專利名稱：一株高產核酸酶p1的桔青霉菌及其選育方法
技術領域：
本發明屬于微生物誘變技術領域，涉及一種高產核酸酶P1的桔青霉菌及利用離子束注入誘變手段選育該桔青霉菌的方法。
背景技術：
從桔青霉發酵液中獲得的核酸酶P1是一種能夠水解RNA獲得四種5’一核苷酸的磷酸二酯酶。5’-核苷酸已廣泛應用于食品、生化工業以及制藥工業。在食品行業中，已經由最初的食品助鮮劑，擴展為具有提高生物體免疫功能的功能性食品添加劑，可以添加在面包、餅干等食品中，尤其在嬰幼兒食品中的使用效果非常明顯，能夠有效增強嬰幼兒抵抗細菌性痢疾的能力，減少腹瀉的發生；在醫藥領域，5’-核苷酸不但能夠作為藥物使用，而且還是許多抗病毒抗腫瘤藥物的生產原料；此外，核苷酸制劑還可以作為動植物生長調節劑，有著明顯的增產、增重功效。
核苷酸生產主要采取三種方法化學合成法、微生物發酵法及酶解法。酶解法由于降解RNA可以一次得到四種核苷酸的混合物，且酶反應收率較高，國內外工業化生產核苷酸均采用此法。在酶解法制備核苷酸中由桔青霉經液體深層發酵生產核酸酶P1，其酶解產物雜質少后續分離工藝簡單，國外一般采用該方法進行核苷酸的生產。
桔青霉(Penicillium citrinum)屬于不對稱青霉組，絨狀青霉亞組，桔青霉系。國內桔青霉菌株一般采用紫外誘變和亞硝基胍等方法進行誘變選育。陳信波(湖南農業大學學報，1995，21(4)382-385)等采用紫外誘變法，酶活為500u/ml。洪亦武等(江西科學，1995，13(4)，224-228)采用亞硝基胍和紫外復合誘變，菌株致死率大于90％，最終酶活為345u/ml。李科德等(微生物雜志，2001，21(3)28-30)采用紫外誘變與亞硝基胍多次誘變，優化后酶活為1329u/ml。
離子束注入技術作為一種生物品種改良的新技術已在誘變育種、植物轉基因、生命起源和進化以及環境輻射與人類健康等方面取得了一些重要研究成果。在微生物誘變育種的研究中，離子束注入已廣泛用于對微生物菌種誘變育種，并取得了良好效果。離子束注入與傳統誘變源相比，除了具有能量沉積效應外，還有動量傳遞、質量沉積及電荷的中和與交換效應，是一種將物理誘變和化學誘變特性集于一身的綜合誘變方法，能夠在低劑量注入、細胞損傷較輕的情況下，誘發強烈地影響生物細胞的生理、生化性能，造成遺傳物質的基本單位-堿基的改變，誘發染色體結構變異(余增亮物理1997，26(6)333-338)。趙洪英(天津理工學院學報，2001，17(1)14-17)等用N+離子注入慶大霉素產生菌成熟孢子，經篩選得到的菌株產抗生素能力提高27.39％。王紀(微生物學雜志，1998，18(4)25-28)等通過離子注入誘變篩選得到一株遺傳性能穩定的高產菌，得率較出發菌株提高55％～60％。將離子注入誘變技術應用于桔青霉生產核酸酶P1方面未見相關專利和文獻報道。
發明內容
本發明目的是提供一株高產核酸酶P1的桔青霉菌。
本發明的另一個目的是提供一種利用低能離子束注入誘變手段選育該桔青霉菌的方法。
本發明的目的是通過如下技術方案實現的一種高產核酸酶P1的菌株，其分類命名為桔青霉(Penicillium citrinum)，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No.2014。
所述菌株的選育方法，該方法是對桔青霉孢子進行低能離子束注入，然后將誘變后的孢子轉接于平板培養基中培養，挑選單個菌株轉接于麥芽汁斜面培養，后經液體發酵培養，篩選出產核酸酶P1酶活高的菌株。
所述菌株的選育方法，其中需采用低能離子束注入誘變的桔青霉孢子是取麥芽汁斜面培養的桔青霉孢子用無菌水稀釋制成103～108孢子懸浮液，將0.005～1ml濃度的孢子懸浮液分裝于玻璃表面皿中，無菌干燥0.5～2h。
所述菌株的選育方法，其中低能離子為N+、Ar+、O6+或C6+。
