13處的點突變是G13C突變，并且另 一個肽的位置13處的點突變是Gl 3R突變。
[0177] 在本發明的備選的實施方案中，肽混合物可以包含RAS蛋白的至少第三肽，所述第 三肽包含包括RAS蛋白的位置13的至少8個氨基酸的區域。所述至少第三肽可以在對應于 RAS蛋白的位置13的氨基酸處具有不同于第一肽和第二肽的位置13突變的點突變。在獨立 于第一肽和第二肽的點突變的情況下，所述點突變可以是G13A、G13C、G13D、G13R、G13SS G13V突變中的一種。在一些實施方案中，第一肽具有G13C突變，第二肽具有G13D突變并且第 三肽具有G13R突變。
[0178] 本發明的肽混合物可以另外地包含RAS蛋白的至少一種另外的肽，所述至少一種 另外的肽包含至少8個氨基酸的區域。在一些實施方案中，所述至少一種另外的肽的所述區 域包括RAS蛋白的位置12。在其他實施方案中，所述至少一種另外的肽的所述區域包括RAS 蛋白的位置61。
[0179] 在肽混合物包含至少第三肽的實施方案中，所述肽中的每種獨立地包含至少8、至 少9、至少10、至少12、至少16、至少17、至少18、至少20、至少24或至少30個氨基酸。在優選的 實施方案中，所述肽中的每種包含至少8個氨基酸。在其他優選的實施方案中，所述肽中的 每種包含至少17個氨基酸。在另外的實施方案中，所述肽中的每種包含至少18個氨基酸。通 常，肽混合物中的每種肽可以包含與肽混合物中的其他肽中的一個或多個不同數目的氨基 酸。在一些實施方案中，肽混合物中的每種肽包含不超過30個氨基酸。例如，在某些實施方 案中，肽混合物中的每種肽獨立地包含不超過28、26、24、22、20、18、17、16、14、12、10或8個 氨基酸。在一些實施方案中，肽混合物中的每種肽包含不超過17個氨基酸。
[0180] 在肽混合物包含至少一種另外的肽而所述至少一種另外的肽包含包括RAS蛋白的 位置12的區域的實施方案中，對應于RAS蛋白的位置12的氨基酸具有點突變。在野生型RAS 蛋白中，位置12的氨基酸是甘氨酸(G)。因此，在一些實施方案中，位置12處的點突變可以是 除甘氨酸以外的氨基酸。在一些實施方案中，各突變獨立地是G12A、G12C、G12D、G12R、G12S 或G12V突變。在其他實施方案中，至少一種另外的肽在除了包括位置12的區域以外的位置 處與RAS蛋白具有至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少 66%、至少75%、至少85%、至少95%、至少99%或100%序列同一性。在一些實施方案中，至 少一種另外的肽在除了包括位置12的區域以外的位置處與SEQ ID N0:7-12和21-26之一具 有至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少66%、至少75%、至 少85%、至少95%、至少99%或100%序列同一性。在一些實施方案中，存在超過一種另外的 RAS蛋白的肽，其包含包括RAS蛋白的位置12的至少8個氨基酸的區域并且在對應于RAS蛋白 的位置12的氨基酸處具有點突變。在這樣的實施方案中，具有位置12突變的肽中的每種具 有不同的點突變。
[0181] 在肽混合物包含至少一種另外的肽而所述至少一種另外的肽包含包括RAS蛋白的 位置61的至少8個氨基酸的區域的實施方案中，對應于RAS蛋白的位置61的氨基酸具有點突 變。在野生型RAS蛋白中，位置61處的氨基酸是谷氨酰胺(Q)。因此，在一些實施方案中，位置 61處的點突變是突變成除了谷氨酰胺之外的氨基酸。在一些實施方案中，所述點突變是 〇6把、〇61!1、〇611(、〇611^、〇61?或〇611?突變。在其他實施方案中，至少一種另外的肽在除了包 括位置61的區域以外的位置處與RAS蛋白具有至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至 少50 %、至少60 %、至少66 %、至少75%、至少85 %、至少95 %、至少99 %或100 %序列同一 性。在一些實施方案中，至少一種另外的肽在除了包括位置61的區域以外的位置處與SEQ ID N0:13-18和29-32之一具有至少20 %、至少25%、至少30%、至少40%、至少50 %、至少 60 %、至少66%、至少75 %、至少85%、至少95 %、至少99%或100%序列同一性。在一些實施 方案中，存在超過一種另外的RAS蛋白的肽，其包含包括RAS蛋白的位置61的至少8個氨基酸 的區域并且在對應于RAS蛋白的位置61的氨基酸處具有點突變。在這樣的實施方案中，具有 位置61突變的肽中的每種具有不同的點突變。
[0182] 在一些實施方案中，肽混合物還包含至少兩種RAS蛋白的肽，其各自包含包括RAS 蛋白的位置12或61的至少8個氨基酸的區域。在這樣的實施方案中，所述至少兩種另外的肽 包含具有包括RAS蛋白的位置12的至少8個氨基酸的區域并且在對應于RAS蛋白的位置12的 氨基酸處具有點突變的至少一種肽，和包含包括RAS蛋白的位置61的至少8個氨基酸的區域 并且在對應于RAS蛋白的位置61的氨基酸處具有點突變的至少一種肽。位置12處的點突變 可以是612六、612(：、6120、6121?、6123或612￥突變中的一種。位置61處的點突變可以是〇6把、 〇61!1、〇611(、〇611^、〇61?或〇611?突變中的一種。包括1^3蛋白的位置12的至少一種肽可以在除 了包括位置12的區域以外的位置處與RAS蛋白具有至少20%、至少25%、至少30%、至少 40%、至少50 %、至少60 %、至少66 %、至少75 %、至少85 %、至少95 %、至少99 %或100 %序 列同一性。在一些實施方案中，包含包括位置12的至少8個氨基酸的區域的至少一種另外的 肽在除了包括位置12的區域以外的位置處與SEQ ID N0:7-12和21-26之一具有至少20%、 至少25 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少66 %、至少75 %、至少85 %、至少 95 %、至少99%或100 %序列同一性。包含包括RAS蛋白的位置61的至少8個氨基酸的區域的 至少一種肽可以在除了包括位置61的區域以外的位置處與RAS蛋白具有至少20%、至少 25 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少66 %、至少75 %、至少85 %、至少95 %、 至少99%或100%序列同一性。在一些實施方案中，包括RAS蛋白的位置61的至少一種另外 的肽在除了包括位置61的區域以外的位置處與SEQ ID N0:13-18和29-32之一具有至少 20 %、至少25 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少66 %、至少75 %、至少85 %、 至少95%、至少99%或100%序列同一性。在本發明的肽混合物中可以預期以上提及的突變 和SEQ ID N0的任意組合。
