一種含凝結芽孢桿菌的復合菌劑及其制備方法
【專利摘要】本發明提供了一種含凝結芽孢桿菌的復合菌劑,該復合菌劑含有凝結芽孢桿菌、糞腸球菌及釀酒酵母菌混合發酵的活性菌泥和穩定化保護劑，所述活性菌泥與穩定化保護劑質量比0.3?1.0：1.0?3.0，該復合菌劑中前述三種菌的有效活菌數分別為≥4.5×1010CFU/g、≥1.0×1010CFU/g、≥4.0×109CFU/g。本發明的復合益生菌劑不但能促進動物對飼料的消化吸收、節約成本，而且還可調節動物腸道內環境，從而提高動物免疫力、促進動物健康生長，顯著提高了動物的生產性能，降低了生產成本。本發明提供了該復合菌劑的制備方法，解決了單菌發酵生產的能耗高、容易污染、工藝繁瑣等問題，提高了各菌種生物活性。CGMCC No.1255320160527
【專利說明】
-種含凝結芽抱桿菌的復合菌劑及其制備方法
技術領域
[0001 ]本發明屬于微生物發酵技術領域，具體地說，設及一種含凝結芽抱桿菌的復合菌 劑及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 隨著我國畜牧業的快速發展，其數量與質量、生產與環境W及效益與資源之間的 矛盾越來越突出。尤其是畜禽排泄物對環境造成的污染日趨嚴重，大量的有害物排放使得 畜禽場污染物中的B0D(生化需氧量)和COD(化學需氧量)值急劇上升，同時也成為一些疾病 發生和傳播的潛在誘因。
[0003] 另一方面，食品安全問題正引起越來越多的關注，在造成食品安全問題的諸多原 因中，重要原因之一是飼料中使用抗生素作為促生長劑。客觀上，抗生素自20世紀50年代W 來廣泛應用于畜禽養殖業，在促進動物生長，保證動物健康，節約飼料成本，提高經濟效益 等方面做出了巨大貢獻。但由于抗生素在動物養殖業中的長期使用，近些年來，由其所致的 毒副作用和藥物殘留問題已引起人們的關注。2006年，歐盟已經全面禁止了飼料中抗生素 的使用，美國和日本等國家也對其做出了嚴格的限制。2011年，韓國全國禁止在動物飼料中 添加抗生素。
[0004] 隨著人們對畜產品安全和環境保護意識的不斷加強，作為抗生素的替代品，益生 菌越來越多的應用于動物營養和飼料中。益生菌是一類能改善動物胃腸道微生態平衡，有 益于動物健康和生產性能發揮的微生物添加劑。其主要作用效果體現在改善動物新陳代 謝，提高營養物質吸收和利用，提高免疫力，減少環境污染等方面發揮重要作用。
【發明內容】
[0005] 為了解決現有技術的不足，利用各菌株之間互利共生、寄生及括抗等關系，本發明 提供了一種復合菌劑及復合菌劑的制備方法。
[0006] 本發明提供的一種含凝結芽抱桿菌的復合菌劑，含有凝結芽抱桿菌(Bacillus coagulans)、糞腸球菌化nterococcus faecal is)及釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae化nsen)和穩定化保護劑。
[0007] 在本發明的實施例中，使用保藏編號為CGMCC No. 12553的凝結芽抱桿菌肥W- B379,但本發明不局限于該菌，本發明的復合菌劑中的=種菌不限于特定編號的凝結芽抱 桿菌、糞腸球菌及釀酒酵母菌，本領域技術內公知的屬于上述菌的微生物均可適用于本發 明的復合菌劑。
[000引本發明的復合菌劑中有效活菌數分別為:凝結芽抱桿菌>4.5Xl0WCFU/g、糞腸球 菌> 1.0 X 10^CFU/g，釀酒酵母菌>4.0 X l09cFU/g。
[0009]本發明的復合菌劑中，所述穩定化保護劑通過W下方法制備得到:將多維素0.1- 10份、簇甲基纖維素0.5-5份、麥芽糖0.5-4份和多聚糖2-6份加入35-50份水中，800-120化/ m轉速攬拌均勻得混合物，然后將混合物加入20-50份水中，邊加邊攬拌，并依次加入30-50 份可溶性淀粉和1-8份甘油，攬拌，充分溶解，混合10-20min即得穩定化保護劑。
