一種固定的微生物體系及其制備方法和水體毒性的檢測方法

一種固定的微生物體系及其制備方法和水體毒性的檢測方法
【專利摘要】本發明提供了一種固定的微生物體系，包括：微生物載體，所述微生物載體由植物組織碳化制備得到；附著于所述微生物載體表面的微生物。本發明還提供了一種固定的微生物體系的制備方法以及一種水體毒性的檢測方法。本發明采用植物碳化組織一步法制備得到固定的微生物體系，制備方法簡單；而且本發明提供的固定的微生物體系采用附著法將微生物固定，使微生物自然沉積于載體材料孔隙的表面，無需進行交聯固化過程；另外，本發明采用的微生物載體為三維空間網狀結構，具有較好的傳質性能。因此，本發明提供的固定的微生物體系檢測水體毒性過程中活性較好，可以重復應用于水體毒性檢測，檢測效果較好。
【專利說明】
-種固定的微生物體系及其制備方法和水體毒性的檢測方法
技術領域
[0001] 本發明設及水體檢測技術領域，尤其設及一種固定的微生物體系及其制備方法和 水體毒性的檢測方法。
【背景技術】
[0002] 伴隨著社會的進步，人類在自我提高的同時也在不斷加深對周圍環境的影響，而 因此造成的環境污染又反作用于人類，成為了制約人類社會發展的障礙。目前，加強環境保 護、預防及治理已被污染的環境等問題已經成為科研工作者和環境專家首要關屯、的問題， 也是全人類需要共同面臨的巨大挑戰。在環境保護領域中，環境監測作為研究、分析、評價 及把握環境質量狀況，檢測、預測、判斷環境污染發展趨勢的重要技術，已經成為推動許多 學科和研究方向發展的必須助力，也是為各級政府、管理部口和民眾提供環境信息的主要 手段。
[0003] 毒性作為一個相對的概念，無論其結果是通過實際檢測還是建立數學模型的方法 獲得都會受到受試生物體個體因素的影響。Madinez等人的研究表明，熱帶魚Prochi lodus 1 ineatus對草甘麟類除草劑的靈敏度遠高于Oncorhynchus mykiss和Salmo salar。化地in 等人針對硫丹的研究表明，當毒物的濃度不變時，受試的娃魚幼魚的體型越大其存活率越 高;而隨接觸時間的增加，魚類對外源化學物的耐受量顯著減小。Pablo和B1組a分別W貝類 及蛙類的幼體為受試對象的毒性測試結果也證明了生物的未成年幼體對外界刺激的抵抗 能力相對較弱，而靈敏度更高。因此，在進行實驗前還需充分考慮監測對象的特點及考察的 側重點，從實際出發選擇合適的受試體種類及狀態。
[0004] 面對日益復雜化的環境問題，簡單的環境監測和純粹的理論分析已經不能適應所 有任務的需要，還要求科研工作者在掌握環境分析化學的基本知識的同時，按照現代分析 化學的結構，對環境監測中的具體項目做針對性的研究。魚類是最早應用的生物學環境污 染監測受試體，但是其生長周期較長，不能及時反映水質毒性污染狀況。一般來說，越是低 等的生物在自然界中存在的數量越是龐大、種類越多，其有望成為快速毒性檢測的受試體。 所W，將微生物作為受試體具有普遍意義。
[0005] 利用微生物為受試體的水體毒性檢測方法中，所使用的微生物為懸浮狀態，即分 散在水溶液中的微生物。使用懸浮狀態的微生物的缺點為每次實驗前要先進行微生物的培 養工作，增加了工作量、提高了檢測成本。但是固定的微生物是難于應用于水體毒性的檢測 的，由于固定的微生物與毒性物質反應后會出現兩種情況，一種是毒性物質會對微生物造 成損傷，從而使微生物失活;另一種是微生物對毒性物質產生耐受，從而再次遇見毒性物質 不能體現抑制。申請號為CN201410020376的中國專利，提供了一種用于毒性檢測生物傳感 器的生物膜的制備方法，包括W下步驟:取活性污泥在培養基上接種，得到菌液;將聚乙締 醇和海藻酸鋼加入到蒸饋水中，水浴加熱，隨后冷卻至常溫，得到聚乙締醇凝膠;將菌液離 屯、后，倒掉上清液，取得到的沉淀物與聚乙締醇凝膠混合，再利用表面皿將混合物均勻涂成 膜狀;將膜狀混合物進行干燥，使其成膜后，將膜放入預先配制好的交聯固化溶液中，交聯 固化后，取出固化完成的膜，即得到用于毒性檢測生物傳感器的生物膜。
[0006] 現有技術提供的運種用于毒性檢測生物傳感器的生物膜采用包埋的方法制備得 到，制備方法復雜;而且運種方法制備過程中的交聯固化會影響微生物的活性;另外，運種 方法在微生物外面包裹的材料阻礙了水溶液中物質的滲透傳質。因此。現有技術提供的運 種固定的生物傳感器生物膜用于水體毒性檢測時活性較低、檢測效果較差。

【發明內容】

[0007] 有鑒于此，本發明的目的在于提供一種固定的微生物體系及其制備方法和水體毒 性的檢測方法，采用本發明提供的固定的微生物體系檢測水體毒性時，微生物的活性較高， 檢測效果較好。
[000引本發明提供了一種固定的微生物體系，包括：
[0009] 微生物載體，所述微生物載體由植物組織碳化制備得到；
[0010] 附著于所述微生物載體表面的微生物。
[0011] 優選的，所述植物組織包括絲瓜飄、蔥白或洋蔥。
[0012] 優選的，所述微生物為B0化eed混合菌培養后得到的微生物。