[0183] 在一些實施方案中，肽混合物由具有G13C突變的肽，具有G13D突變的肽，具有G12A 突變的肽，具有G12C突變的肽，具有G12D突變的肽，具有G12R突變的肽，具有G12S突變的肽 和具有G12V突變的肽組成。在這樣的實施方案中，肽混合物由獨立地分別在除了包括位置 12或13的區域以外的位置處與SEQ ID勵：1、3、7、8、9、10、11和12具有至少20%、至少25%、 至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少66 %、至少75 %、至少85 %、至少95 %、至少 99%或100%序列同一性的肽組成。在一些實施方案中，肽混合物由獨立地分別在除了包括 位置12或13的區域以外的位置處與SEQ ID NO: 19-26具有至少20%、至少25%、至少30%、 至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少66 %、至少75 %、至少85 %、至少95 %、至少99 %或 100%序列同一性的肽組成。當與SEQ ID NO: 19-26具有100%序列同一性時，本發明的該實 施方案在本文中被稱為TG02。表4和圖2顯示優選地存在于TG02中的肽。這些突變在與RAS突 變相關的癌癥(肺癌和結直腸癌）中的發生率分別顯示在圖1、3和4中。用TG02接種小鼠后的 脾細胞增殖測定的結果顯示在圖9中，并且其顯示TG02有效地引起免疫應答。
[0184]在備選的實施方案中，肽混合物由具有G13R突變的肽，具有G13V突變的肽，具有 Q61H突變的肽，具有Q61K突變的肽，具有Q61L突變的肽和具有Q61R突變的肽組成。在這樣的 實施方案中，肽混合物由獨立地分別在除了包括位置13和61的區域以外的位置處與SEQ ID NO: 2、4、13、14、15和16具有至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、 至少66%、至少75%、至少85%、至少95%、至少99%或100%序列同一性的肽組成。在一些 實施方案中，肽混合物由獨立地分別在除了包括位置13或61的區域以外的位置處與SEQ ID NO :27-32具有至少20%、至少25 %、至少30%、至少40 %、至少50 %、至少60%、至少66 %、至 少75%、至少85%、至少95%、至少99%或100%的肽組成。當與SEQ ID N0:27-32具有100% 序列同一性時，本發明的該實施方案在本文中被稱為TG03。表5和圖2顯示TG03的肽。這些突 變在惡性黑素瘤中的發生率顯示在圖5中。
[0185] 在其他實施方案中，肽混合物由具有G13C突變的肽，具有G13D突變的肽，具有G13R 突變的肽，具有G12A突變的肽，具有G12C突變的肽，具有G12D突變的肽，具有G12R突變的肽， 具有G12S突變的肽和具有G12V突變的肽組成。在這樣的實施方案中，肽混合物由獨立地分 別在除了包括位置12或13的區域以外的位置處與SEQ ID勵：1、2、3、7、8、9、10、11和12具有 至少20 %、至少25 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少66 %、至少75 %、至少 85 %、至少95%、至少99%或100%序列同一性的肽組成。在一些實施方案中，肽混合物由獨 立地分別在除了包括位置12或13的區域以外的位置處與SEQ ID N0:19-27具有至少20%、 至少25 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少66 %、至少75 %、至少85 %、至少 95 %、至少99%或100 %序列同一性的肽組成。利用該實施方案的肽混合物體外刺激PMBC后 的T細胞增殖測定的結果顯示在圖7中，并且其顯示T細胞被該混合物刺激。因此，本發明的 肽混合物有效地引起免疫應答。
[0186] 通常，本發明的肽，在包括位置12、13或61的8個氨基酸的區域內，分別除了在位置 12、13或61處的殘基以外，具有與RAS蛋白的相應區域相同的至少6個氨基酸殘基。此外，通 常，本發明的肽，在除了包括RAS蛋白的位置12、13或61的區域以外的位置處，獨立地分別與 SEQ ID N0:1-32之一具有至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、 至少66%、至少75%、至少85%、至少95%、至少99%或100%。
[0187] 在一些實施方案中，肽混合物由第一、第二、第三肽和第四肽組成，其中第一肽和 第二肽如上所述。第三肽和第四肽中的每種包含包括RAS蛋白的位置13的至少8個氨基酸的 區域，并且第三肽和第四肽中的每種獨立地在除了包括位置13的區域以外的位置處與RAS 蛋白具有至少20%、至少25 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少66 %、至少 75 %、至少85%、至少95 %、至少99%或100 %序列同一性。第三肽和第四肽中的每種可以獨 立地在除了包括位置13的區域以外的位置處與SEQ ID N0:l-6、19、20、27或28之一具有至 少20 %、至少25 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少66 %、至少75 %、至少 85 %、至少95%、至少99 %或100%序列同一性。第三肽和第四肽中的每種在對應于RAS肽的 位置13的氨基酸處具有點突變，并且第一肽、第二肽、第三肽和第四肽中的每種具有不同于 其他肽的點突變的點突變。在一個實施方案中，第一肽是具有G13R突變的肽，第二肽是具有 G13A突變的肽，第三肽是具有G13S突變的肽并且第四肽是具有G13V突變的肽。
[0188] 在一些實施方案中，在肽混合物中最多有8種不同的肽。在一些實施方案中，在肽 混合物中最多有9種不同的肽。在其他實施方案中，最多有10、12、14或16種不同的肽。在肽 混合物包含至少一種另外的肽而所述至少一種另外的肽包含包括RAS蛋白的位置12的區域 的實施方案中，肽混合物包含1、2、3、4、5或6種肽，所述肽包含包括1^3肽的位置12的至少8 個氨基酸的區域并且在對應于RAS蛋白的位置12的位置處具有點突變。在肽混合物包含至 少一種另外的肽而所述至少一種另外的肽包含包括RAS蛋白的位置61的至少8個氨基酸的 區域的實施方案中，肽混合物包含1、2、3、4、5或6種肽，所述肽包含包括RAS蛋白的位置61的 區域并且在對應于RAS蛋白的位置61的氨基酸處具有點突變，其中所述肽中的每種具有不 同的點突變。
[0189] 在一些實施方案中，包含包括RAS肽的位置13的至少8個氨基酸的區域的肽包含 RAS蛋白的位置1至30。在備選的實施方案中，包含包括RAS蛋白的位置13的至少8個氨基酸 的區域的肽包含RAS蛋白的位置5至21。在另外的實施方案中，對應于RAS蛋白的位置13的氨 基酸在所述肽的C末端。在另外的實施方案中，對應于RAS蛋白的位置13的氨基酸在所述肽 的N末端。通常，具有包括RAS蛋白的位置13的至少8個氨基酸的區域可以由包括位置13在內 的RAS蛋白的任意8個位置組成。例如，具有包括位置13的至少8個氨基酸的區域可以由RAS 蛋白的位置6至位置13、位置7至位置14、位置8至位置15、位置9至位置16、位置10至位置17、 位置11至位置18、位置12至位置19或位置13至位置20的氨基酸組成。
[0190] 在一些實施方案中，包含包括RAS肽的位置12的至少8個氨基酸的區域的肽包含 RAS蛋白的位置1至30。在其他實施方案中，包含包括RAS蛋白的位置12的至少8個氨基酸的 區域的肽包含RAS蛋白的位置5至21。在備選的實施方案中，對應于RAS蛋白的位置12的氨基 酸在所述肽的C末端。在另外的實施方案中，對應于RAS蛋白的位置12的氨基酸在所述肽的N 末端。通常，具有包括RAS蛋白的位置12的至少8個氨基酸的區域可以由包括位置12在內的 RAS蛋白的任意8個位置組成。例如，具有包括位置12的至少8個氨基酸的區域可以由RAS蛋 白的位置5至位置12、位置6至位置13、位置7至位置14、位置8至位置15、位置9至位置16、位 置10至位置17、位置11至位置18或位置12至位置19的氨基酸組成。