[0010]本發明的復合菌劑是將凝結芽抱桿菌（Baci 1 lus coagulans )、糞腸球菌 (Enterococcus faecalis)及釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae 化nsen)分別發酵 得到二級發酵液后，將=種菌的二級發酵液按照體積比2:1:1的比例接種到=級發酵培養 基中發酵，當發酵液中凝結芽抱桿菌>5.0X109c化/mL、糞腸球菌>4.0X109c化/mL、酵母 菌>4.0X109c化/mL時發酵結束，將發酵液離屯、得到復合菌劑活性菌泥，再將活性菌劑和 穩定化保護劑按照質量比0.3-1.0:1.0-3.0混合均勻即得。
[0011]本發明提供了含有上述復合菌劑的動物飼料。
[0012 ]本發明提供了含有上述復合菌劑的飼料添加劑。
[0013] 本發明提供了上述復合菌劑在畜禽養殖中的應用。
[0014] 上述在畜禽養殖中的應用是將復合菌益生菌劑添加到飼料和動物飲水中。其中， 所述復合菌益生菌劑在飲水中的添加量為107-10化FU/L飲水;在飼料中的添加量為106- l〇9cFU/kg 飼料。
[0015] 本發明提供了上述復合菌劑在提高動物生產性能，促進動物生長發育中的應用。
[0016] 本發明提供了上述復合菌劑在制備動物飼料中的應用。
[0017] 本發明還提供了制備上述復合菌劑的方法，其特征在于，包括W下步驟：
[0018] (1)凝結芽抱桿菌(Bacillus coagulans)、糞腸球菌化nterococcus faecalis)及 釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae化nsen)分別進行一級種子發酵、二級種子發酵， 得到二級發酵液；
[0019] (2)將凝結芽抱桿菌、糞腸球菌、釀酒酵母菌的二級發酵液分別按照與=級發酵培 養基的體積比2%、1 %、1 %的比例接種到=級發酵培養基中發酵，當發酵液中凝結芽抱桿 菌> 5.0 X 1 〇9c化/mL、糞腸球菌> 4.0 X 1 〇9c化/mL、酵母菌> 4.0 X 1 〇9c化/mL時發酵結束； 離屯、=級發酵液得到復合菌劑活性菌泥；
[0020] (3)將活性菌劑和穩定化保護劑按照質量比0.3-1.0:1.0-3.0混合均勻即得。
[0021] 上述方法中，步驟(1)中
[0022] 凝結芽抱桿菌發酵時采用的一級、二級種子培養基為:紅糖1%-5%，大豆蛋白腺 0.5%-1.5%，酵母膏0.3%-1.0%，NaC10.1%-0.5%，K2HP04 0.2%-0.5%，硫酸儀 0.01%-0.1%，MnS04 0.05%-0.15%，余量為水，口職.0±0.2;
[0023] 優選地，凝結芽抱桿菌發酵時采用的一級、二級種子培養基為:紅糖3%，大豆蛋白 腺 1%，酵母膏〇.5%，NaCl 0.5%，K2HP04 0.3%，硫酸儀0.05%，MnS〇4 0.1%，余量為水， pH7.0±0.2〇
[0024] 糞腸球菌發酵時采用的一級、二級種子培養基為:薦糖1%-3% %，黃豆粉0.5%- 1 %，玉米漿干粉0.5 % -1.5 %，巧樣酸氨二錠0.2 % -0.7 %，硫酸亞鐵0.02 % -0.1 %，吐溫- 80 0.1%-0.3%，K2HP04 0.05%-〇.15%，MgS〇4*7H2〇 0.01%-〇.03%，MnS〇4*4H2〇 0.01%-0.05%，余量為水，口訊.0±0.2。
[0025] 優選地，糞腸球菌發酵時采用的一級、二級種子培養基為:薦糖2%，黃豆粉0.5%， 玉米漿干粉1 %，巧樣酸氨二錠0.5 %，硫酸亞鐵0.05%，吐溫-80 0.1 %，K2HP04 0.1%， 1邑504*7出0 0.01%，]?記04.4出0 0.03%，余量為水，口職.0±0.2。