[0013] 本發明提供了 一種固定的微生物體系的制備方法，包括：
[0014] 將微生物附著于微生物載體表面，得到固定的微生物體系;或
[0015] 在微生物載體表面原位培養微生物，得到固定的微生物體系；
[0016] 所述微生物載體由植物組織碳化制備得到。
[0017] 優選的，所述碳化的溫度為150°C~250°C;
[001引所述碳化的時間為3小時~9小時。
[0019] 優選的，所述原位培養微生物的溫度為20°C~55°C;
[0020] 所述原位培養微生物的時間《200小時。
[0021 ]本發明采用植物碳化組織一步法制備得到固定的微生物體系，制備方法簡單；而 且本發明提供的固定的微生物體系采用附著法將微生物固定，使微生物自然沉積于載體材 料孔隙的表面，無需進行交聯固化過程；另外，本發明中的微生物載體為=維空間網狀結 構，具有較好的滲透傳質能力。因此，本發明提供的固定的微生物體系檢測水體毒性過程中 活性較好，可W重復應用于水體毒性的檢測，檢測效果較好。
[0022] 本發明提供了一種水體毒性的檢測方法，其特征在于，采用固定的微生物體系進 行水體毒性檢測；
[0023] 所述固定的微生物體系為上述技術方案所述的固定的微生物體系。
[0024] 優選的，所述水體毒性的檢測方法具體為：
[0025] 將背景溶液、營養液和毒性溶液依次循環通入固定的微生物體系，所述背景溶液 的通入時間大于營養液的通入時間，所述營養液的通入時間和毒性溶液的通入時間相同；
[0026] 采用電化學方法測試背景溶液、營養液和毒性溶液分別通入固定的微生物體系 后，固定的微生物體系產生的電化學信號，分別記為背景溶液電化學信號、營養液電化學信 號和毒性溶液電化學信號；
[0027] 根據營養液電化學信號和毒性溶液電化學信號之間的差值得到毒性溶液的毒性；
[0028] 所述背景溶液用于穩定和恢復固定的微生物體系中微生物的活性；
[0029] 所述營養液為固定的微生物體系中的微生物提供營養物質；
[0030] 所述毒性溶液為含有毒性物質的營養液。
[0031] 優選的，所述背景溶液的通入時間為1分鐘~200分鐘；
[0032 ]所述營養液和毒性溶液的通入時間為1分鐘~30分鐘。
[0033] 優選的，所述毒性溶液中的毒性物質為有毒重金屬離子。
[0034] 本發明提供的水體毒性的檢測方法采用上述技術方案所述的固定的微生物體系 進行檢測，無需進行微生物培養即可進行檢測，檢測方法簡單;而且檢測過程中微生物的活 性較高，可重復進行檢測，檢測效果好。
【附圖說明】
[0035] 為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發明的實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可W根據 提供的附圖獲得其他的附圖。
[0036] 圖1為本發明實施例1制備得到的微生物載體的SEM圖；
[0037] 圖2為本發明實施例2制備得到的微生物載體的SEM圖；
[0038] 圖3為本發明實施例3制備得到的微生物載體的沈M圖；
[0039] 圖4為本發明實施例4制備得到的微生物載體的化SM檢測圖；
[0040] 圖5為本發明實施例5制備得到的微生物載體的化SM檢測圖；
[0041] 圖6為本發明實施例6制備得到的微生物載體的化SM檢測圖；
[0042] 圖7為本發明實施例8循環測定水體毒性的電信號記錄圖；
[0043] 圖8為本發明實施例8檢測水體毒性一個測量周期的放大信號圖；
[0044] 圖9為測量化連續6個周期的抑制率；
[0045] 圖10為化抑制率與濃度圖；
[0046] 圖11為測量不同濃度化連續1個月的抑制率；
[0047] 圖12為測量化連續5個周期的抑制率；
[004引圖13為化抑制率與濃度圖；
[0049]圖14為測量不同濃度化連續1個月的抑制率；
[00加]圖15為B i 、Cd2\化、Pb2+的濃度與抑制率圖；
[0051 ]圖16為DCP的濃度與抑制率圖。
【具體實施方式】
[0052]下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施 例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通 技術人員經改進或潤飾的所有其它實例，都屬于本發明保護的范圍。
[0053 ]本發明提供了一種固定的微生物體系，包括：
[0054] 微生物載體，所述微生物載體由植物組織碳化制備得到；
[0055] 附著于所述微生物載體表面的微生物。
[0056] 本發明提供的固定的微生物體系包括微生物載體，所述微生物載體由植物組織碳 化制備得到。在本發明中，所述植物組織優選為絲瓜飄、蔥白或洋蔥。在本發明中，所述微生 物載體的制備方法優選為：
[0057]將植物組織進行碳化制備得到微生物載體。
