一種利用海鞘共附生桔青霉Asc2?4發酵制備富含γ?亞麻酸的油脂的方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用海鞘共附生桔青霉（Penicillium citrinum）Asc2?4發酵制備富含γ?亞麻酸的油脂的方法。具體是將海鞘共附生桔青霉Asc2?4接種于發酵培養基，在有氧條件下發酵，獲得桔青霉菌絲體，然后從菌絲體中提取富含γ?亞麻酸的油脂；所述海鞘共附生桔青霉菌Asc2?4于2016年7月16日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為GDMCC NO：60059。該方法培養基容易獲得，發酵條件穩定、工藝簡單，產量高，所得油脂中不飽和脂肪酸油脂含量很高，尤其是γ?亞麻酸，該γ?亞麻酸油脂可以用于食品藥品和化妝品等的生產，用途廣泛，具有很好的推廣應用前景。GDMCC NO：6005920160716
【專利說明】
一種利用海鞘共附生桔青霉Asc2-4發酵制備富含γ -亞麻酸的油脂的方法
技術領域
[0001]本發明屬于生物技術領域。更具體地，涉及一種利用海鞘共附生桔青霉ASC2-4發酵制備富含γ -亞麻酸的油脂的方法。
【背景技術】
[0002]海鞘是一種海洋生物，屬脊索動物門、尾索動物亞門、海鞘綱，在天然海區附著珍珠貝籠上生長。研究表明，海洋無脊椎動物共附生微生物平均每種動物達數百種，其密度高者占宿主動物總重量的40%，多數屬于難培養的微生物范疇。海鞘是營固著生活的動物，體外被一層類似植物纖維素的被囊象鞘一樣套著，是動物界獨一無二的。海鞘獨特的攝食、濾食系統使其體內、體表富集了大量的微生物]。與陸地微生物相比，海鞘共附生真菌能夠耐受海洋特有的高鹽、高壓、低氧、低光照等多種極端條件，因此形成了獨特的代謝和生理特性，產生了不同化學結構的代謝產物，為人類提供了陸地微生物所不能提供的活性代謝產物。這些活性物質具有抗菌、抗腫瘤、抗病毒、降血壓、凝血和溶血等生物活性，成為開發海洋藥物資源的重要內容之一。
[0003]微生物油脂(microbialoils)，是由酵母、霉菌、細菌和藻類等微生物在一定條件下利用碳源、氮源、輔以無機鹽生產的油脂。霉菌作為一類主要的產脂真菌如深黃被孢霉、高山被孢霉和拉曼被孢霉等，油酸、棕櫚酸、亞油酸含量較高，其他多不飽和脂肪酸如亞麻酸、花生酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸等存在于經過誘變的菌株中，脂肪酸成分和含量有很大不同。不飽和脂肪酸因具有重要的生理功能和較高經濟價值已經成為當今產油脂微生物定向育種的發展方向。
[0004]γ -亞麻酸(GLA)分子式為C18H3qO2，化學名6，9，12-十八碳三烯酸，為無色油狀液體，是人體的一種必需脂肪酸，在人體內可以由亞油酸轉化而來。γ-亞麻酸是組成人體各組織生物膜的結構材料，也是合成前列腺素的前體。另有研究表明，γ -亞麻酸可抑制人肝癌細胞生長。抑制人結腸癌、胃癌和胰癌細胞DNA的合成，γ -亞麻酸加Fe(II)對治療乳腺癌效果顯著。目前商業上多不飽和脂肪酸尤其是ω-3多不飽和脂肪酸主要從深海魚油中提取，高等植物和動物中很少含有ω-3多不飽和脂肪酸，其生產工藝復雜、成本高、穩定性差，還受到氣候條件和資源的限制。
[0005]而微生物中含量豐富，并且微生物具有適應性強、生長繁殖迅速、生長周期短、易培養、不受原料產地限制等特點。若體內的γ-亞麻酸合成受阻，會引起生理不調、血脂血壓升高、糖尿病、風濕癥、皮膚老化等多種疾病。目前已經發現的高產γ-亞麻酸菌株有雅致枝霉(Thamnidium卷枝毛霉(Mucor ci_rci/3e_/_/oic/es,、深黃被抱霉(MortierellaisaAeHi/ja」等。張玲等報道對雅致枝霉AS3.3456進行5-氟尿啼啶、紫外線、氯化鋰復合誘變得到TE7-15，γ -亞麻酸產量達到1079.95mg/L，滿足工業化生產的要求。咸漠等用硫酸二乙酯對深黃被孢霉進行化學誘變獲得變異株XM-1，其菌體生物量為15.1g /L，油脂量為