[00%]釀酒酵母菌發酵時采用的一級、二級種子培養基為：糖蜜1.5%-2.5%，酵母粉 0.5%-1.5%，麥芽粉0.5%-1.5%，蛋白腺1%-3%，余量為水，9訊.0±0.2;上述％為質量 百分比。
[0027] 優選地，釀酒酵母菌發酵時采用的一級、二級種子培養基為:糖蜜2%，酵母粉1%， 麥芽粉1%，蛋白腺2%，余量為水，pH7.0±0.2。
[0028] 步驟(1)中凝結芽抱桿菌發酵方法為:取凝結芽抱桿菌甘油管保藏的菌種，接種于 300mL-級種子培養基中，進行搖瓶發酵培養，發酵溫度為37 ± 5°C、轉速2(K)r/min，發酵時 間15~25h，得到一級種子液(活菌濃度為109CRJ/mL)。將一級種子液轉接到50L發酵罐二級 種子培養基中，接種量為2 %，裝液量為20L、發酵溫度為37 ± 5 °C、攬拌轉速15化/min，培養 7-1化得到二級種子液，備用。
[0029] 糞腸球菌發酵方法為:將經活化的糞腸球菌甘油管保藏的菌種，直接接種于液體 種子培養基，30±5°C、180r/min培養5-lOh，得到一級種子液脯菌濃度為109C即/血）；將搖 瓶種子液按1 %的接種量接種于50L發酵罐中，裝液量為30L，35 ± 5°C、lOOr/min發酵3-化， 得到二級種子液，備用。
[0030] 釀酒酵母菌發酵方法為:取釀酒酵母菌甘油管保藏菌種接種于300mL-級種子培 養基中，進行搖瓶發酵培養，發酵溫度為28±2°C、轉速12化/min,發酵時間7-16h，得到一級 種子液。將一級種子液轉接到50L發酵罐二級種子培養基中，接種量為2%，裝液量為25L、發 酵溫度為28±2°C、攬拌轉速12化/min,培養5-12h得到二級種子液，備用。
[0031] 其中，步驟(1)得到的各菌的二級發酵液中有效活菌數分別為凝結芽抱桿菌>2.0 X 1〇9。化/血、糞腸球菌.0 X 1〇9。化/血、酵母菌> 1.0 X l〇9cfu/mL。
[0032] 本發明復合菌劑制備方法的步驟(2)中將=種菌接種到=級發酵培養基中后，發 酵方法為:發酵溫度控制在28-32°C，進行18-2化的有氧發酵，使凝結芽抱桿菌成為優勢菌 群并迅速增殖，使P郵華至4.7-5.2，進行恒壓厭氧發酵，溫度仍然控制在28-32°C，進行22- 2化的厭氧發酵，使糞腸球菌和酵母菌成為優勢菌群并迅速增殖。
[0033] 優選地，發酵方法為發酵溫度控制在3(TC，進行20h的有氧發酵，使凝結芽抱桿菌 成為優勢菌群并迅速增殖，使P郵華至5,進行恒壓厭氧發酵，溫度仍然控制在30°C，進行24h 的厭氧發酵，使糞腸球菌和酵母菌成為優勢菌群并迅速增殖。
[0034] 本發明方法的步驟（3)所述的穩定化保護劑通過W下方法制備得到：將多維素 0.1-10份、簇甲基纖維素0.5-5份、麥芽糖0.5-4份和多聚糖2-6份加入35-50份水中，800- 120化/m轉速攬拌均勻得混合物，然后將混合物加入20-50份水中，邊加邊攬拌，并依次加入 30-50份可溶性淀粉和1-8份甘油，攬拌，充分溶解，混合10-20min即得穩定化保護劑。
[0035] 優選地，步驟(3)將活性菌劑和穩定化保護劑按照質量比0.75:1.0混合。
[0036] 本發明方法的步驟(3)是將復合菌活性菌泥和穩定化保護劑按質量比0.3-1.0: 1.0-3.0在攬拌罐中攬拌均勻，攬拌轉速50r/m，均勻混合30min，并加水使混合料濕度為 35 %左右，得到菌濕粉;將菌濕粉勻速投入制粒機內，調節粒度為40目，然后進行包衣干燥， 并加入包被劑溶液，使菌粉形成包衣膜層，過篩獲得復合菌益生菌劑。
[0037] 所述包被劑溶液制備:玉米淀粉2%-5%、聚甘油脂肪酸醋1%-5%、聚乙締化咯燒 酬1%-3%、徑乙基纖維素2%-4%、果膠0.1%-3%、瓜爾膠〇.5%-7%、0-環糊精 低聚麥芽糖甘露低聚糖余量為水。