[0191] 在一些實施方案中，包含包括RAS肽的位置61的至少8個氨基酸的區域的肽包含 RAS蛋白的位置47至76。在其他實施方案中，包含包括RAS肽的位置61的至少8個氨基酸的區 域的肽包含RAS蛋白的位置53至69。在備選的實施方案中，對應于RAS蛋白的位置61的氨基 酸在所述肽的C末端。在另外的實施方案中，對應于RAS蛋白的位置61的氨基酸在所述肽的N 末端。通常，具有包括RAS蛋白的位置61的至少8個氨基酸的區域可以由包括位置13在內的 RAS蛋白的任意8個位置組成。例如，具有包括位置61的至少8個氨基酸的區域可以由RAS蛋 白的位置54至位置61、位置55至位置62、位置56至位置63、位置57至位置64、位置58至位置 65、位置59至位置66、位置60至位置67或位置61至位置68的氨基酸組成。
[0192] 本發明的肽混合物可以以相等的或不同的比例包含所述肽。在一些實施方案中， 第一肽和第二肽以等比例存在于混合物中，即各種肽包含肽混合物的肽組分的50%。在其 他實施方案中，與第二肽相比，在肽混合物中存在更大比例的第一肽。例如，第一肽可以包 含肽混合物的肽組分的至少55%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。在備選的實 施方案中，與第一肽相比，在肽混合物中存在更大比例的第二肽。例如，第二肽可以包含肽 混合物的肽組分的至少55%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。在包含至少一種 另外的肽的實施方案中，肽以等比例存在于肽混合物的肽組分中。在其他實施方案中，第一 肽、第二肽和至少一種另外的肽以彼此不同的比例存在。例如，第一肽、第二肽和至少一種 另外的肽中的每種可以獨立地包含肽混合物的肽組分的至少1 %、至少5%、至少10%、至少 20%至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。
[0193] 備選的實施方案包括包含至少五種RAS蛋白的肽的肽混合物，其中五種肽中的每 種包含包括RAS蛋白的位置13的至少8個氨基酸的區域。所述至少五種肽中的每種獨立地在 除了包括位置13的區域以外的位置處與RAS蛋白具有至少20%、至少25%、至少30%、至少 40%、至少50 %、至少60 %、至少66 %、至少75 %、至少85 %、至少95 %、至少99 %或100 %序 列同一性，和/或獨立地在除了包括位置13的區域以外的位置處與SEQ ID N0:1-6、19、20、 27和28之一具有至少20%、至少25 %、至少30%、至少40 %、至少50 %、至少60%、至少66 %、 至少75%、至少85%、至少95%、至少99%或100%序列同一1性。所述至少五種肽中的每種在 對應于RAS蛋白的位置13的氨基酸處具有點突變，所述點突變獨立地選自G13A、G13C、G13D、 G13R、G13S或G13V突變，并且每種肽的點突變不同于其他肽的點突變。
[0194] 在另一個實施方案中，適于引起免疫應答的肽混合物由六種RAS蛋白的肽組成，其 中每種肽包含包括RAS蛋白的位置12的至少8個氨基酸的區域。所述肽中的每種獨立地在除 了包括位置12的區域以外的位置處與RAS蛋白具有至少20%、至少25%、至少30%、至少 40%、至少50 %、至少60 %、至少66 %、至少75 %、至少85 %、至少95 %、至少99 %或100 %序 列同一性，和/或獨立地在除了包括位置12的區域以外的位置處與SEQ ID NO:7-12和21-26 之一具有至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少66%、至少 75 %、至少85 %、至少95 %、至少99 %或100 %序列同一性。所述肽中的每種在對應于RAS蛋 白的位置12的氨基酸處具有點突變，所述點突變選自612六、612(：、6120、6121?、6123或612￥突 變，并且每種肽的點突變不同于其他肽的點突變。
[0195] 在另一個實施方案中，適于引起免疫應答的肽混合物由RAS蛋白的第一肽、第二 肽、第三肽和第四肽組成，其中第一肽、第二肽和第三肽中的每種包含包括RAS蛋白的位置 12的至少8個氨基酸的區域，并且RAS蛋白的第四肽包含包括RAS蛋白的位置13的至少8個氨 基酸的區域。第一肽、第二肽、第三肽和第四肽中的每種獨立地分別在除了包括位置12或13 的區域以外的位置處與RAS蛋白具有至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、 至少60 %、至少66 %、至少75 %、至少85 %、至少95 %、至少99 %或100 %序列同一性，和/或 獨立地分別在除了包括位置12或13的區域以外的位置處分別與SEQIDN0:7-12、21-26、l-6、19、20、27和28之一具有至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、 至少66 %、至少75 %、至少85 %、至少95 %、至少99 %或100 %序列同一性。第一肽、第二肽、 第三肽和第四肽中的每種分別在對應于RAS蛋白的位置12或13的氨基酸處具有點突變。在 一些實施方案中，第一肽是具有G12A突變的肽，第二肽是具有G12R突變的肽，第三肽是具有 G12S突變的肽，并且第四肽是具有G13C突變的肽。
[0196] 在本發明的另一方面，提供適于引起免疫應答的肽，所述肽對應于RAS蛋白的片 段。所述肽包含包括RAS蛋白的位置13的至少8個氨基酸的區域，并且所述至少8個氨基酸的 區域具有不在位置13處的與RAS蛋白的相應區域相同的至少6個氨基酸殘基。所述肽在對應 于RAS蛋白的位置13的氨基酸處具有點突變，所述點突變是G13C或G13R突變中的一種。在一 些實施方案中，所述肽具有G13C突變。在其他實施方案中，所述肽具有G13R突變。用這樣的 肽刺激T細胞引起增殖反應（圖8)，表明根據本發明的該方面的肽能夠引起免疫應答。在一 些實施方案中，對應于RAS蛋白的片段并且包含包括RAS蛋白的位置13的至少8個氨基酸的 區域的肽包含不超過30個氨基酸殘基。例如，在某些實施方案中，所述肽包含不超過28、26、 24、22、20、18、17、16、14、12、10或8個氨基酸。在一些實施方案中，所述肽包含不超過17個氨 基酸。
[0197] 在另外的實施方案中，提供用作疫苗或藥物的肽。所述肽對應于RAS蛋白的片段并 且包含至少包括RAS蛋白的位置13的氨基酸的區域。所述至少8個氨基酸的區域具有不在位 置13處的與RAS蛋白的相應區域相同的至少6個氨基酸殘基。所述用作疫苗或藥物的肽在對 應于RAS蛋白的位置13的氨基酸處具有點突變，所述點突變是G13C或G13R突變之一。
[0198] 本發明的肽是對應于由MHC II分子展示在細胞表面上的RAS蛋白片段的肽。因此， 本發明的肽是這樣的肽，其對應于由RAS蛋白的胞內蛋白水解分解產生的蛋白片段，所述片 段之后可以被展示在HLA分子上，并且對于所述片段，個體通常在其T細胞庫中具有反應性T 細胞。如圖6-8中所示，根據本發明的實施方案的肽混合物和肽引起T細胞增殖反應，同時用 本發明的實施方案的肽混合物接種小鼠引起脾細胞增殖(圖9)。