7.5g。針對高產GLA菌株的篩選和定向育種已成為近年來研究熱點。因此，利用微生物生產多不飽和脂肪酸是一條重要途徑，尋求高產菌株和研究發酵工藝，正成為主要的研究方向。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是克服上述現有技術的缺陷和不足，提供一株新的菌株海鞘共附生桔青霉Asc2_4在制備γ -亞麻酸方面的應用。
[0007]本發明的另一目的是提供一種利用海鞘共附生桔青霉Asc2_4發酵制備γ-亞麻酸的方法，具體是以馬鈴薯打漿液為主要的發酵培養基原料，并在發酵培養基中添加少量的葡萄糖、酵母膏以及無機鹽，然后將上述桔青霉Asc2-4接入發酵培養基中進行有氧發酵獲得菌絲體，最后酸熱法提取菌絲體中的γ-亞麻酸油脂。該方法培養基容易獲得，發酵條件穩定、工藝簡單，產量高，所得γ-亞麻酸油脂用途廣泛。
[0008]本發明上述目的通過以下技術方案實現:
海鞘共附生桔青霉Asc2-4在制備不飽和脂肪酸油脂方面的應用。
[0009]優選地，所述不飽和脂肪酸油脂為γ-亞麻酸。
[0010]一種利用海鞘共附生桔青霉ASC2-4發酵制備富含γ-亞麻酸的油脂的方法，是將海鞘共附生桔青霉菌Asc2-4接種于發酵培養基，在有氧條件下發酵，獲得桔青霉菌絲體，然后從菌絲體中提取富含γ -亞麻酸的油脂。
[0011]其中，所述海鞘共附生桔青霉Asc2-4于2016年7月16日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為GDMCC Ν0:60059。
[0012]該菌株是以馬鈴薯葡萄糖培養基從海鞘內臟分離純化得到的高產γ-亞麻酸的絲狀真菌。
[0013]所述海鞘共附生桔青霉Asc2_4的形態特征描述如下:
該菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上培養2 d后在100倍的油鏡下觀察，無菌核，菌絲體有隔，孢梗莖無色壁光滑，帚狀枝兩輪生或三輪生，偶見單輪生，瓶梗安瓿形，7.2?9.8 X1.8?5.2 μπι，梗頸較短。分生孢子壁光滑，球形、近球形或卵形，呈鏈狀，1.2?3.1 X 1.1?3.5 Um0
[0014]該菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上28°C培養4 d，直徑13 mm，培養7 d，直徑40mm，菌落表面平坦中間有輕微褶皺突起，邊緣呈現不規則的形狀，表面質地呈絨狀中間帶輕微絮狀;表面產生大量的灰綠色的分生孢子，菌絲體白色，沒有滲出液或可溶性色素;菌落反面呈黃色或淡黃色，反面中間輕微凹陷。
[0015]進一步地，提取Asc2-4菌株的DNA，選用ITS4、ITS5引物進行PCR擴增并純化PCR產物，測得該菌株ITS序列，分子鑒定結果顯示，該菌株屬于桔青霉(PaoiciDit? citrinim)。
[0016]另外，在上述利用海鞘共附生桔青霉Asc2_4發酵制備γ-亞麻酸的方法中，所述發酵培養基的主要成分為馬鈴薯打漿液，以及少量的葡萄糖、酵母膏和無機鹽。
[0017]優選地，所述發酵培養基的配方為:每升發酵培養基中含有土豆200?250g、酵母膏0.4?0.6g、磷酸二氫鉀I?3g、硫酸銨I?3g、檸檬酸鈉0.05?0.2g，70%海水定容。
[0018]更優選地，所述發酵培養基的配方為:每升發酵培養基中含有土豆200?250g、酵母膏0.50g、磷酸二氫鉀2.00g、硫酸銨2.00g、檸檬酸鈉0.1Og，70%海水定容。
[0019]更優選地，所述發酵培養基的配制方法為:將土豆洗凈之后加入70%海水，打漿，過濾，液體沉淀2?3h，除去土豆渣和淀粉，然后加入酵母膏、磷酸二氫鉀、硫酸銨和檸檬酸鈉，70%海水定容;pH自然;滅菌條件:121°C，20min。
[0020]其中，所述70%海水是指體積比為7:3的海水和蒸餾水的混合水。