[005引在本發明中，所述碳化的溫度優選為150°C~250°C，更優選為160°C~220°C，最優 選為180°C~220°C。在本發明中，所述碳化的時間優選為3小時~9小時，更優選為5小時~8 小時，最優選為6小時~7小時。本發明優選將植物組織在反應蓋中進行碳化。在本發明中， 所述植物組織與上述技術方案所述植物組織一致，在此不再寶述。
[0059] 在本發明中，所述微生物載體的生物相容性好，在固定微生物的同時無需對載體 表面進行修飾、刻蝕等前處理，操作簡單，有利于快速監測水體;而且微生物載體為疏松的 網狀結構，負載微生物后具有很好的傳質能力，固定的微生物具有較高的活性，而且能夠負 載較多的微生物，用于水體監測時得到的檢測結果較為準確。
[0060] 在本發明中，將植物組織進行碳化之前優選將植物組織洗凈后裁切成所需尺寸。 在本發明中，所述碳化完成后優選將得到的碳化產物去除有機物后洗涂、干燥，得到微生物 載體。在本發明中，去除有機物所用的試劑優選為醇類化合物，更優選為碳原子數為1~5的 醇類化合，最優選為乙醇。在本發明中，所述洗涂的試劑優選為水，更優選為二次水。在本發 明中，所述干燥的方法優選為凍干。
[0061] 在本發明中，所述微生物為培養B0化eed混合菌獲得的微生物。在本發明中，所述 微生物為混合菌培養得到的，可用于不同種類環境水樣的監測，具有普適性。BODseed混合 菌在環境監測中的具有代表性，由屯種菌組成，詳細見表1所示，表1為BODseed混合菌的組 成，運些菌種在環境檢測中具有代表性：
[0062] 表1 BODseed混合菌的組成
[0063]
[0064] 本發明提供了 一種固定的微生物體系的制備方法，包括：
[0065] 將微生物附著于微生物載體表面，得到固定的微生物體系;或
[0066] 在微生物載體表面原位培養微生物，得到固定的微生物體系；
[0067] 所述微生物載體由植物組織碳化制備得到。
[0068] 在本發明中，所述微生物和微生物載體與上述技術方案所述微生物和微生物載體 一致，在此不再寶述。
[0069] 本發明對將微生物附著在微生物載體表面的方法沒有特殊的限制，本領域技術人 員可根據實際操作條件將微生物轉移至微生物載體表面即可。
[0070] 在本發明中，所述原位培養微生物的溫度優選為20°C~55 °C，更優選為25°C~50 °C，最優選為30°C~40°C。在本發明中，所述原位培養微生物的時間優選《200小時，更優選 為1小時~150小時，更優選為10小時~100小時，最優選為30小時~60小時。在本發明中，所 述原位微生物培養的方法優選為：
[0071 ]將微生物載體投入微生物培養液中進行震蕩培養。
[0072] 在本發明中，所述微生物培養液包括菌體和培養液。在本發明中，所述菌體優選為 BODseed混合菌。在本發明中，所述培養液優選為Luria-Bertani (LB)培養液(蛋白腺lOg，酵 母膏5g，蒸饋水lOOOmL，pH 7.0)、牛肉膏蛋白腺培養基（培養細菌用）（牛肉膏3g，蛋白腺 lOg，化C1 5g，水1000血，pH7.0-7.2)或YEPD培養液(牛肉膏3g，酵母提取物3g，膜化蛋白腺 3邑，葡萄糖lOg，水lOOOmUp冊.5)。若需要固體培養基進行微生物培養在配制上述培養液過 程中添加1.5%~2.0%的瓊脂即可。培養液和培養基在配制當天滅菌，滅菌條件為i2rc， 20min。
[0073] 本發明提供了一種水體毒性的檢測方法，采用固定的微生物體系進行水體毒性檢 測;所述固定的微生物體系為上述技術方案所述的固定的微生物體系。
[0074] 在本發明中，所述水體毒性的檢測方法具體為：
[0075] 將背景溶液、營養液和毒性溶液依次循環通入固定的微生物體系，所述背景溶液 的通入時間大于營養液的通入時間，所述營養液的通入時間和毒性溶液的通入時間相同；
[0076] 采用電化學方法測試背景溶液、營養液和毒性溶液分別通入固定的微生物體系 后，固定的微生物體系產生的電化學信號，分別記為背景溶液電化學信號、營養液電化學信 號和毒性溶液電化學信號；
[0077] 根據營養液電化學信號和毒性溶液電化學信號之間的差值得到毒性溶液的毒性；
[0078] 所述背景溶液用于穩定和恢復固定的微生物體系中微生物的活性；
[0079] 所述營養液為固定的微生物體系中的微生物提供營養物質；
[0080] 所述毒性溶液為含有毒性物質的營養液。
[0081] 本發明基于微生物可對水體中毒性物質做出快速響應的原理，通過電化學方法檢 測信號并建立信號的量化方法，從而監測水體生物毒性物質污染。本發明提供的水體毒性 檢測方法能夠克服傳統毒性分析方法耗時、昂貴、應用范圍窄等缺陷，適用于長期在線的水 體毒性監測。
[0082] 本發明將背景溶液、營養液和毒性溶液依次循環通入固定的微生物體系。在本發 明中，所述背景溶液用于穩定和恢復固定的微生物體系中微生物的活性，優選為PBS緩沖 液。在本發明中，所述PBS緩沖液的pH值優選為6.5~7.5，更優選為7。在本發明中，所述營養 液為固定的微生物體系中的微生物提供營養物質，優選為葡萄糖-谷氨酸(GGA)溶液。在本 發明中，所述GGA溶液的濃度優選為15mg/L~25mg/L，更優選為20mg/L。在本發明中，所述毒 性溶液為含有毒性物質的營養液。在本發明中，所述毒性物質優選為有毒重金屬離子，如 化6+。