[0199 ]在本發明的另一方面，提供T細胞混合物或T細胞制劑，所述T細胞混合物包含對根 據以上公開的肽混合物之一中的各種肽具有特異性的T細胞，所述T細胞制劑包含對遞呈在 MHC分子上時的根據以上公開的肽具有特異性的T細胞。所述T細胞混合物或制劑可以通過 用包含RAS蛋白的第一肽和第二肽的肽混合物或RAS蛋白的肽刺激至少一種反應性T細胞來 制備。例如，在一個實施方案中，T細胞混合物包含多種T細胞，其中第一T細胞和第二T細胞 分別對對應于RAS蛋白的片段的第一肽和第二肽具有特異性，其中每種肽包含包括RAS蛋白 的位置13的至少8個氨基酸的區域，其中第一 T細胞和第二T細胞中的每種對在對應于所述 位置13的肽的氨基酸處的點突變具有特異性，并且第一 T細胞對其具有特異性的點突變不 同于第二T細胞對其具有特異性的點突變。在另一個實施方案中，例如，T細胞制劑包含多種 對對應于RAS蛋白的片段的肽具有特異性的T細胞，其中所述肽包含包括RAS蛋白的位置13 的至少8個氨基酸的區域，其中每種T細胞對對應于所述位置13的肽的氨基酸處的點突變具 有特異性。
[0200]本發明的肽混合物、肽、T細胞混合物和T細胞制劑被用于治療和/或預防癌癥，并 且特別是與RAS癌基因中的突變相關的癌癥。癌癥可以包括腎上腺癌、自主神經節癌、膽管 癌、骨癌、乳腺癌、中樞神經系統癌、宮頸癌、結直腸癌、子宮內膜癌、造血器官 (haematopoietic)癌、淋巴癌、腎癌、大腸癌、肝癌、肺癌、食管癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺 癌、唾液腺癌、皮膚癌、小腸癌、胃癌、睪丸癌、胸腺癌、甲狀腺癌、上呼吸消化道癌和尿道癌 和惡性黑素瘤，并且本發明的肽混合物、肽、T細胞混合物和T細胞制劑可以用于預防和/或 治療這些類型的癌癥中的超過一種。在一些實施方案中，本發明的肽混合物(其中第一肽和 第二肽之一具有G13C突變）、本發明的肽(其中所述肽具有G13C突變）、T細胞混合物(其中第 一 T細胞和第二T細胞之一對具有G13C突變的肽具有特異性)或T細胞制劑(其中T細胞對具 有G13C突變的肽具有特異性)被用于預防和/或治療癌癥。在這樣的實施方案中，優選的是， 所述癌癥是結直腸癌、肺癌和胰腺癌中的一種或多種。在另一個實施方案中，本發明的肽混 合物(其中第一肽和第二肽之一具有G13R突變）、本發明的肽(其中所述肽具有G13R突變）、Τ 細胞混合物(其中第一 Τ細胞或第二Τ細胞之一對具有G13R突變的肽具有特異性)或Τ細胞制 劑(其中Τ細胞對具有G13R突變的肽具有特異性)可以用于預防和/或治療癌癥。在這樣的實 施方案中，優選的是，所述癌癥是惡性黑素瘤。特別地，已經發現，被稱為TG02的肽混合物覆 蓋99%的與RAS蛋白中的突變相關的癌癥，以致其具有廣泛用途，而被稱為TG03的肽混合物 覆蓋14%的與RAS蛋白中的突變相關的癌癥。因此，在一個實施方案中，TG02可以被用于預 防和/或治療癌癥。在優選的實施方案中，所述癌癥是肺癌、結直腸癌和胰腺癌中的一種或 多種。在另一個實施方案中，TG03可以被用于預防或治療癌癥。在優選的實施方案中，所述 癌癥是惡性黑素瘤。
[0201 ]還提供包含上述肽混合物、肽、Τ細胞混合物或Τ細胞制劑的藥物組合物。此種藥物 組合物還可以包含至少一種藥用載體、稀釋劑和/或賦形劑。在一些實施方案中，藥物組合 物還包含一種或多種另外的活性成分和/或佐劑。在某些實施方案中，藥物組合物還可以包 含一種或多種對相同的疾病適應征具有療效的成分。在一個實施方案中，本發明的藥物組 合物還可以包含一種或多種另外的化療劑、一種或多種抗體、一種或多種小分子和/或一種 或多種免疫刺激劑(例如，細胞因子）。在一些實施方案中，所述肽混合物或藥物組合物可以 與其他形式的免疫療法聯合使用。如圖9中所示，利用根據本發明的實施方案的肽混合物進 行接種引起脾細胞增殖，表明本發明的肽能夠引起免疫應答。
[0202]已經發現某些類型的癌癥與RAS蛋白的某些突變相關，并且更新的發現是G13C和 G13R突變區別性地與癌癥相關，以致G13C突變在一些類型的癌癥中更常見而G13R突變在另 一些類型的癌癥中更常見。因此，有可能使肽混合物、肽、Τ細胞混合物和Τ細胞制劑適于靶 向特定類型的癌癥。因此，本發明提供這樣的益處，即疫苗和治療對患者的癌癥類型更特 異。這意味著僅需要較少的肽和Τ細胞就可以保證疫苗和/或治療是有效的，這提供了這樣 的益處，即在疫苗和/或治療中包含較少的無關的肽和/或Τ細胞。這又減少了免疫顯性的問 題，因為可以在內部彼此競爭的肽較少。此外，所需的肽和/或Τ細胞的數目減少意味著更便 宜地生產藥物和治療。
[0203]本發明的肽混合物、肽或藥物組合物可以通過本領域技術人員已知的任何合適的 遞送技術施用于受試者。例如，與其他技術相比，可以通過注射以溶液的形式、以脂質體的 形式或以干燥的形式(例如，以包衣顆粒的形式等)將肽混合物、肽或藥物組合物施用于受 試者。在一些實施方案中，可以以，例如，lyg至lg的每種肽，每三天一次、每周一次、每月一 次、每三個月一次、每四個月一次或每六個月一次的量施用所述肽混合物、肽或藥物組合 物。
[0204] 本發明的T細胞混合物和T細胞制劑可以通過靜脈內注射和/或輸注施用，并且可 以以例如1〇6至1〇 12個對肽混合物的肽或肽具有特異性的各種T細胞，每月一次、每兩個月一 次、每三個月一次、每六個月一次或每年一次的量施用。優選地，所述劑量每月一次地施用2 至5個月，并且隨后以較低的頻率施用。
[0205] 如上所提及的，不同類型的癌癥與RAS蛋白的不同突變相關的發現意味著疫苗和 治療可以靶向具體癌癥。因此，在本發明的另一方面，提供用于包括癌癥的診斷和合適治療 的選擇的方法的肽混合物、肽、T細胞混合物和/或T細胞制劑。所述方法包括以下步驟:a)鑒 定存在于取自患者的樣品中的RAS蛋白點突變，和b)選擇包含肽的如上所述的肽混合物，選 擇如上所述的肽，選擇包含對肽具有特異性的T細胞的如上所述的T細胞混合物和/或選擇 包含對肽具有特異性的T細胞的如上所述的T細胞制劑，所述肽包含對應于樣品中鑒定的至 少一種RAS蛋白點突變的點突變。例如，如果發現取自受試者的樣品含有具有G13C突變的 RAS蛋白，則將選擇包含肽的肽混合物、肽和/或包含對肽具有特異性的T細胞的T細胞混合 物和/或制劑(所述肽包含G13C突變）。在樣品含有例如包含G13C突變和G12R突變的RAS蛋白 的情況中，選擇包含含有G13C突變的肽和含有G12R突變的肽的肽混合物和/或包含對包含 G13C突變的肽具有特異性的T細胞和對包含G12R突變的肽具有特異性的T細胞的T細胞混合 物。所述方法還可以包括將包含所選的肽混合物、肽和/或T細胞混合物和/或制劑的藥物組 合物施用于患者的步驟。
[0206] 在本發明的另外的方面，提供包括如本文所述的肽混合物、肽、T細胞混合物和/或 T細胞制劑的試劑盒。所述肽混合物、肽、T細胞混合物和/或T細胞制劑可以原樣地存在于試 劑盒中，或所述肽混合物、肽、T細胞混合物和/或T細胞制劑可以作為藥物制劑存在于試劑 盒中。在一些實施方案中，肽混合物、肽、T細胞混合物和/或T細胞制劑可以被包裝在例如小 瓶、瓶、燒瓶中，所述小瓶、瓶、燒瓶可以被進一步包裝，例如，被包裝在箱子、封套或袋子中。 在一些實施方案中，所述試劑盒包含肽混合物和/或T細胞混合物，其中所述肽和/或T細胞 被提供在分開的容器中，以使得由使用者來混合肽和/或T細胞。
[0207] ^
[0208] 表1. SEQ ID從)：1-6的位置13突變的1^3肽 [0210]表2. SEQ ID N0:7-12的位置 12突變的RAS肽
[0212] 表3. SEQ ID從)：13-18的位置61突變的1^3肽
[0214] 表4. TG02中包含的肽
[0216] 表5. TG03中包含的肽
實施例