[0021]另外，上述的方法中，所述在有氧條件下發酵的具體條件為:接種量為5?10%，pH為6，溫度為28°C，時間為6?7d。
[0022]優選地，所述從菌絲體中提取富含γ-亞麻酸的油脂的具體方法如下:
利用酸熱法提取油脂:菌絲體培養結束后，進行固液分離，然后將菌絲體烘干，粉碎進行破壁處理，得到干菌體;然后添加鹽酸，室溫放置，再于沸水浴加熱后，速冷，重復2?3次；最后加入氯仿-甲醇混合液，充分振蕩后離心，揮發除去氯仿即得油脂。所得油脂中富含γ-亞麻酸，含量高達23.20%，約占其不飽和脂肪酸的24.50% O
[0023]優選地，所述干菌體和鹽酸的質量體積比為0.5?2g:5?7mL，所述鹽酸的濃度為3?5 mol/L。
[0024]更優選地，所述干菌體和鹽酸的質量體積比為lg:6mL，所述鹽酸的濃度為4.00mol/L。
[0025]優選地，所述室溫放置的時間為20?40min。
[0026]更優選地，所述室溫放置的時間為30min。
[0027]優選地，所述沸水浴加熱的時間為8?15min。
[0028]更優選地，所述沸水浴加熱的時間為lOmin。
[0029]優選地，所述速冷是-20°C速冷。
[0030]優選地，所述氯仿-甲醇混合液中，氯仿和甲醇的體積比為I?3:0.5?1.5。
[0031]更優選地，所述氯仿-甲醇混合液中，氯仿和甲醇的體積比為2:1。
[0032]優選地，所述氯仿-甲醇混合液的體積是干菌體鹽酸溶液的2倍。
[0033]優選地，所述離心是2000 r/min條件下離心10?15min。
[0034]另外，優選地，所述海鞘共附生桔青霉菌Asc2_4在接種于發酵培養基進行發酵培養之前，還需先經過菌種活化、種子液制備的步驟，再將種子液接種于發酵培養基進行發酵培養。
[0035]優選地，所述菌種活化是將保存的菌株移接至馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基上，于25°C培養5天。
[0036]優選地，所述種子液制備是將菌種制成孢子懸浮液，接種于種子培養基中進行培養，種子培養基為馬鈴薯葡萄糖培養基，接種量為3%，pH為5.5?6.5，培養溫度為28°C，培養時間為2d。
[0037]更具體地，作為一種優選的可實施方案，上述利用海鞘共附生桔青霉菌Asc2_4發酵制備γ -亞麻酸的方法包括如下步驟:
(1)菌種活化(固體菌種培養):
將由凍干管或者沙土管保存的菌株移接至馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基上，于25°C培養5天，進行菌種活化；
(2)種子液制備(液體菌種培養):
將斜面菌種制成孢子懸浮液，接種于種子培養基中培養，種子培養基為馬鈴薯葡萄糖培養基，接種量為3%，pH為5.5?6.5，培養溫度為28°C，培養時間為2d;
(3)發酵培養 I)發酵培養基制備:按照每升發酵培養基中200?250g馬鈴薯的比例，準確稱取馬鈴薯，洗凈之后加入450?500mL無菌70%海水，利用土豆打漿機或攪拌機打漿，將打漿液用4層紗布擠壓過濾，液體沉淀2?3h，除去土豆渣和淀粉，然后加入酵母膏0.50 g，磷酸二氫鉀2.0Og,硫酸銨2.0Og，檸檬酸鈉0.1Og, 70%海水定容至IL; pH自然;滅菌條件:121°C，20min。
[0038]2)發酵培養:按照5?10%的接種量，將生長良好的種子液接入發酵培養基中培養，pH為6，發酵培養溫度為28 °C，培養時間為6?7d。
[0039](4)油脂提取:
I)菌絲體培養結束后，用抽濾栗進行固液分離，然后用沸騰干燥機進行菌絲體烘干，粉碎進行破壁處理，得到干菌體。
[0040]2)然后每1.00 g干菌體添加4.00 mol/L的鹽酸6.0OmL，室溫下放置30 min后，再于沸水浴加熱10 min，-20°C速冷，以此重復2?3次。之后加入2倍體積的氯仿-甲醇(2:1，V/V)混合液，充分振蕩，2000 r/min條件下離心10?15 min，揮發除去氯仿即得油脂。