[0083] 在本發明中，所述背景溶液的通入時間大于營養液的通入時間，所述營養液的通 入時間和毒性溶液的通入時間相同。在本發明中，所述背景溶液的通入時間優選為1分鐘~ 200分鐘，更優選為10分鐘~150分鐘，最優選為400分鐘~100分鐘。在本發明中，所述營養 液和毒性溶液的通入時間優選為1分鐘~30分鐘，更優選為5分鐘~20分鐘，最優選為10分 鐘~15分鐘。
[0084] 在本發明中，所述背景溶液、營養液和毒性溶液依次循環通入固定的微生物體系， 即背景溶液通入固定的微生物體系背景溶液時間后，營養液通入固定的微生物體系營養液 時間，然后毒性溶液再通入固定的微生物體系與營養液相同的時間，然后背景溶液再次通 入固定的微生物體系背景溶液時間，依次類推，按照運樣的方式將背景溶液、營養液和毒性 溶液循環通入固定的微生物體系。本發明可W采用定時控制器和恒流累組成進樣系統，用 于輸送背景溶液、營養液和毒性溶液進入到固定的微生物體系。在本發明中，所述背景溶 液、營養液和毒性溶液的進樣速度優選為ImL/min~4mL/min，更優選為2mL/min~3mL/min。 本發明可W采用微生物反應器和恒溫培養箱組成反應器，在37°C的恒溫培養箱中，采用微 生物反應器裝放固定的微生物體系。
[0085] 在本發明中，采用電化學的方法測試背景溶液、營養液和毒性溶液分別通入固定 的微生物體系后，固定的微生物體系產生的電化學信號，分別記為背景溶液電化學信號、營 養液電化學信號和毒性溶液電化學信號。在本發明中，可采用電極和電化學工作站作為數 據采集系統記錄固定的微生物體系產生的電化學信號，用電極對通入不同液體后的固定的 微生物體系進行測試，通過電化學工作站的電化學分析儀測出電流信號值。
[0086] 本發明根據營養液電化學信號和毒性溶液電化學信號之間的差值得到毒性溶液 的毒性。本發明通過檢測活性微生物代謝功能的變化檢測有毒物質的含量或性質。在本發 明中，有毒物質會抑制固定的微生物體系中微生物的活性，本發明優選W不同性質的溶液 通入固定的微生物體系后發生反應產生的電流衡量微生物的呼吸能力，反應中被微生物還 原的量可W通過電化學方法中的計時電流法進行測量，營養液通入固定的微生物體系產生 的電流與毒性溶液通入固定的微生物體系產生的電流的差值即為有毒物質對微生物呼吸 作用的影響。
[0087] 在本發明中，通過式I可W將電流值轉化為毒性物質對微生物呼吸作用的抑制百 分率，即代表毒性：
[008引
[0089] 式I中，I代表毒性物質對受試微生物呼吸作用的抑制率，W百分數表示，代表毒性 的大小；isDntrDl代表營養液通入固定的微生物體系后得到的電流值，isample代表毒性溶液通 入固定的微生物體系后得到的電流值。本申請抑制生物體呼吸作用的程度"為"毒性"的 生物學指標，根據微生物中毒時，其呼吸鏈的電子傳遞速率受到直接影響，通過計算抑制率 來表征不同毒性物質的毒性強弱，建立了固定微生物為受試體檢測毒性的生物學方法。
[0090] 本發明提供的水體毒性檢測方法檢測水體之前無需進行微生物的培養工作，而且 在檢測過程中能夠保持微生物的生理活性，本發明提供的水體毒性的檢測方法能夠準確和 長期反復使用，該方法具有操作簡單、使用方便、成本低廉的優點。
[0091] 本發明W下實施例所用的化學試劑除非另作說明，分析時均使用符合國家標準的 分析純化學試劑，用水為均為Mi 11 ipore Ml 1 i-Q純化過的超純水。
[0092] 憐酸鹽緩沖液的制備：
[0093] 憐酸鹽緩沖溶液（PBS，0.12mol/L 化抽P〇4/0.08mol/L K出P〇4/0.1mol/L KCl，pH 7.0):將10.8872g憐酸二氨鐘化出P〇4)，42.976g憐酸氨二鋼(Na2HP〇4 ? 12出0)，用二次水稀 釋至化。此溶液抑值7.0。
[0094] GGA標準溶液按照APHA方法配制：
[00巧]稱取葡萄糖(C6出2〇6)和谷氨酸(C5曲N04)各150mg，用二次水溶解，在lOOmL容量瓶 中稀釋至標線(此溶液的B0化值約為2000mg 0 [1，為區分記為GGA2000)。儲存在冰箱中，根 據實驗要求其他濃度的B0D標準溶液均由GGA2000稀釋得到。
[0096] 有毒金屬離子化溶液：由重銘酸鐘化2吐2化，M = 294.18)制備，取0.735g K2化2〇7 溶解于5mL二次水，濃度為0.5mol L-1。計算得到4mg 1/1吐6%取化L SOOmmol 1/1吐6%溶于 50mL PBS溶液即可，根據要求再計算配置不同濃度的化溶液。
[0097] 有毒金屬離子Cu2+溶液：由Cu(N〇3)2溶液配制得到Ig/L的Cu2+，根據要求再計算配 置不同濃度的化溶液。