所述菌株的選育方法，其中離子注入機靶室內真空度為2×10-2～2×10-8，注入能量為0.1kev～1000kev，劑量為5～500×1013ions·cm-2·s-1。
所述菌株的選育方法，其中經誘變后的孢子懸浮液經無菌水稀釋10～1000倍后，取0.01～1.0ml涂布于PDA平板培養基中28～32℃培養5～10d，然后轉接于麥芽汁培養基斜面上培養5～10d。
所述菌株的選育方法，其中液體發酵培養基組成及含量為葡萄糖0.5～50g，蛋白胨0.05～5g，磷酸二氫鉀0.01～5g，磷酸氫二鉀0.01～5g，硫酸鎂0.01～5g，氯化鈣0.01～5g，定容至1L，pH5～7。
本發明的有益效果本發明采用低能離子束注入的方法對產核酸酶P1的桔青霉菌株進行誘變，與其他誘變方法相比具有一下優點1.由于離子束注入誘變是一種集物理和化學誘變特征于一體的綜合誘變，具有對生物細胞損傷小的特點，因此采用該法誘變的菌株正突變率高，誘變效果好。
2.采用本發明方法選育出的高產核酸酶P1的桔青霉菌株(保藏號為CGMCCNo.2014)，具有高產性狀穩定，不易丟失的優點，經過30代以上轉接，酶活還能保持篩選后的水平。
3.采用本發明誘變篩選的菌株在3噸發酵水平發酵，所產的核酸酶P1的酶活仍能保持較高水平，說明該法篩選的菌株有利于大規模工業生產。
菌株保藏信息本發明公開的高產核酸酶P1的菌株，編號為YL104，其分類命名為桔青霉(Penicillium citrinum)，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址北京市海淀區中關村北一條13號，中國科學院微生物研究所)，保藏號CGMCC No.2014。保藏日期為2007年4月20日。
具體實施例方式
以下通過實施例對本發明作進一步的描述。
實施例1取經斜面培養的桔青霉孢子，用無菌水制成105孢子懸浮液，將0.2ml孢子懸浮液分裝于玻璃表面皿中，無菌干燥1h，將待處理的含菌培養皿放入離子注入機內進行連續式N+離子注入，靶室內真空度為5×10-5Pa，注入能量為30kev，劑量為50～500×1013ions·cm-2·s-1。然后將經誘變后的孢子懸浮液經無菌水稀釋100倍后，取0.05ml涂布于PDA平板培養基中28～32℃培養7～10d，從中挑選純菌株在麥芽汁斜面培養5～10d后分別轉接于裝25ml液體發酵培養基(組分葡萄糖40g，蛋白胨4g，磷酸二氫鉀0.06g，磷酸氫二鉀0.06g，硫酸鎂0.06g，氯化鈣0.04g，定容至1L，pH5～7)的250ml搖瓶中，于28～32℃，250rpm搖床中培養24h，過濾去除菌體，測定發酵液中核酸酶P1的酶活。經過4批次的誘變篩選，突變株正突變率56.9～63.9％，酶活單位比原始菌株提高3.6～5.2倍，結果見表1。
表1
其中酶活測定方法取甲乙兩支試管，分別加5％核酸溶液1mL和0.8mL的0.2mol/L，pH為5.0的醋酸鹽緩沖液，68℃預熱10min，然后甲管加入0.2mL的酶液，繼續保溫15min后，甲乙兩管再分別加入2mL的過氯酸試劑，乙管再補加0.2mL的酶液，兩管靜置10min后，離心取上清液0.1mL加7.9mL蒸餾水，混勻，再稀釋一定的倍數測OD260的值。
酶活計算公式酶活(u/ml)＝(OD260甲-OD260乙)×80×稀釋倍數×5將誘變后獲得的酶活為5157u/ml一株菌株在麥芽汁斜面中進行30代轉接培養，經測定酶活高仍達5000u/ml，將該桔青霉菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.2014。
對此菌株進行三級放大發酵培養，驗證其大規模工業化應用價值。
一級種培養將保藏號為CGMCC No.2014的桔青霉菌進行斜面培養，斜面孢子用生理鹽水洗下接入三角瓶中，在無菌狀態下接入發酵罐中，種子培養基為葡萄糖40g/L，蛋白胨4g/L，磷酸二氫鉀0.06g/L，磷酸氫二鉀0.06g/L，硫酸鎂0.06g/L，氯化鈣0.04g/L，pH5～7，種子罐為30升外循環氣升式發酵罐，培養溫度28～30℃，罐壓1.0～1.5MPa，通氣量3.0～5.0m3/h，培養時間28～32h。