[0218] 實施例1
[0219] 在該實施例中，自4名正常人供體收集暗黃覆蓋層(buffy coat)(暗黃1、暗黃2、暗 黃3和暗黃4)并在體外培養。利用單個RAS肽或RAS肽的混合物體外刺激PBMC，并進行T細胞 增殖測定。結果顯示在圖6-8中。
[0220] 越
[0221] 設備/試劑
[0222] -Hettich Rotina 420(半徑210)或同等物
[0223] -K0JAIR Silverline Blue Series層流罩或同等物
[0224] -C〇2培養器，Forma Scientific Model 3111 或同等物
[0225] -水浴 37°C
[0226] -K0VA Glasstic載玻片（目錄號87144E，Hycor Biomedical Inc，Garden Grove， USA)
[0227] -TopCount，微板閃爍計數器（Packard Instrument Company，Meriden，USA)
[0228] -Cell Harvester Filtermate 196Harvester，（Packard Instrument Company， Meriden?USA)
[0229] -Unifilter GF/C(目錄號6_005174，Nerliens Meszansky，0slo，Norway)或同等 物
[0230] -Microscint-0閃爍液（scinti 11ation liquid)(目錄號6013611，Nerliens Meszansky，0s lo，Norway)或同等物
[0231 ] -Topseal_A(目錄號6005185，Nerliens Meszansky，0slo，Norway)或同等物
[0232] -3H-胸苷（目錄號ART178_D，Nerliens Meszansky，0slo，Norway)或同等物
[0233] -CellGro DC培養基（目錄號0020801_0500，CellGenix GmbH，Freiburg，Germany) 或同等物
[0234] -RPMI_1640(目錄號：E15_840)PAA Labs，Linz，Austria)或同等物
[0235] -二甲亞諷（DMS0)(目錄號：D5879-500ML，Sigma-Aldrich Norway AS，Oslo， Norway)或同等物
[0236] -易咳凈(Mucomyst)(目錄號019249，Meda AS，Asker，Norway)或同等物
[0237] -重組人白介素-2(IL-2, Proleukinl!)，（Chiron Therapeutics，Emeryville，USA) 或同等物
[0238] -4-(2-羥乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES)緩沖液1M(目錄號Sll-001，Fisher Scientific AS，0slo，Norway)或同等物
[0239] -IL_7(目錄號207-IL_025，R&D Systems Europe Ltd，Abingdon，UK)或同等物
[0240] -Gentamucin 40mg/ml(目錄號Sanofi Aventis Norge AS，Lysaker，Norway)或同 等物
[0241 ]-人血清白蛋白20%，（目錄號SW2G0013，Baxter AS，0slo，Norway)或同等物
[0242] -24孔組織培養板（目錄號734-1605，VWR International AS，0slo，Norway)或同 等物
[0243] -96孔圓底微板（目錄號734_1797，VWR International AS，0slo，Norway)或同等 物
[0244] -葡萄球菌腸毒素 C型（SEC_3)(目錄號CT333，Toxin Technology Inc，Sarasota， USA) 〇
[0245] 用于培養的完全CellGro DC培養基:
[0246] 將以下各項添加至500ml的CellGro DC培養基中達終濃度：
[0247] 慶大霉素50μg/ml (添加630yL的40mg/ml儲液至500mL培養基）
[0248] 易咳凈1.6mg/ml (添加4mL的200mg/ml儲液至500mL培養基）
[0249] HEPES緩沖液0.01M(添加5ml的1M儲液至500mL的培養基）
[0250] 絲星
[0251] a.解凍冷凍的PBMC
[0252] 必須在室溫進行該過程直至第5點。所有對細胞的開放性操作在直立式層流罩中 進行。
[0253] 1.快速轉移小瓶至37 °C水浴，各小瓶具有來自暗黃覆蓋層(暗黃1、暗黃2、暗黃3和 暗黃4)的冷凍的PBMC。
[0254] 2.以有規律的間隔（約2-3分鐘)手動晃動小瓶并且在尚有些許冰存在時將其從水 浴中移出。
[0255] 3.當所有冰融化后，將lml的CellGro DC培養基逐滴轉移至細胞懸液中。
[0256] 4.將細胞懸液轉移至盛有20ml的CellGro DC培養基的50ml管中。
[0257] 5.將細胞以500G在室溫離心5min。
[0258] 6.將細胞重懸在5ml CellGro DC培養基中。
[0259] 7.使用Biirker小室或K0VA Galsstic載玻片對存活的細胞的數目進行計數并在完 全CellGro DC培養基（見配方）中將細胞濃度調整至2xl06細胞/ml。總細胞數：暗黃l-45x 1〇6,暗黃 2-27·5χ 106,暗黃 3-40·5χ 106,暗黃 4-40·5χ 106 個細胞。
[0260] b.大體積培養以增加 RAS肽反應性T細胞的數目
[0261] 1.將lml解凍的PBMC(2xl06個細胞/ml，在DC培養基中）轉移至24孔板的各個孔中。
[0262] 表6.再刺激:利用肽混合物刺激的孔的數目.
[0265] 2.添加20μ1的13C和13R肽中的一種或20μ1 13R和60μ1 TG02-混合物至孔中，終濃 度為每種肽?〇μΜ。
[0266] 3.在加濕的培養器中以37°C/5%C02培養細胞達3天
[0267] 4.第3天:添加終濃度為20iU/ml的重組人白介素-2(rIL-2)(即取1000iU/ml的儲 液50μ1)和終濃度為5ng/ml的重組人IL-7 (即取500μg/ml的儲液?ομL)至細胞培養物并以37 °C /5 % C02繼續溫育。如果細胞生長良好，則此步驟是任選的。
[0268] 5.第4-6天:在顯微鏡下有規律地檢查細胞并在需要時分細胞(從各孔中取出500μ 1并用500μ1補充有40iU/ml IL-2和IL-7的新鮮CellGro DC培養基代替）。
[0269] 6.第7-14天:每天檢查細胞并將細胞生長緩慢的孔混合在一起。
[0270] (：.1)3天1'細胞增殖測定
[0271 ] 1.將來自步驟b.的大體積培養的T細胞收集、洗滌并計數；
[0272] 表7: T細胞總數
[0274] 2.將5x 104個來自大體積培養的T細胞轉移到圓底96孔板的每個孔中。
[0275] 3.將1小瓶在CellGro DC培養基中的的自體PBMC樣品解凍。照射PBMC(30Gy)，計數 并添加5x 104個細胞至各孔并用DC培養基調節至200μ1/孔的總體積。
[0276] 4.根據平板布置，一式三份地制備以下樣品：
[0277] -陰性對照：
[0278] 僅Τ細胞
[0279] 來自各個時間點的Τ細胞+照射的PBMC
[0280] -陽性對照：
[0281] 來自各個時間點的Τ細胞+照射的PBMC+lμg/ml SEC-3.