[0098] BODseed混合菌為Cole F*a;rme;r的BODseed混合菌。
[0099] 異硫氯酸巧光素 (Fluorescein isothiocyanate，FITC)溶液：用二次水配制為Img rnL 〇
[0100] 恒溫振蕩培養箱:ZHWY-2102C型，上海智城分析儀器制造有限公司，上海，中國。
[0101] 真空干燥箱:DZF-6020型，上海精宏實驗設備有限公司，上海，中國。
[0102] 恒溫培養箱:泰斯特D肥500A型，天津，中國。
[0103] 冷凍干燥機:化rist實驗室冷凍干燥機ALPHA 1-2LD plus,德國。
[0104] 溶解氧測量使用商業的松寶通氧累(SB-648)。
[0105] 恒流累為保定蘭格蠕動累BT100-1J(保定，中國）。
[0106] 電化學測量使用上海辰華生產的CHI 830B電化學分析儀（CHI Co.，Shanghai， 化ina)，使用恒電位模式檢測。電極為S電極系統，包括金工作電極，銷對電極和Ag/AgCl參 比電極，電解液為0.1mol/L的KC1。
[0107] 掃描電子電鏡（scanning electron microscope，SEM) :)(L30ESEM掃描電子顯微 鏡。
[0108] 激光誘導巧光共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscope,化SM):萊 卡TCS SP2(萊卡顯微系統化ide化erg Gm地，曼海姆，德國）附帶氣離子激光器(457/488/ 514nm)。
[0109] 實施例1
[0110] 將絲瓜飄洗凈，裁切成需要尺寸。裝入反應蓋，180°C條件下進行化碳化，將得到的 碳化產物放入乙醇中，去除有機殘留物;然后用二次水沖洗后在0.0 Smpar條件下凍干備用， 得到微生物載體。
[0111] 對實施例1制備得到的微生物載體進行表征，檢測結果如圖1所示，圖1為本發 明實施例1制備得到的微生物載體的SEM圖。
[0112] 實施例2
[0113] 按照實施例1所述的方法制備微生物載體，與實施例1不同的是采用蔥白代替絲瓜 飄。
[0114] 對實施例2制備得到的微生物載體進行表征，檢測結果如圖2所示，圖2為本發 明實施例2制備得到的微生物載體的SEM圖。
[011引實施例3
[0116] 按照實施例1所述的方法制備微生物載體，與實施例1不同的是采用洋蔥代替絲瓜 飄。
[0117] 對本發明實施例3制備得到的微生物載體進行沈M表征，檢測結果如圖3所示，圖3 為本發明實施例3制備得到的微生物載體的SEM圖。
[0118] 從圖1~圖3可W看出，本發明實施例制備的微生物載體保留了原生物組織的物理 結構，具有很好的孔隙傳質特性好；同時，多孔結構使微生物載體有很高的比表面積，有利 于大量負載微生物。
[0119] 實施例4
[0120] 將本發明實施例1制備得到的微生物載體投入微生物培養液中，于37°C恒溫震蕩 培養48小時，注意減少震蕩頻率，W免附著于微生物載體表面的微生物被震蕩脫落，得到固 定的微生物體系；
[0121] 所述微生物培養液包括B0化eed混合菌和LB培養液(蛋白腺lOg，酵母膏5g，蒸饋水 lOOOmL，抑 7.0)。
[0122] 將實施例4制備得到的固定的微生物體系用PBS沖洗去除多余的微生物載體，用異 硫氯酸巧光素溶液進行30min染色，用PBS徹底沖洗去除未附著的染料，在激發波長為488nm 下進行化SM檢測。
[0123] 化SM檢測結果如圖4所示，圖4為本發明實施例4制備得到的微生物載體的化SM的 檢測圖。
[0124] 實施例5
[0125] 按照實施例4所述的方法制備固定的微生物體系，與實施例4不同的是采用實施例 2制備得到的微生物載體代替實施例1制備得到的微生物載體。
[0126] 按照實施例4所述的方法對實施例5制備得到的固定的微生物體系進行化SM表征， 檢測結果如圖5所示，圖5為本發明實施例5制備得到的微生物載體的化SM檢測圖。
[0127] 實施例6
[0128] 按照實施例4所述的方法制備固定的微生物體系，與實施例4不同的是采用實施例 3制備得到的微生物載體代替實施例1制備得到的微生物載體。
[0129] 按照實施例4所述的方法對實施例6制備得到的固定的微生物體系進行化SM表征， 檢測結果如圖6所示，圖6為本發明實施例6制備得到的微生物載體的化SM檢測圖。
[0130] 由圖4~圖6可知，微生物在微生物載體表面附著均勻，負載量大。本發明提供的微 生物載體可W用于微生物固定。而且W蔥白為原料制備得到的微生物載體具有更好的微生 物固定性能。
[0131] 本發明提供的微生物載體在保持微生物的長期活性方面表現出很好的生物相容 性，通過SEM圖和CLAM圖的表征，微生物載體的空間網絡結構特點使固定的微生物體系形成 一個=維空間的"微生物細胞集合"，能很好的傳質、負載微生物;而且運種微生物載體具有 很強的生物降解能力，對抑不敏感，具有較強的適應能力。