[0038] 本發明還提供了一種用于制備上述復合菌劑的穩定化保護劑，通過W下方法制備 得到:將多維素0.1-10份、簇甲基纖維素0.5-5份、麥芽糖0.5-4份和多聚糖2-6份加入35-50 份水中，800-120化/m轉速攬拌均勻得混合物，然后將混合物加入20-50份水中，邊加邊攬 拌，并依次加入30-50份可溶性淀粉和1-8份甘油，攬拌，充分溶解，混合10-20min即得穩定 化保護劑。
[0039] 本發明的有益效果主要體現在：
[0040] (1)本發明的復合益生菌劑不但能促進動物對飼料的消化吸收、節約成本，而且還 可調節動物腸道內環境，從而提高動物免疫力、促進動物健康生長，顯著提高了動物的生產 性能，降低了生產成本。
[0041 ] (2)本發明的益生菌劑用量較少，例如在飲水中僅為1 05CFU/L，在飼料中僅為 106CFU/kg時即可發揮顯著作用，具體表現在：
[0042] 1)可顯著提高哺乳仔豬的生產性能，有效降低了腹瀉率和死亡率:與對照組相比， 平均增重提高了 13.85%，腹瀉率降低了 53.23%，死亡率降低了 5.8%。
[0043] 2)可顯著提高斷奶仔豬的生產性能及免疫性能：與對照組相比，平均增重提高了 9.27%，料肉比降低12.5%，腹瀉率降低了9.75%。
[0044] (3)本發明制備復合菌劑的方法不僅解決了單菌發酵生產的能耗高、容易污染、工 藝繁瑣等問題，而且還能提高各菌種生物活性，并解決菌種退化等問題。
【具體實施方式】
[0045] W下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。在不背離本發明精神 和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。
[0046] 若未特別指明，實施例中所用的化學試劑均為常規市售試劑，實施例中所用的技 術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
[0047] W下實施例使用的凝結芽抱桿菌為凝結芽抱桿菌HEW-B379 (Bacillus coagulans)該菌株已于2016年5月27日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中屯、（簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編 100101)，分類命名為凝結芽抱桿菌(Bacillus coagulans),保藏編號為CGMCC No. 12553。
[0048] W下實施例使用的糞腸球菌已于2014年6月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中屯、，保藏編號為CGMCC NO. 9353，已在中國專利CN104293697A中公開； 釀酒酵母菌購自中國工業微生物菌種保藏管理中屯、。
[0049] 實施例1復合菌活性菌泥的制備
[0050] 取凝結芽抱桿菌甘油管保藏的菌種，接種于300mL-級種子培養基中，進行搖瓶發 酵培養，發酵溫度為37±5°C、轉速20化/min,發酵時間15~25h，得到一級種子液(活菌濃度 為109CFU/mL)。將一級種子液轉接到50L發酵罐二級種子培養基中，接種量為2%，裝液量為 20L、發酵溫度為37±5°C、攬拌轉速15化/min,培養7-15h得到二級種子液，備用。所述發酵 液活菌數 > 2.0 X 1 〇9cFU/mL。
[0051] 所述一級、二級種子培養基各成分含量為：紅糖3%，大豆蛋白腺1%，酵母膏 0.5%，NaCl 0.5%，K2HP04 0.3%，硫酸儀0.05%，]?記〇4〇.1%，余量為水，口^.0±0.2;