[0282] -試驗樣品：
[0283] 來自各個時間點的T細胞+照射的PBMC(10yM的各種肽）：
[0284] I)用于用13C+13R: 13C+13R混合物或單一 G13C肽刺激的大體積培養物
[0285] II)用于用TG02+13R:TG02+13R、13C+13R混合物或單一 G13C肽刺激的大體積培養 物
[0286] 將細胞在37 °C /5 % C02溫育48小時。
[0287] 5.添加 20yL 的 3H-胸苷（3.7x 104Bq)。
[0288] 6.在 37°C/5%C02 溫育 17 小時。
[0289] 7 ·使用Filtermate 196Harvester收獲細胞至Unifilters并在45 °C干燥濾器直至 完全干燥(通常這在1.5小時后實現，但是這之后在45°C放置的小時數不重要，因此平板可 以在60小時后計數）。
[0290] 8.用粘性覆蓋物（與Unifilters-起提供的）覆蓋Unifilters的底部并向各孔添 加25μ1微閃爍液。用TopSeal覆蓋平板并將濾器放置在TopCount Packard微板閃爍β計數器 中。進入測定向導程序。選擇方案/程序3Η胸苷，一式三份。進入報告定義和ASCII文件輸出。 在目錄下，選擇數據文件夾(每個使用者應當具有單獨的文件夾）。為要保存的實驗文件選 擇名稱。疊式存儲器開啟或關閉（如果超過一個平板，使用疊式存儲器）。開始測定程序。 [0291 ] ii)大體積培養物的第二次刺激
[0292] 將剩余的細胞（1-2χ106個T細胞/孔）用自體PBMC(1百萬個/孔)和肽混合物再刺激 一次(如步驟b.中所述）。
[0293] 表8:刺激-用肽混合物刺激的孔數
[0295] 1.將細胞在加濕的培養器中在37°C/5%C02培養3天(如步驟b.中所述）。
[0296] 2.第17天:添加終濃度為40iU/ml的重組人白介素-2和終濃度為5ng/ml的重組人 IL-7至細胞培養物并且在37 °C/5 %⑶:^繼續培育。在顯微鏡下規律地檢查細胞并且在需要 時分細胞。
[0297] 3.第19-21天:從各孔中取出500μ1并且用500μ1補充有40iU/ml IL-2和IL-7的新 鮮CellGro DC培養基代替。
[0298] 4.第22-27天:每天有規律地檢查細胞，并且將T細胞生長緩慢的孔混合在一起(如 步驟b.中）。
[0299] ^"天找田胞增殖測定
[0300] 1.將大體積培養物中的T細胞收集、洗滌和計數。
[0301] 表9:細胞總數
[0303] 2.將來自大體積培養物的5x 104個T細胞轉移到圓底96孔板的每個孔中。
[0304] 3.將1小瓶在CellGro DC培養基中的自體PBMC樣品解凍。照射PBMC(30Gy)，計數并 添加5x 104個細胞至各孔并用DC培養基調節至200μ1/孔的總體積(如步驟c. i)中所述）。 [0305] ii)第27-42天:大體積培養物的第三次刺激
[0306]將剩余的細胞（1-2百萬個T細胞/孔）用自體PBM(1百萬個/孔)和肽混合物再刺激 一次(如步驟b.中所述）
[0307]表10:刺激-刺激的孔的數目
[0309] e) 3天T細胞增殖測定
[0310] 1.將大體積培養物中的T細胞收集、洗滌并計數。
[0311] 表11:細胞總數
[0313] 2.將來自大體積培養物的5x 104個T細胞轉移到圓底96孔板的每個孔中。
[0314] 3.將1小瓶的在CellGro DC培養基中的自體PBMC樣品解凍。照射PBMC(30Gy)，計數 并將5x 104個細胞添加至各孔中并用DC培養基調節至200μ1/孔的總體積(如步驟c.i)中所 述)。
[0315]
[0316] 大體積培養物的三輪刺激后的利用肽混合物的T細胞增殖測定的結果分別顯示在 表12-14和圖6-8中。表12-14顯示每次重復的每分鐘計數(CPM)，以及每名供體的平均CPM。
[0317] 表12:用由13C和13R肽組成的肽混合物刺激后的每分鐘計數(CPM)。在大體積培養 物的三輪體外刺激期間，用TG02+13R肽混合物來刺激供體#3，而用13C+13R肽混合物來刺激 供體#4。
[0319]表 13:用由 13(：、130、12六、12(：、120、121?、125、12￥和131?(即了602+131〇肽組成的肽混 合物進行刺激后的每分鐘計數(CPM)。在大體積培養物的三輪體外刺激期間，用TG02+13R肽 混合物來刺激供體#3。
[0322]表14:用13C肽刺激后的每分鐘計數(CPM)。在大體積培養物的三輪體外刺激期間， 用TG02+13R肽混合物來刺激供體#3。
[0324] 確認了陽性對照的結果但是由于縮放比例（scaling)的原因其沒有被包括在圖6-8中。如可見的，肽混合物和單一肽二者都可以引起T細胞增殖，表明所述肽和肽混合物能夠 在人中引起免疫應答。
[0325] 實施例2
[0326]在該實施例中，用TG02在皮下重復接種小鼠，以便分析免疫應答。在接種后，收獲 脾細胞，并測量脾細胞的增殖性反應。結果顯示在圖9中。
[0327] 越
[0328] 試驗項表征 [0329]名稱：TG02
[0330] 產品：TG02 由等量（重量）的 8種不同的肽（12A、12C、12D、12R、12S、12V、13C、13DHi 成
[0331] 批次號：12A:批號 1034804; 12C:批號 1034803;
[0332] 12D:批號 1034801 ;12R:批號 1034802;
[0333] 12S:批號 1034805; 12V:批號 1034800;
[0334] 13C:批號 1050468; 13D:批號 1034806
[0335] 治療適應證:癌癥
[0336] 物理狀態:粉末 [0337]顏色：白色
[0338] 純度:每個小瓶凈80mg肽(每種肽凈10mg)
[0339] 存儲條件：-15 °C--20 °C并且避光
[0340] 有效期限：31.12.2014
[0341]安全預防:常規衛生程序足以保證個人健康和安全。
[0342] 載體1表征
[0343] 名稱：ViscoGel
[0344] 批次號：VG14056
[0345] 治療適應證:癌癥
[0346] 物理狀態:凝膠顆粒 [0347]顏色:無色
[0348] 水含量:99 %
[0349] 存儲條件：2-8 Γ
[0350] 有效期限：01.06.2015
[0351] 安全預防:常規衛生程序足以保證個人健康和安全。
[0352] 載體2表征 ] 該研究中使用的載體2將是注射用水(aqua ad injectionem)。以下列出由供應商 提供的說明：
[0354] 名稱:注射用水
[0355] 物理狀態:液體
[0356] 存儲條件:室溫
[0357] 安全預防:常規衛生程序足以保證個人健康和安全。
[0358] 試驗項的制備
[0359] 將5ml注射用水添加至一小瓶TG02(80mg)并且輕柔地轉動（避免泡沫形成）從而獲 得16mg TG02/mL的均質儲液。
[0360] 對于第1組的動物(見表12)，用注射器抽取lmL TG02儲液并將其與lmL注射用水混 合從而獲得8mg/mL的終濃度。
[0361] 對于第2組和第3組的動物（參見表12)，用注射器抽取lml TG02儲液并將其與lmL Vi scoGe 1?混合從而獲得8mg/mL的終濃度。
[0362] 認為試驗項制劑在2-8 Γ穩定達6h。
[0363] 試驗體系
[0364] 物種/品系：健康的BALB/c小鼠（完全屏障)BALB/cAnNCrl
[0365] 來源：Charles River，97633Sulzfeld，德國
[0366] 性別:雌性
[0367] 治療期開始時的年齡:約6-8周齡