[0041]本發明具有以下有益效果:
本發明從海鞘內臟分離得到的海鞘共附生桔青霉Asc2-4，生長速度快，生命力頑強，可用于生產γ-亞麻酸油脂。
[0042]將所述的桔青霉Asc2_4在有氧條件下發酵獲得桔青霉菌絲體，然后利用酸熱法從菌絲體中提取富含γ-亞麻酸的油脂，所得油脂中γ-亞麻酸含量很高，可以到達20%以上，該γ -亞麻酸油脂可以用于食品藥品和化妝品的生產。
[0043]本方法所用發酵培養基主要成分為馬鈴薯打漿液，成本低廉，培養基容易獲得，發酵條件穩定，工藝簡單，具有很好的推廣應用前景。
【附圖說明】
[0044]圖1為Asc-2-4菌株的形態;其中，A-B= PDA培養基上培養7 d的菌落;C_E:分生孢子梗;F:分生孢子;標尺=1 Ομπι。
[0045]圖2為本發明利用海鞘共附生真菌桔青霉Asc2_4發酵制備的油脂中的成分分析結果O
【具體實施方式】
[0046]以下結合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發明，但實施例并不對本發明做任何形式的限定。除非特別說明，本發明采用的試劑、方法和設備為本技術領域常規試劑、方法和設備。
[0047]除非特別說明，以下實施例所用試劑和材料均為市購。
[0048]實施例1海鞘共附生真菌桔青霉Asc2_4的分離和鑒定
1、菌株分離
(I)樣品:海鞘，采自廣東省雷州市流沙蝦塘。
[0049]取海鞘內臟10g，用均質機均質后，放入90mL無菌海水中，充分震蕩混勻。再用無菌海水分別按10—2?10—6稀釋涂布于固體培養基，28°C培養24?72h，分離得到單菌落。
[0050]上述單菌落進一步接種于液體種子培養基，28°C搖床培養72h，顯微鏡觀察菌絲中脂肪粒，選擇菌絲中脂肪粒較多的菌株接種于發酵培養基中28°C搖床培養144h，然后抽濾烘干發酵好的菌絲體，酸熱法提取菌絲體中的油脂，并用氣相色譜儀測定油脂中γ-亞麻酸含量，選擇γ -亞麻酸含量最高的菌株，作為本發明的菌種。
[0051]其中，所述固體培養基即為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基，配方為:馬鈴薯150g，葡萄糖15g，瓊脂15g，70%海水100mL，自然pH ；滅菌條件:121°C，20min。
[0052]所述液體種子培養基:馬鈴薯150g，葡萄糖15g，70%海水100mL，自然pH;滅菌條件:12rC，20min。
[0053]所述發酵培養基的配制方法為:稱取去皮的新鮮土豆200?250g，攪拌機攪拌打碎成漿;4層紗布擠壓過濾，將液體沉淀3 h，去除淀粉定容至I L;然后添加葡萄糖110 g，酵母膏0.50 g，磷酸二氫鉀2.0Og，硫酸銨2.0Og，檸檬酸鈉0.1Og, 70%的人工海水，加海水補足1000mL，pH 自然;滅菌條件:121°C，20min。
[0054](2)上述得到的γ -亞麻酸含量最高的菌株，利用固體斜面培養基4°C保存。
[0055]2、形態鑒定
上述γ -亞麻酸含量最高的菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上培養2d后在100倍的油鏡下觀察，無菌核，菌絲體有隔，孢梗莖無色壁光滑，帚狀枝兩輪生或三輪生，偶見單輪生，瓶梗安瓿形，7.2-9.8 X 1.8-5.2 μπι，梗頸較短。分生孢子壁光滑，球形、近球形或卵形，呈鏈狀，I.2_3.I X I.1_3.5 μπ?ο
[0056]該菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上28°C培養3?4d，直徑13 mm;培養7d，直徑40mm，菌落表面平坦中間有輕微褶皺突起，邊緣呈現不規則的形狀，表面質地呈絨狀中間帶輕微絮狀;表面產生大量的灰綠色的分生孢子，菌絲體白色，沒有滲出液或可溶性色素;菌落反面呈黃色或淡黃色，反面中間輕微凹陷(如附圖1所示)。
[0057]根據形態描述判斷該菌株為青霉屬。
[0058]3、分子鑒定