[0052] 將經活化的糞腸球菌甘油管保藏的菌種，直接接種于液體種子培養基，30 ± 5°C、 180r/min培養5-lOh，得到一級種子液脯菌濃度為109C即/mU ;將搖瓶種子液按1 %的接種 量接種于SOL發酵罐中，裝液量為30L，35±5°C、100r/min發酵3-化，得到二級種子液，備用。 [0053] 所述發酵液活菌數> 1.0 X 109CFU/mL;
[0054] 所述斜面培養基各成分含量為:薦糖2 %，黃豆粉0.5 %，玉米漿干粉1 %，巧樣酸氨 二錠0.5%，硫酸亞鐵0.05%，吐溫-80 0.1%，K2HP〇4〇.l%，MgS〇4 ? 7此0 0.01%，MnS〇4 ? 4出0 0.03%，余量為水，pH 7.0±0.2;
[0055] 取釀酒酵母菌甘油管保藏菌種接種于300mL-級種子培養基中，進行搖瓶發酵培 養，發酵溫度為28±2°C、轉速120r/min，發酵時間7-16h，得到一級種子液。將一級種子液轉 接到50L發酵罐二級種子培養基中，接種量為2%，裝液量為25L、發酵溫度為28±2°C、攬拌 轉速12化/min，培養5-1化得到二級種子液，備用
[0056] 所述發酵液活菌數> 1.0 X 109CFU/mL;
[0057]所述一級、二級種子培養基質量組分組成為;糖蜜2%，酵母粉1%，麥芽粉1%，蛋 白腺2%，余量為水，pH7.0±0.2;
[005引所述復合菌活性菌泥制備方法如下：
[0059] 將復合菌種凝結芽抱桿菌、糞腸球菌和酵母菌按照2:1:1的體積比接種到=級發 酵培養基中，接種量為凝結芽抱桿菌2%、糞腸球菌1 %和酵母菌1 % ( %為與=級發酵培養 基的體積比），發酵溫度控制在3(TC，進行20h的有氧發酵，使凝結芽抱桿菌成為優勢菌群并 迅速增殖，使P郵華至5.0左右，進行恒壓厭氧發酵，溫度仍然控制在30°C，進行24h的厭氧發 酵，使糞腸球菌和酵母菌成為優勢菌群并迅速增殖。發酵結束后進行檢測發酵液中各菌株 活性，凝結芽抱桿菌> 5.0 X 109cfu/mL、糞腸球菌>4.0 X 109cfu/mL、酵母菌>4.0 X 1〇9。化/血。
[0060] 發酵結束后，S級發酵液經1500化/min離屯、30min即得復合菌活性菌泥。
[0061] 所述=級培養基質量組成成分:薦糖1.5 %、葡萄糖0.5 %、麥芽粉0.5 %、玉米漿干 粉1.0 %、酵母膏1.0 %、硫酸儘0.02 %、憐酸氨二鐘0.5 %、硫酸儀0.05 %、余量為水，P冊.0 ±0.2。
[0062] 實施例2穩定化保護劑的制備
[0063] 所述穩定化保護劑的制備方法如下重量份數計，準確稱取可溶性淀粉30-50 份，多維素(Ve、Vc、Vd、Va、Vbi、Vb2、Vbi浪照1:2:1:1.5:1:1:1質量比例混合而成)0.1-10份，簇 甲基纖維素0.5-5份，甘油1-8份，多聚糖2-6份，麥芽糖0.5-4份，首先取35-50份水將多維 素、簇甲基纖維素、麥芽糖和多聚糖800-1200r/m轉速攬拌均勻得混合物，然后將混合物加 入20-50份水中，邊加邊攬拌，并依次加入可溶性淀粉和甘油，攬拌，充分溶解，混合10- 20min即得穩定化保護劑。
[0064] 實施例3復合菌益生菌劑的制備
[0065] 將實施例1制得的復合菌活性菌泥和實施例2制得的穩定化保護劑按質量比0.75: 1.00在攬拌罐中攬拌均勻，攬拌轉速50r/m，均勻混合30min，并加水使混合料濕度為35 %左 右，得到菌濕粉;將菌濕粉勻速投入制粒機內，調節粒度為40目，然后進行包衣干燥，并加入 包被劑溶液，使菌粉形成包衣膜層，過篩獲得復合菌益生菌劑。
[0066] 所述包被劑溶液制備:玉米淀粉2-5%、聚甘油脂肪酸醋1-5%、聚乙締化咯燒酬1- 3%、徑乙基纖維素2-4%、果膠0.1-3%、瓜爾膠0.5-7%、e-環糊精1-10%、低聚麥芽糖1- 10%、甘露低聚糖1-10%，余量為水。