[0368] 動物數:30(每組10只動物）
[0369] 動物來源于受控的保持完全屏障的繁育系統（SPF)。根據德國關于動物福利的法 案的第9.2條，第7項(Art.9.2，No.7of the German Act on Animal Welfare)，所述動物的 繁育是出于實驗目的。
[0370] 圈養和喂飼條件
[0371] -有空調的房間中的完全屏障。
[0372] -溫度：22±3Γ。
[0373] -相對濕度：55 ±10 %。
[0374] -人造光，順序為12小時亮，12小時暗。
[0375] -換氣：10x/小時。
[0376] -自由接近用于大鼠和小鼠的Altromin 1324維持飲食。
[0377] -自由接近自來水，硫酸化至約2.8的pH(飲用水，城市殘余物控制、規律間隔的微 生物控制）。
[0378] -將動物以每籠5只動物成組地保持在Altromin鋸纖維墊上的IVC籠、II L型、聚砜 籠中。
[0379] -食物、水和墊子的證書在BSL BI0SERVICE處提交。
[0380]-在實驗室條件下的足夠的適應期(至少5天）。
[0381]動物的分配和識別
[0382]將在給藥前顯示病理征候的動物從研究中排除。提供來自同一遞送的補充動物作 為交換。
[0383]用耳標記給每只動物做標記以用于個體識別。
[0384] 實驗過程
[0385] 用3組進行研究，每組包含10只雌性BALB/c小鼠。研究的開始分兩天進行，在這兩 天每組中的5只動物被處理。因此，將所述組分成部分I和部分II。在不同時間點皮下處理動 物(表⑵。
[0386] 在給藥期間，每天準確地觀察動物的毒性征候。在最后一次給藥后48小時將動物 安樂死，進行宏觀檢查并且準備脾以用于進一步的分析。
[0387] 劑量
[0388] 在所有組中，在重復的時間點（表15)通過頸背和肩之間的皮下注射來施用試驗 項。所有組的施用體積都為〇. lmL(0.80mg TG02)。
[0389] 表15:處理和動物識別
[0390]
[0391] 臨床觀察
[0392] 在整個24天的處理期期間觀察所有動物的臨床征候。
[0393] 每天進行至少一次總體臨床觀察，優選地在每天的同一時間，并且考慮用藥后的 預期效應的峰值期。記錄動物的健康狀況。
[0394] 對每只動物進行包括皮毛、眼睛和粘膜的變化的總體臨床觀察，優選在每天的同 一時間進行，并且考慮用藥后的預期效應的峰值期。同樣檢查呼吸系統、循環系統、自主和 中樞神經系統和軀體運動活性和行為模式。特別注意觀察過敏反應、癱瘓、震顫、抽搐、流 延、腹瀉、昏睡、睡眠和昏迷的征候。此外，注意注射位點。
[0395] 病理學-總體驗尸
[0396] 最后一次給藥后48小時（研究的第24天)通過斷頸將動物處死并且對其進行詳細 的總體尸檢，包括認真地檢查身體的外表面、所有孔口以及顱腔、胸腔和腹腔及其內含物。
[0397] 細胞培養和脾細胞刺激
[0398] 將所有動物的脾取出，轉移到細胞培養基(補充有10%FCS，100U/mL青霉素，100μ g/mL鏈霉素，2mM L-谷氨酰胺和50μΜβ-巰基乙醇的RPMI 1640培養基)并在冰上保存。無菌 地進行所有步驟并將細胞保持在冰上。
[0399] 使用細胞過濾器來生成脾細胞的單細胞懸液。在離心（350g，5min，5 ± 3°C )后，將 上清移除并將細胞沉淀重懸在ACK緩沖液中并在室溫溫育5min。添加10mL細胞培養基。將樣 品在試驗臺上放置5min以使細胞碎片沉淀。將細胞碎片上方的懸液轉移到另一個管中并離 心（35(^，511^11，5±3°(：)。將上清移除并將細胞沉淀重懸在1〇1^細胞培養基中。在給細胞計 數后，將0.2Mio細胞接種到96孔板中（180yL/孔；1，1*10 6個細胞/mL)。對于每個脾在每個板 上鋪板9個重復樣。
[0400] (1)1塊板用于在24小時后收集用于細胞因子測量的上清(結果未示）
[0401] (2)1塊板用于在48小時后收集用于細胞因子測量的上清(結果未顯示）。
[0402] (3)1塊板用于增殖測定
[0403] 進行以下刺激：
[0404] -3個重復樣:未刺激的（添加20yL細胞培養基）
[0405] -3個重復樣：用ΙΟμΜ TG02(8種肽，每種肽的終濃度為ΙΟμΜ，添加在20yL細胞培養 基中）刺激
[0406] -3個重復樣：用lyg/200yL ConA(伴刀豆球蛋白A)(將lyg ConA添加在20yL細胞培 養基中）刺激
[0407] 在37°C 和5%C02 孵育 24h(l)、48h(2)或5天(3)。
[0408] 將剩余的細胞離心（35(^，511^11，5±3°(：)，轉移至1.511^管中，再次離心（350 8， 5min，5 ± 3 °C)，將上清完全移除，并將細胞沉淀在$-70 °C冷凍。
[0409] (1)在24h后，將相應的板離心（350g，室溫)并收集150yL上清并將其在<-70°C冷 凍。
[0410] (2)在48h后，將相應的板離心（350g，室溫)并收集150yL上清并將其在彡-70°c冷 凍。
[0411]增殖測定
[0412] ⑶在5天后，將lyCi/孔3H-胸苷添加至樣品中，然后將其在37°C和5%C0 2孵育18h。 然后將平板在<-20°C冷凍。
[0413] 在室溫將平板解凍。在洗滌收集器后，使用收集器將樣品轉移至過濾板，之后使用 水進行5個洗滌步驟。將過濾板在室溫過夜干燥。將金屬箱粘至過濾板的底部并將20yL閃爍 液添加至孔中。室溫孵育1小時后，使用TopCount NXT測量樣品并計算刺激指數(SIhSIi 刺激的樣品的CPM/對照樣品的CPM。
[0414] 結果
[0415] 表16和圖9顯示脾細胞增殖測定的結果。表16顯示各重復樣的CPM以及每只小鼠的 平均CPM。如可見的，用TG02刺激的脾細胞顯示與未刺激的脾細胞相比增加的CPM，表明TG02 引起免疫應答。
[0416] 表16:用TG02刺激后的每分鐘計數(CPM).
【主權項】
1. 適于引起免疫應答的肽混合物，其包含第一肽和第二肽，所述第一肽和第二肽各自 對應于RAS蛋白的片段，其中： 所述第一肽和第二肽中的每種包含包括RAS蛋白的位置13的至少8個氨基酸的區域， 所述第一肽和第二肽的所述區域中的每個獨立地具有不在所述位置13處的與RAS蛋白 的相應區域相同的至少6個氨基酸殘基， 所述第一肽和所述第二肽中的每種在對應于所述位置13的氨基酸處具有點突變，并且 所述第一肽的點突變不同于所述第二肽的點突變。2. 根據權利要求1所述的肽混合物，其中所述點突變中的每個獨立地選自G13A、G13C、 G13D、G13R、G13S 或 G13V 突變。3. 根據權利要求1或2所述的肽混合物，其中所述肽混合物還包含： 至少一種另外的肽，所述至少一種另外的肽對應于RAS蛋白的片段，所述RAS蛋白的片 段包含至少8個氨基酸的區域，所述區域包括RAS蛋白的位置12,其中所述至少一種另外的 肽的所述區域中的每個獨立地具有不在所述位置12處的與RAS蛋白的相應區域相同的至少 6個氨基酸殘基，并且其中在對應于RAS蛋白的位置12的氨基酸處存在點突變;和/或 至少一種另外的肽，所述至少一種另外的肽對應于RAS蛋白的片段，所述RAS蛋白的片 段包含至少8個氨基酸的區域，所述區域包括RAS蛋白的位置61，其中所述至少一種另外的 肽的所述區域中的每個獨立地具有不在所述位置61處的與RAS蛋白的相應區域相同的至少 6個氨基酸殘基，并且其中在對應于RAS蛋白的位置61的氨基酸處存在點突變。4. 根據權利要求3所述的肽混合物，其中在對應于RAS蛋白的位置12的氨基酸處的點突 變選自612六、612(：、6120、6121?