二級種子培養經上一級發酵的孢子用無菌壓縮空氣壓入發酵罐中，本級培養基為葡萄糖40g/L，蛋白胨4g/L，磷酸二氫鉀0.06g/L，磷酸氫二鉀0.06g/L，硫酸鎂0.06g/L，氯化鈣0.04g/L，pH5～7，二級種子罐為300升外循環氣升式發酵罐，培養溫度28～30℃，罐壓1.0～2.0MPa，通氣量20～25m3/h，培養時間28～32h。
發酵工序經第二級種子罐發酵的孢子用無菌壓縮空氣壓入發酵罐中，本級培養基為葡萄糖40g/L，蛋白胨4g/L，磷酸二氫鉀0.06g/L，磷酸氫二鉀0.06g/L，硫酸鎂0.06g/L，氯化鈣0.04g/L，pH5～7，發酵罐為3噸外循環氣升式發酵罐，培養溫度28～32℃，罐壓2.0～3.0MPa，通氣量70～80m3/h，培養時間28～32h。
發酵培養到達終點后，測定酶活為5800u/ml。說明該桔青霉菌株在3噸發酵水平發酵，所產的核酸酶P1的酶活仍能保持較高水平，具有大規模工業化應用價值。
權利要求
1.一種高產核酸酶P1的菌株，其分類命名為桔青霉(Penicillium citrinum)，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No.2014。
2.權利要求1所述菌株的選育方法，其特征在于該方法是對桔青霉孢子進行低能離子束注入，然后將誘變后的孢子轉接于平板培養基中培養，挑選單個菌株轉接于麥芽汁斜面培養，后經液體發酵培養，篩選出產核酸酶P1酶活高的菌株。
3.根據權利要求2所述菌株的選育方法，其特征在于需采用低能離子束注入誘變的桔青霉孢子是取麥芽汁斜面培養的桔青霉孢子用無菌水稀釋制成103～108孢子懸浮液，將0.005～1ml濃度的孢子懸浮液分裝于玻璃表面皿中，無菌干燥0.5～2h。
4.根據權利要求2所述菌株的選育方法，其特征在于低能離子為N+、Ar+、O6+或C6+。
5.根據權利要求2所述菌株的選育方法，其特征在于離子注入機靶室內真空度為2×10-2～2×10-8，注入能量為0.1kev～1000kev，劑量為5～500×1013ions·cm-2.s-1。
6.根據權利要求2所述菌株的選育方法，其特征在于經誘變后的孢子懸浮液經無菌水稀釋10～1000倍后，取0.01～1.0ml涂布于PDA平板培養基中28～32℃培養5～10d，然后轉接于麥芽汁培養基斜面上培養5～10d。
7.根據權利要求2所述菌株的選育方法，其特征在于液體發酵培養基組成及含量為葡萄糖0.5～50g，蛋白胨0.05～5g，磷酸二氫鉀0.01～5g，磷酸氫二鉀0.01～5g，硫酸鎂0.01～5g，氯化鈣0.01～5g，定容至1L，pH5～7。
全文摘要
本發明公開了一株高產核酸酶P1的桔青霉菌及其選育方法。該桔青霉菌已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No.2014。該菌株的選育方法是對桔青霉孢子懸浮液進行低能離子束注入，再將誘變后的孢子轉接于平板培養基中培養，挑選單個菌株轉接于麥芽汁斜面培養，后經液體發酵培養，篩選出產核酸酶P1酶活高的菌株。該菌株經30代以上傳代，得高產性狀穩定的菌株。本發明采用低能離子束注入的方法，誘變效果好，正突變率高，且操作安全，菌株經發酵產生的核酸酶P1的酶活提高了3～5倍，高產性狀穩定，不易丟失，經3噸發酵罐培養后酶活力仍能保持較高水平，適合大規模工業化生產。
文檔編號C12N15/55GK101067116SQ20071002293
公開日2007年11月7日 申請日期2007年5月25日 優先權日2007年5月25日
發明者應漢杰, 楊蘊毅, 賀沁婷, 張磊, 阮文輝 申請人:南京工業大學, 南京同凱兆業生物技術有限責任公司