[0067] 實施例4哺乳仔豬試驗
[0068] 選12頭分娩母豬，隨機分為兩組，并W分娩母豬所產仔豬為試驗對象。分為對照組 和試驗組，試驗組使用實施例3制得的復合微生態制劑，凝結芽抱桿菌>4.5Xl〇WCFU/g、糞 腸球菌.0 X lO^CFU/g，釀酒酵母菌>4.0 X 109CFU/g)。試驗組將復合益生菌劑溶解于無 菌水中，用于試驗，總活菌數>5.0 X l〇iDc化/mL。試驗組仔豬在吃初乳前分別灌服2mL實施 例3制得的復合益生菌劑水溶液（lOOg復合微生態制劑/1噸水），對照組仔豬則灌服2mL生理 鹽水。W后在7d和14加寸再次W同樣劑量灌服。仔豬出生時稱初重，28d斷奶時再次稱重，記 錄數據進行分析，期間觀察仔豬腹瀉及死亡情況。
[0069] 表1復合益生菌劑對哺乳仔豬體重的影響
[0070]
[0071] 注：同列數字肩標小寫字母相同表示差異不顯著(P〉〇. 05)，小寫字母不同的表示 差異顯著(P<〇.05)，大寫字母不同的表示差異極顯著(P<0.01)。
[0072] 由表1可見，試驗組平均增重高于對照組，比對照組提高了 22.72%。。試驗組的增 重分別與對照組相比差異極顯著(P<〇.01)。試驗數據顯示，本發明實施例3制得的復合益生 菌劑可有效提高哺乳期仔豬的體重。
[0073] 表2復合益生菌劑對哺乳仔豬腹瀉及死亡率的影響
[0074]
[0075] 由表2可見，哺乳期仔豬腹瀉主要出現在一周左右。試驗組的腹瀉率比對照組降低 了 86.49%。復合益生菌對于仔豬死亡率的影響，試驗組未出現死亡的情況，對照組死亡1 頭。實驗組死亡率比對照組提高3.7%。實驗結果顯示，實施例3制得的復合益生菌劑可有效 降低哺乳期仔豬的腹瀉率和死亡率。
[0076] 實施例5仔豬試驗
[0077] 試驗選用28±2日齡同胎次、體重相近（杜X長X大元雜交斷奶仔豬（公母各 半）200頭，隨機分成五個處理組(對照組、試驗組1~3和抗生素組），每處理4個重復，每重復 10頭，在同等飼養環境下進行飼養試驗。對照組為基礎日糧，試驗組1~3組是分別在對照組 基礎上添加 150克/噸、250克/噸、350克/噸實施例3制得的復合益生菌劑，抗生素組是在對 照組基礎上添加 500克/噸金霉素。試驗豬采用封閉式圈舍，日喂4次，自由采食和飲水，日清 掃圈舍3次。飼養管理及其免疫程序與豬場日常管理相同，定期消毒，發現豬只生病及時治 療。試驗預飼期5d，正飼期30d，每日記錄每欄豬的耗料量，統計采食量;記錄初始個體重、結 束個體重;觀察并記錄仔豬的腹瀉、糞便狀態、皮毛色澤。試驗當天早晨空腹稱重，每天精確 記錄4次投料量和剩料量，試驗結束后，次日清晨空腹稱重；W圈為單位詳細記錄耗料量;記 錄各組腹瀉發生情況;計算平均日采食量、平均日增重、料重比和腹瀉率;觀察豬的精神狀 態和膚色。試驗結束時，收集仔豬新鮮糞便，保存于-70°C超低溫冰箱中，測定其中大腸桿 菌、金黃色葡萄球菌及乳酸菌的含量。
[0078] 表3復合益生菌劑對仔豬生產性能的影響
[0079]
[0080] 注：同列數字肩標小寫字母相同表示差異不顯著(P〉〇. 05)，小寫字母不相同表示 差異顯著(P<〇.〇5)。表中數據為均值±標準差。
[0081] 由表3可知，抗生素組和試驗組仔豬耗料情況、平均增重、平均日增重均明顯高于 對照組。抗生素組和試驗組1~3的平均增重比對照組分別提高了9.49%、9.27%、9.56%和 10.05%。抗生素組和試驗組1~3的料肉比比對照組分別降低了 10.94%、12.5%、8.85 %和 10.42%，。抗生素組和試驗組1~3組的料肉比顯著低于對照組(P<0.05)，分別對照組降低 了 0.21、0.24、0.17、0.2。試驗結果表明，本發明的復合益生菌劑可提高仔豬采食量、日增重 和飼料轉化率。