、6123或612￥突變和/或其中在對應于1^3蛋白的位置61的氨 基酸處的點突變選自〇6把、〇61!1、〇611(、〇611^、〇61?或〇611?突變。5. 根據權利要求3所述的肽混合物，其中所述第一肽是具有G13C突變的肽并且所述第 二肽是具有G13D突變的肽，并且其中所述至少一種另外的肽包括： 具有G12A突變的肽， 具有G12C突變的肽， 具有G12D突變的肽， 具有G12R突變的肽， 具有G12S突變的肽，和 具有G12V突變的肽。6. 根據權利要求3所述的肽混合物，其中所述第一肽是具有G13R突變的肽并且所述第 二肽是具有G13V突變的肽，并且其中所述至少一種另外的肽包括： 具有Q61H突變的肽， 具有Q61K突變的肽， 具有Q61L突變的肽，和 具有Q61R突變的肽。7. 適于引起免疫應答的肽混合物，其包含至少五種肽，所述五種肽各自對應于RAS蛋白 的片段，其中： 所述至少五種肽中的每種包含至少8個氨基酸的區域并且包括RAS蛋白的位置13， 所述至少五種肽的所述區域中的每個獨立地具有不在所述位置13處的與RAS蛋白的相 應區域相同的至少6個氨基酸殘基， 所述肽中的每種在對應于所述位置13的氨基酸處具有點突變，所述點突變選自G13A、 613(：、6130、6131?、6135或613￥突變，并且 每種肽的點突變不同于其他肽的點突變。8. 適于引起免疫應答的肽混合物，其由六種肽組成，所述六種肽各自對應于RAS蛋白的 片段，其中： 每種肽包含至少8個氨基酸的區域，所述區域包括RAS蛋白的位置12， 所述肽的所述區域中的每個獨立地具有不在所述位置12處的與RAS蛋白的相應區域相 同的至少6個氨基酸殘基， 所述肽中的每種在對應于所述位置12的氨基酸處具有點突變，所述點突變選自G12A、 612(：、6120、6121?、6125或612￥突變，并且 每種肽的點突變不同于其他肽的點突變。9. 適于引起免疫應答的肽混合物，其由六種肽組成，所述六種肽各自對應于RAS蛋白的 片段，其中： 每種肽包含至少8個氨基酸的區域，所述區域包括RAS蛋白的位置61， 所述肽的所述區域中的每個獨立地具有不在所述位置61處的與RAS蛋白的相應區域相 同的至少6個氨基酸殘基， 所述肽中的每種在對應于所述位置61的氨基酸處具有點突變，所述點突變選自Q61E、 〇61!1、〇611(、〇611^、〇61?或〇611?突變，并且 每種肽的點突變不同于其他肽的點突變。10. 適于引起免疫應答的肽混合物，其由第一肽、第二肽、第三肽和第四肽組成，所述第 一肽、第二肽、第三肽和第四肽各自對應于RAS蛋白的片段，其中： 所述第一肽、第二肽和第三肽中的每種包含至少8個氨基酸的區域，所述區域包括RAS 蛋白的位置12， 所述第四肽包含包括RAS蛋白的位置13的至少8個氨基酸的區域，所述第一肽、第二肽、 第三肽和第四肽的所述區域中的每個分別獨立地具有不在所述位置12或13處的與RAS蛋白 的相應區域相同的至少6個氨基酸殘基， 所述第一肽、第二肽、第三肽和第四肽中的每種在對應于所述位置12或13的氨基酸處 分別具有點突變，并且 所述第一肽是具有G12A突變的肽， 所述第二肽是具有G12R突變的肽， 所述第三肽是具有G12S突變的肽，并且 所述第四肽是具有G13C突變的肽。11. 用作疫苗或藥物并且對應于RAS蛋白的片段的肽，其中： 所述肽包含包括RAS蛋白的位置13的至少8個氨基酸的區域， 所述區域具有不在所述位置13處的與RAS蛋白的相應區域相同的至少6個氨基酸殘基， 并且 所述肽在對應于所述位置13的氨基酸處具有G13C或G13R點突變。12. 適于引起免疫應答并且對應于RAS蛋白的片段的肽，其中： 所述肽包含包括RAS蛋白的位置13的至少8個氨基酸的區域， 所述區域具有不在所述位置13處的與RAS蛋白的相應區域相同的至少6個氨基酸殘基， 所述肽包含不超過30個氨基酸殘基，并且 所述肽在對應于所述位置13的氨基酸處具有G13C或G13R點突變。 13. T細胞混合物，所述T細胞混合物包含對遞呈在MHC分子上時的根據權利要求1至10 中任一項所述的肽混合物之一中的各種肽具有特異性的T細胞，或T細胞制劑，所述T細胞制 劑包含對遞呈在MHC分子上時的根據權利要求11使用的肽之一或根據權利要求12所述的肽 之一具有特異性的T細胞。14. 藥物組合物，其包含權利要求1至10中任一項的肽混合物，根據權利要求11所使用 的肽，根據權利要求12所述的肽或權利要求13的T細胞混合物或T細胞制劑和藥用載體、稀 釋劑和/或賦形劑。15. 根據權利要求1至10中任一項所述的肽混合物，根據權利要求11所使用的肽，根據 權利要求12所述的肽，根據權利要求13所述的T細胞混合物或T細胞制劑或根據權利要求19 所述的藥物組合物，其用于預防和/或治療癌癥。16. 根據權利要求5所述的肽混合物或根據引用權利要求5的權利要求13所述的T細胞 混合物，其用于預防和/或治療癌癥，優選其中所述癌癥是結直腸癌、肺癌和/或胰腺癌。17. 根據權利要求6所述的肽混合物或根據引用權利要求6的權利要求13所述的T細胞 混合物，其用于預防和/或治療惡性黑素瘤。18. 肽混合物、用作疫苗或藥物的肽、肽、T細胞混合物、T細胞制劑或藥物組合物，其用 于包括以下步驟的方法： i)鑒定存在于取自患者的樣品中的RAS蛋白突變； i i)選擇包含含有對應于所述樣品中鑒定的RAS蛋白突變中的至少一個的點突變的肽 的根據權利要求1-10中任一項所述的肽混合物;或選擇包含對應于所述樣品中鑒定的RAS 蛋白突變中的至少一個的點突變的根據權利要求11所使用的肽;或選擇包含對應于所述樣 品中鑒定的RAS蛋白突變中的至少一個的點突變的根據權利要求12所述的肽;或選擇包含 對遞呈在MHC分子上時包含對應于所述樣品中鑒定的RAS蛋白突變中的至少一個的點突變 的肽具有特異性的T細胞的根據權利要求13所述的T細胞混合物或T細胞制劑;或選擇根據 權利要求14所述的藥物組合物，所述藥物組合物包含含有對應于所述樣品中鑒定的RAS蛋 白突變中的至少一個的點突變的肽混合物、用作疫苗或藥物的肽或肽，或含有對遞呈在MHC 分子上時包含對應于所述樣品中鑒定的RAS蛋白突變中的至少一個的點突變的肽具有特異 性的T細胞的T細胞混合物或T細胞制劑;和 iii)向所述患者施用所述肽混合物、用作疫苗或藥物的肽、肽、T細胞混合物或T細胞制 劑。19. 選擇用于向患者施用的肽混合物、用作疫苗或藥物的肽、肽、T細胞制劑、T細胞混合 物或藥物組合物的方法，所述方法包括： i)鑒定存在于取自患者的樣品中的RAS蛋白突變;和 i i)選擇包含含有對應于所述樣品中鑒定的RAS蛋白突變中的至少一個的點突變的肽 的根據權利要求1-10中任一項所述的肽混合物;或選擇包含對應于所述樣品中鑒定的RAS 蛋白突變中的至少一個的點突變的根據權利要求11所使用的肽;或選擇包含對應于所述樣 品中鑒定的RAS蛋白突變中的至少一個的點突變的根據權利要求12所述的肽;或選擇包含 對遞呈在MHC分子上時包含對應于所述樣品中鑒定的RAS蛋白突變中的至少一個的點突變 的肽具有特異性的T細胞的根據權利要求13所述的T細胞混合物或T細胞制劑;或選擇根據 權利要求14所述的藥物組合物，所述藥物組合物包含含有對應于所述樣品中鑒定的RAS蛋 白突變中的至少一個的點突變的肽混合物、用作疫苗或藥物的肽或肽，或含有對遞呈在MHC 分子上時包含對應于所述樣品中鑒定的RAS蛋白突變中的至少一個的點突變的肽具有特異 性的T細胞的T細胞混合物或T細胞制劑。
【文檔編號】C12N5/0783GK105980403SQ201480074531
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2014年12月9日
【發明人】喬恩·阿蒙·埃里克森
【申請人】塔格瓦克斯公司