[0132] 實施例7
[0133] 本發明實施例提供的用于水體毒性檢測的系統，包括：
[0134] -個定時控制器（TPC8-8TD型號，北京，中國）和一個恒流累（保定蘭格蠕動累 BT100-1J，保定，中國）組成的進樣系統;一個微生物反應器和恒溫培養箱(泰斯特DH2500A 型，天津，中國）組成的反應器；W及電極和電化學工作站(上海辰華CHI 830B，上海，中國） 組成的數據采集系統。
[0135] 定時控制器為北京多維精控計算機技術開發中屯、研制的TPC8-8定時程序控制器 (北京，中國）。主要技術參數如下:供電電源為直流24V/2A開關穩壓電源，控制器端子EG為 地線，端子24V為正極;輸出方式為NPN型晶體管集電極開路輸出，輸出有效:對地導通，輸出 無效:開路;輸出電壓為連接負載情況下，輸出有效時:接近0V;輸出無效時：24V;每路輸出 為電流小于300mA，功率小于7W，電阻大于80 Q ;輸入電壓為0-24V范圍內的開關量信號；輸 入信號為電平信號;傳感器為電源15~24V，低電平有效的NPN型開關量傳感器。WUSB接口 連接電腦驅動。
[0136] 蠕動累配套使用為直徑2.5mm的硅膠管。在11.5巧m(~3mL mirTi)流速下，按所設 定好的程序進樣，PBS作為背景溶液，維持微生物的穩定性。在37。直溫箱中，把實施例5審。 備得到的固定的微生物系統裝入微生物反應器后，用電極對毒性物質的反應進行測試，通 過電化學分析儀測出電流信號值。
[0137] 選擇金電極作為工作電極，Ag/AgCl作為參比電極，銷絲為對電極，運種電極使所 建立的儀器擁有較高的靈敏度。采用計時電流方法測定電化學信號，電壓設定-700mV，使用 儀器為CHI830B型電化學工作站。
[013引實施例8
[0139] 采用實施例7提供的水體毒性檢測系統進行水體毒性檢測：
[0140] PBS緩沖溶液為背景溶液；
[0141] 用移液槍取GGA標準溶液lOmL，用PBS稀釋至lOOOmL，取500mL置于錐形瓶中，作為 營養液；
[0142] 取化6+2化1(通過計算吐6+即是20mg 1/1吐6+)和上述另外500mL營養液混合， 作為毒性溶液；
[0143] 在進樣前需要通氧儀器通空氣氧20分鐘至氧氣飽和。
[0144] 對用于水體毒性檢測的系統進行程序設置，累的流速為3mL mirTi，背景溶液進樣 40分鐘，營養液進樣10分鐘，毒性溶液進樣10分鐘，背景溶液再次進樣40分鐘依次類推循環 進樣，每個循環周期為100分鐘。
[0145] 測試結束后得到的檢測結果如圖7和圖8所示，圖7為本發明實施例8循環測定水體 毒性的電信號記錄圖，圖8為本發明實施例8檢測水體毒性一個測量周期的放大信號圖。從 圖7和圖8可W看出，PBS緩沖溶液產生的信號值可W達到53化A左右，通入GGA標準溶液，微 生物在營養液中進行了呼吸作用，水中氧含量減少，信號隨之降低，為37化A左右。而在微生 物的信號達到穩定時，加入20mg [1化與20mg 1/iGGA的混合溶液(毒性溶液），信號值降低 的幅度明顯變小，為420nA左右。重金屬離子燈6+對微生物的呼吸作用有抑制，呼吸強度變 弱，消耗的氧氣減少，電流值減小幅度變小，本發明提供的方法可W測定水體中的有毒重金 屬離子。
[0146] 實施例9
[0147] 按照實施例8的水體毒性檢測方法對Cr6+毒性溶液連續進行6個周期的毒性檢測， 根據記錄得到的電信號圖按照式I的公式計算抑制率，結果如圖9所示，圖9為測量化連續6 個周期的抑制率，由圖9可知，多組的重復性實驗，得到的數據圖基本一致，本發明提供的水 體毒性檢測方法具有較好的重現性。
[014引實施例10
[0149] 取GGA2000溶液5mL用PBS稀釋至500mL，取300mL作為營養液(GGA20溶液）；
[0150] 將剩余的GGA溶液分為四份，每份50mL，分別向每份中添加化L、化L、10化、2化L的 Img 1/1化6+，得到吐6+濃度為Img L-i、5mg L-i、10mg L-i、20mg [1 的毒性溶液。
[0151] 按照實施例8所述的方法對毒性溶液進行檢測，每個周期更換不同濃度的毒性溶 液。
[0152] 根據記錄得到的電信號圖按照式I的公式計算抑制率，檢測結果如圖10所示，圖10 為Cr6+抑制率與濃度圖，從圖10中可W看出，四個周期的檢測過程中加入Cr6+電流信號值降 低較小，隨著Cr6+濃度的增大，電流值降低逐漸變小，抑制作用明顯，在抑制率圖中可W看出 抑制率與濃度呈一定線性關系，本發明提供的水體毒性檢測方法能夠檢測不同濃度的重金 屬離子。
[0153] 實施例11
[0154] 按照實施例10的水體毒性檢測方法對不同濃度的Cr6+毒性溶液連續進行1個月的 毒性檢測，根據記錄得到的電信號圖按照式I的公式計算抑制率，結果如圖11所示，圖11為 測量不同濃度Cr6+連續1個月的抑制率，由圖11可知，檢測過程中得到的信號值基本穩定，不 同濃度抑制作用不同，一定范圍內隨濃度的增加而增大。本發明提供的水體毒性檢測方法 能夠長期測定水體中金屬離子，具有一定的穩定性和適用性。