提取上述γ-亞麻酸含量最高的菌株的DNA，選用ITS4、ITS5引物進行PCR擴增并純化PCR產物，測得該菌株的ITS序列，并以ITS序列進行分子鑒定，結果顯示，該菌株屬于桔青霉(.Penicillium ciiri/??)，命名為桔青霉菌Asc2_4，并于2016年7月16日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為GDMCC N0:60059，保藏地址是廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓。
[0059]實施例2利用海鞘共附生真菌桔青霉Asc2_4發酵制備γ-亞麻酸油脂
1、利用海鞘共附生真菌桔青霉Asc2-4發酵制備γ -亞麻酸油脂的方法，包括如下步驟:
(1)菌種活化(固體菌種培養):
將由凍干管或者沙土管保存的菌株移接至馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基上，于25°C培養5天，進行菌種活化；
(2)種子液制備(液體菌種培養):
將斜面菌種制成孢子懸浮液，接種于種子培養基中進行培養，種子培養基為馬鈴薯葡萄糖培養基，接種量為3%，pH為5.5?6.5，培養溫度為28°C，培養時間為2d;
(3)發酵培養
I)發酵培養基制備:按照每升發酵培養基中200?250g馬鈴薯的比例，準確稱取馬鈴薯，洗凈之后加入450?500mL無菌70%海水，利用土豆打漿機或攪拌機打漿，將打漿液用4層紗布擠壓過濾，液體沉淀2?3h，除去土豆渣和淀粉，然后加入酵母膏0.50 g，磷酸二氫鉀2.0Og，硫酸銨2.0Og，檸檬酸鈉0.1Og, 70%海水定容至IL; pH自然;滅菌條件:121°C，20min。
[0000] 2)發酵培養:按照5?10%的接種量，將生長良好的種子液接入三角瓶中培養，500mL三角瓶裝200mL發酵培養基，pH為6，發酵培養溫度為28°C，搖床培養，轉速180 rpm，培養時間為6?7d。
[0061](4)油脂提取(酸熱法):
I)菌絲體培養結束后，用抽濾栗進行固液分離，然后用沸騰干燥機進行菌絲體烘干，粉碎進行破壁處理。
[0062]2)然后每1.00 g干菌體添加4.00 mol/L的鹽酸6.0OmL，室溫下放置30 min后，再于沸水浴加熱10 min，-20°C速冷，以此重復2?3次。之后加入2倍體積的氯仿-甲醇(2:1，V/V)混合液，充分振蕩，2000 r/min條件下離心10?15 min，揮發除去氯仿即得油脂。
[0063]2、經過測定，海鞘共附生真菌桔青霉Asc2_4中油脂含量為20.70%，油脂中不飽和脂肪酸含量高達93.9%，其中y-C18:3( γ )亞麻酸、C16:1棕櫚一稀酸和C18:1油酸所占比例最大，尤其是γ -C18:3( γ )亞麻酸達到23.2%，約占其不飽和脂肪酸總量的24.5%，可作為選育高產γ -亞麻酸的優良菌種，具有良好的開發應用前景。具體在湛江市質量計量監督檢測所的檢測記錄如附圖2所示。
[0064]3、油脂測定
(I)油脂甲酯化:
直接稱取油脂0.05g于離心管中或在油脂中加5mL正己烷將油脂充分溶解，再加ImL的2mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液，加塞后猛烈振搖30s后放置至澄清。向溶液中加入約Ig硫酸氫鈉，猛烈振搖，中和氫氧化鉀。待鹽沉淀后，取上層液過0.45μπι濾膜待測。
[0065](2)氣相色譜測定γ-亞麻酸油脂
0.2g油脂加入皂化液(0.5 mol/L KOH-甲醇)2 mL，混勻，于60°C水浴皂化至油珠消失，冷卻后加入甲酯化液(14 %三氟化硼-甲醇)2mL，于60°C水浴甲酯化30min，冷卻后加入正己烷lmL，飽和氯化鈉lmL，離心后取上清夜，即可進行氣相色譜分析油脂組成。