[0082] 表4復合益生菌劑對仔豬腹瀉率的影響
[0083]
[0084] 由表4可W看出，抗生素組和試驗組腹瀉率均明顯低于對照組，分別比對照組降低 了 11.58 %、9.75 %、11.58 %和11.91 %。試驗結束后，通過觀察豬的健康活力情況，復合微 生態制劑組的豬皮毛紅亮，精神狀態好。試驗結果表明本發明實施例制得的復合益生菌劑 可有效降低斷奶仔豬的腹瀉率，并有效改善仔豬的生長狀態。
[0085] 要C；億煤恭估出末同側化物I的冷縣
[0086]
[0087] 由表5可知，仔豬糞便中大腸桿菌含量基本穩定，均可達106c化/g，抗生素組和試 驗組的含量均低于對照組;仔豬糞便中金黃色葡萄球菌含量試驗組和抗生素組均比對照組 低，其中試驗組3最低，活菌數僅有105c化/g，其次為抗生素組、試驗組3、試驗組1較低，活菌 數為106c化/g;而糞便中乳酸菌的含量試驗組3最高，活菌數可達2.21 X109c化/g，其次為試 驗組2和試驗組1，抗生素組最低。
[0088] 雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在 本發明基礎上，可W對之作一些修改或改進，運對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的運些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
【主權項】
1. 一種含凝結芽孢桿菌的復合菌劑，其特征在于，含有凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans)、奠腸球菌（Enterococcus faecal is)及釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae Hansen)和穩定化保護劑。2. 如權利要求1所述的復合菌劑，其特征在于，有效活菌數分別為:凝結芽孢桿菌多4.5 X 101()CFU/g、糞腸球菌彡 1.0 X 101()CFU/g，釀酒酵母菌彡 4.0 X 109CFU/g。3. 如權利要求1或2所述的復合菌劑，其特征在于，所述穩定化保護劑通過以下方法制 備得到:將多維素〇. 1-10份、羧甲基纖維素〇. 5-5份、麥芽糖0.5-4份和多聚糖2-6份加入35-50份水中，800-1200r/m轉速攪拌均勻得混合物，然后將混合物加入20-50份水中，邊加邊攪 拌，并依次加入30-50份可溶性淀粉和1-8份甘油，攪拌，充分溶解，混合10-20min即得穩定 化保護劑。4. 如權利要求1或2所述的復合菌劑，其特征在于，是將凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans)、奠腸球菌（Enterococcus faecal is)及釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae Hansen)分別發酵得到二級發酵液后，將三種菌的二級發酵液按照體積比2:1: 1的比例接種到三級發酵培養基中發酵，當發酵液中凝結芽孢桿菌多5.0X10 9cfu/mL、_? 球菌彡4.0 X 109cfu/mL、酵母菌彡4.0 X 109cfu/mL時發酵結束，將發酵液離心得到復合菌劑 活性菌泥，再將活性菌劑和穩定化保護劑按照質量比0.3-1.0:1.0-3.0混合均勻即得。5. 權利要求1-4任一所述復合菌劑在提高動物生產性能或畜禽養殖中的應用。6. 