[01對實施例12
[0156] 按照實施例9的方法檢測水體毒性，采用5mg/L的化毒性溶液連續進行5個周期的 毒性檢測。
[0157] 根據記錄得到的電信號圖按照式I的公式計算抑制率，結果如圖12所示，圖12為測 量Cu2+連續5個周期的抑制率，由圖12可知，多組的重復性實驗，得到的數據圖基本一致，本 發明提供的水體毒性檢測方法具有較好的重現性。
[015引實施例13
[0159] 按照實施例10所述的方法檢測水體毒性，采用Cu2+濃度為Img L-i、2mg L-i、5mg L -I'lOmg L_i的毒性溶液。
[0160] 根據記錄得到的電信號圖按照式I的公式計算抑制率，檢測結果如圖13所示，圖13 為Cu2+抑制率與濃度圖，從圖13中可W看出，四個周期的檢測過程中隨著Cu2+濃度增加，抑 審IJ作用逐漸增強，但抑制率較低，抑制率與濃度呈良好的線性關系。本發明提供的水體毒性 檢測方法能夠檢測不同濃度的重金屬離子。
[0161] 實施例14
[0162] 按照實施例13的水體毒性檢測方法對不同濃度的Cu2+毒性溶液連續進行1個月的 毒性檢測。
[0163] 根據記錄得到的電信號圖按照式I的公式計算抑制率，結果如圖14所示，圖14為測 量不同濃度化連續1個月的抑制率，由圖14可知，檢測過程中得到的信號值基本穩定，不同 濃度抑制作用不同，一定范圍內隨濃度的增加而增大。本發明提供的水體毒性檢測方法能 夠長期測定水體中的金屬離子，具有一定的穩定性和適用性。
[0164] 本發明通過對Cr6+與化進行重現性實驗、濃度梯度實驗W及長期穩定性實驗，可 W看出，加入有毒離子，微生物的呼吸活性被抑制，加入PBS時，活性又會恢復，本發明提供 的固定的微生物體系的穩定性好，通過電流值的大小能很直觀的表征檢測物的有毒和無 毒，本發明提供的水體毒性的檢測方法可W用來檢測水體中的重金屬離子。
[01化]實施例15
[0166] 制備Bi3+濃度為50mg/L的水溶液；
[0167] 取GGA2000溶液5mL用PBS稀釋至500mL，取300mL作為營養液(GGA20溶液）；
[016引將剩余的GGA溶液分為四份，每份50mL，分別向每份中添加扣L、10化、2化L、30化的 50mg L-iBi3+，得到Bi3+濃度為5mg L-i、10mg L-i、20mg L-i、30mg L-1 的毒性溶液。
[0169] 按照實施例10所述的方法對上述毒性溶液進行檢測。
[0170] 根據記錄得到的電信號圖按照式I的公式計算抑制率，檢測結果如圖15所示，圖15 為813+、〔(12+、2112+、口護的濃度與抑制率圖。
[0171] 實施例16
[0172] 制備Cd2+濃度為50mg/L的水溶液；
[0173] 取GGA2000溶液5mL用PBS稀釋至500mL，取300mL作為營養液(GGA20溶液）；
[0174] 將剩余的GGA溶液分為四份，每份50mL，分別向每份中添加扣L、10化、2化L、30化的 50mg L-iCd2+，得到Cd2+濃度為5mg L-i、10mg L-i、20mg L-i、30mg L-1 的毒性溶液。
[0175] 按照實施例10所述的方法對上述毒性溶液進行檢測。
[0176] 根據記錄得到的電信號圖按照式I的公式計算抑制率，檢測結果如圖15所示。
[0177] 實施例17
[017引制備化濃度為50mg/L的水溶液；
[01巧]取GGA2000溶液5mL用PBS稀釋至500mL，取300mL作為營養液(GGA20溶液）；
[0180] 將剩余的GGA溶液分為四份，每份50mL，分別向每份中添加扣L、10化、2化L、30化的 50mg 1/1化2+，得到Zn2+濃度為5mg L-i、10mg L-i、20mg L-i、30mg L-1 的毒性溶液。
[0181 ]按照實施例10所述的方法對上述毒性溶液進行檢測。
[0182] 根據記錄得到的電信號圖按照式I的公式計算抑制率，檢測結果如圖15所示。
[0183] 實施例18
[0184] 制備化濃度為50mg/L的水溶液；
[01化]取GGA2000溶液5mL用PBS稀釋至500mL，取300mL作為營養液(GGA20溶液）；
[0186] 將剩余的GGA溶液分為四份，每份50mL，分別向每份中添加扣L、10化、2化L、30化的 50mg L-1 饑2+，得到Pb2+濃度為5mg L-i、10mg L-i、20mg L-i、30mg L-1 的毒性溶液。
[0187] 按照實施例10所述的方法對上述毒性溶液進行檢測。
[0188] 根據記錄得到的電信號圖按照式I的公式計算抑制率，檢測結果如圖15所示。
[0189] 由圖15Bi3+、Cd2+、Zn2+、Pb2+四種金屬離子的濃度與抑制率之間的關系曲線，可W得 到相應各個離子的毒性強弱，它們的大小順序為Cd2+(20mg L-i)〉Pb2+(20mg L-i)〉Bi3+(20mg