[0066]柱子型號HXDT-FFAP(30mX0.32mmX0.25ym)，分流比:30:1;進樣口溫度:2500C ；檢測器溫度:260 0C ；進樣量:1.0yL ;升溫程序:開始溫度90 °C保持Imin，以5 °C /min上升至丨」240°(:，保持3011^11。
[0067]4、結論:
本發明制備的油脂成分中不飽和脂肪酸占93.90%。其中，十八碳烯酸含量最高為58.92%，其次是十六碳烯酸19.10%，尤其是γ -C18:3( γ )亞麻酸含量為23.20%，約占其不飽和脂肪酸的24.50%。
【主權項】
1.海鞘共附生桔青霉菌ASC2-4在制備不飽和脂肪酸油脂方面的應用。2.一種利用海鞘共附生桔青霉Asc2-4發酵制備富含γ -亞麻酸的油脂的方法，其特征在于，是將海鞘共附生桔青霉Asc2-4接種于發酵培養基，在有氧條件下發酵，獲得桔青霉菌絲體，然后從菌絲體中提取富含γ-亞麻酸的油脂;所述海鞘共附生桔青霉菌Asc2-4于2016年7月16日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為GDMCC Ν0:60059。3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述發酵培養基的主要成分為馬鈴薯打漿液，還包含有葡萄糖、酵母膏和無機鹽。4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述發酵培養基的配方為:每升發酵培養基中含有土豆200?250g、酵母膏0.4?0.6〖、磷酸二氫鉀1?3〖、硫酸錢1?3〖、梓檬酸鈉0.05?0.2g，70%海水定容。5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述發酵培養基的配制方法為:將土豆洗凈之后加入70%海水，打漿，過濾，液體沉淀2?3h，除去土豆渣和淀粉，然后加入酵母膏、磷酸二氫鉀、硫酸銨和檸檬酸鈉，70%海水定容;pH自然;滅菌條件:121°C，20min。6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，在有氧條件下發酵的具體條件為:接種量為5?10%，pH為6，溫度為28°C，時間為6?7d。7.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述從菌絲體中提取富含γ-亞麻酸的油脂的方法是酸熱法，具體步驟如下:菌絲體培養結束后，進行固液分離，然后將菌絲體烘干，粉碎進行破壁處理，得到干菌體;然后添加鹽酸，室溫放置，再于沸水浴加熱后，速冷，重復2?3次;最后加入氯仿-甲醇混合液，充分振蕩后離心，揮發除去氯仿即得油脂。8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，步驟SI中所述干菌體和鹽酸的質量體積比為0.5?2g:5?7mL，所述鹽酸的濃度為3?5 mol/L。9.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，步驟SI中所述室溫放置的時間為20?40m i η;所述沸水浴加熱的時間為8?15m i η。10.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，步驟SI中所述氯仿-甲醇混合液中，氯仿和甲醇的體積比為I?3:0.5?1.5。
【文檔編號】C12R1/80GK106047956SQ201610640842
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月5日 公開號201610640842.2, CN 106047956 A, CN 106047956A, CN 201610640842, CN-A-106047956, CN106047956 A, CN106047956A, CN201610640842, CN201610640842.2
【發明人】雷曉凌, 鐘敏, 聶芳紅, 柴慧子, 劉喚明
【申請人】廣東海洋大學