制備權利要求1-4任一所述復合菌劑的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 凝結芽抱桿菌(Bacillus coagulans)、奠腸球菌(Enterococcus faecal is)及釀酒 酵母菌(Saccharomyces cerevisiae Hansen)分別進行一級種子發酵、二級種子發酵，得到 二級發酵液； (2) 將凝結芽孢桿菌、糞腸球菌、釀酒酵母菌的二級發酵液分別按照與三級發酵培養基 的體積比2%、1 %、1 %的比例接種到三級發酵培養基中發酵，當發酵液中凝結芽孢桿菌多 5 · 0 X 109cfu/mL、糞腸球菌彡4 · 0 X 109cfu/mL、酵母菌彡4 · 0 X 109cfu/mL時發酵結束;離心 三級發酵液得到復合菌劑活性菌泥； (3) 將活性菌劑和穩定化保護劑按照質量比0.3-1.0:1.0-3.0混合均勻即得。7. 如權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(1)中 凝結芽孢桿菌發酵時采用的一級、二級種子培養基為：紅糖1%_5%，大豆蛋白胨 0·5%-1·5%，酵母膏0.3%-1.0%，NaCl 0·1%-〇·5%，Κ2ΗΡ〇4 0·2%-0·5%，硫酸鎂 0·01%-0·1%，MnS〇4 0.05%-0.15%，余量為水，口!17.0±0.2; 糞腸球菌發酵時采用的一級、二級種子培養基為：蔗糖黃豆粉0.5%-1%， 玉米漿干粉〇 · 5 % -1 · 5 %，檸檬酸氫二銨0 · 2 % -0 · 7 %，硫酸亞鐵0 · 02 % -0 · 1 %，吐溫-80 0.1%-〇.3%,K2HP〇4 0.05%-0.15% ,MgS04 · 7H20 0.01 %-〇. 03% ,MnS04 · 4H200.01%- 0.05%，余量為水，ρΗ7·0±0·2; 釀酒酵母菌發酵時采用的一級、二級種子培養基為:糖蜜1.5%-2.5%，酵母粉0.5%-1.5%，麥芽粉0.5%-1.5%，蛋白胨1%-3%，余量為水，？!17.0±0.2 ; 上述％為質量百分比。8. 如權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟（1)得到的各菌的二級發酵液中有效活 菌數分別為凝結芽孢桿菌彡2.0 X 109cfu/mL、糞腸球菌彡1.0 X 109cfu/mL、酵母菌彡1.0 X 109cfu/mL〇9. 如權利要求6-8任一所述的方法，其特征在于，步驟(2)中將三種菌接種到三級發酵 培養基中后，發酵方法為:發酵溫度控制在28-32°C，進行18-22h的有氧發酵，使凝結芽孢桿 菌成為優勢菌群并迅速增殖，使pH降至4.7-5.2，進行恒壓厭氧發酵，溫度仍然控制在28-32 °C，進行22-26h的厭氧發酵，使糞腸球菌和酵母菌成為優勢菌群并迅速增殖。10. -種用于制備權利要求1-4任一所述復合菌劑的穩定化保護劑，其特征在于，通過 以下方法制備得到:將多維素〇. 1-10份、羧甲基纖維素〇. 5-5份、麥芽糖0.5-4份和多聚糖2-6份加入35-50份水中，800-1200r/m轉速攪拌均勻得混合物，然后將混合物加入20-50份水 中，邊加邊攪拌，并依次加入30-50份可溶性淀粉和1-8份甘油，攪拌，充分溶解，混合10-20min即得穩定化保護劑。
【文檔編號】C12R1/865GK106047769SQ201610635151
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月4日 公開號201610635151.3, CN 106047769 A, CN 106047769A, CN 201610635151, CN-A-106047769, CN106047769 A, CN106047769A, CN201610635151, CN201610635151.3
【發明人】李雪平
【申請人】北京好實沃生物技術有限公司