[i)〉Zn2+(20mg 1/1)。本發明檢測得到的結果與現有技術報道的金屬離子在毒性趨勢上是 一致的。本發明提供的水體毒性檢測方法對重金屬離子的毒性檢測具有普適性。
[0190] 實施例19
[0191] 審恪3,5-二氯苯酪(DCP)濃度分別為5111旨1/1、1〇111旨1/1、15111旨1/1、2〇111旨1/1的毒性溶液 (將0.1 g DCP溶于lOOmL水中，得到lOOOmg/L的DCP母液;然后用水將母液稀釋至所需的溶 度)；
[0192] 按照實施例10所述的方法對上述毒性溶液進行檢測。
[0193] 根據記錄得到的電信號圖按照式I的公式計算抑制率，檢測結果如圖16所示，圖16 為DCP的濃度與抑制率圖。由圖16可知，DCP不僅沒有抑制微生物的呼吸作用，反而促進微生 物的呼吸作用，運是由于DCP本身對微生物的毒性很小，同時作為有機物，將其加入固定的 微生物系統中，增加了微生物新陳代謝作用的底物，從而增加了溶液中氧氣的消耗，出現了 負抑制的結果。本發明提供的水體毒性檢測方法還可對有機毒性污染物進行毒性檢測。
[0194] 由W上實施例可知，本發明提供了一種固定的微生物體系，包括:微生物載體，所 述微生物載體由植物組織碳化制備得到；附著于所述微生物載體表面的微生物。本發明采 用植物碳化組織一步法制備得到固定的微生物體系，制備方法簡單;而且本發明提供的固 定的微生物體系采用附著法將微生物固定，使微生物自然沉積于載體材料孔隙的表面，無 需進行交聯固化過程;另外，本發明采用的微生物載體為=維空間網狀結構，具有較好的傳 質性能。因此，本發明提供的固定的微生物體系檢測水體毒性過程中活性較好，可W重復應 用于水體毒性檢測，檢測效果較好。
[0195] W上所述的僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術 人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可W做出若干改進和潤飾，運些改進和潤飾也 應視為本發明的保護范圍。
【主權項】
1. 一種固定的微生物體系，包括： 微生物載體，所述微生物載體由植物組織碳化制備得到； 附著于所述微生物載體表面的微生物。2. 根據權利要求1所述的固定的微生物體系，其特征在于，所述植物組織包括絲瓜瓤、 蔥白或洋蔥。3. 根據權利要求1所述的固定的微生物體系，其特征在于，所述微生物為BODseed混合 菌培養后得到的微生物。4. 一種固定的微生物體系的制備方法，包括： 將微生物附著于微生物載體表面，得到固定的微生物體系;或 在微生物載體表面原位培養微生物，得到固定的微生物體系； 所述微生物載體由植物組織碳化制備得到。5. 根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述碳化的溫度為150°C~250°C ; 所述碳化的時間為3小時~9小時。6. 根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述原位培養微生物的溫度為20°C~55 °C； 所述原位培養微生物的時間< 200小時。7. -種水體毒性的檢測方法，其特征在于，采用固定的微生物體系進行水體毒性檢測； 所述固定的微生物體系為權利要求1~3中任意一項所述的固定的微生物體系。8. 根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述水體毒性的檢測方法具體為： 將背景溶液、營養液和毒性溶液依次循環通入固定的微生物體系，所述背景溶液的通 入時間大于營養液的通入時間，所述營養液的通入時間和毒性溶液的通入時間相同； 采用電化學方法測試背景溶液、營養液和毒性溶液分別通入固定的微生物體系后，固 定的微生物體系產生的電化學信號，分別記為背景溶液電化學信號、營養液電化學信號和 毒性溶液電化學信號； 根據營養液電化學信號和毒性溶液電化學信號之間的差值得到毒性溶液的毒性； 所述背景溶液用于穩定和恢復固定的微生物體系中微生物的活性； 所述營養液為固定的微生物體系中的微生物提供營養物質； 所述毒性溶液為含有毒性物質的營養液。9. 根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述背景溶液的通入時間為1分鐘~200分 鐘； 所述營養液和毒性溶液的通入時間為1分鐘~30分鐘。10. 根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述毒性溶液中的毒性物質為有毒重金 屬離子。
【文檔編號】C12N11/14GK106047849SQ201610344913
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月23日
【發明人】翟俊鋒, 劉玲, 余登斌, 董紹俊
【申請人】中國科學院長春應用化學研究所