一種從發酵液中提取和精制冠菌素的方法
【專利摘要】本發明公開了一種從發酵液中提取和精制冠菌素的方法。本發明提供了將含有冠菌素的發酵液用吸附劑吸附，得到冠菌素。本發明的實驗證明了，本發明的方法采用的吸附劑穩定性好、再生容易，對冠菌素的吸附率高、吸附快、生產周期短；工藝簡單，操作十分簡便，條件溫和，對冠菌素沒有破壞作用，溶劑皆可回收利用，成本低，適用于大規模工業生產。
【專利說明】
一種從發酵液中提取和精制冠菌素的方法
技術領域
[0001]本發明屬于生物化工領域，具體涉及一種從發酵液中提取和精制冠菌素的方法。
【背景技術】
[0002]冠菌素(Coronatine，以下簡稱C0R)是20世紀發現的一種由植物病原菌丁香假單胞菌致病變種產生的代謝產物。冠菌素具有多種調節植物生長的功能，如促進塊莖的形成與膨大，抑制種子的萌發與根的生長，促進果實脫落等。但是，傳統的方法從發酵液中提取冠菌素，操作繁瑣，純度低，不利于科學研究和農業生產應用，因此，提取和制備高純度冠菌素具有非常重要的意義。
【發明內容】
[0003]本發明的目的是提供一種從含有冠菌素的發酵液提取冠菌素的方法。
[0004]本發明提供的方法，包括如下步驟:用吸附劑對含有冠菌素的發酵液進行吸附純化，即得到冠菌素。
[0005]上述方法中，所述用吸附劑對含有冠菌素的發酵液進行吸附純化的方法包括如下步驟:
[0006]I)將含有冠菌素的發酵液與所述吸附劑混合，收集沉淀，得到吸附冠菌素的吸附劑；
[0007]2)用所述吸附劑對應的洗脫緩沖液對所述吸附冠菌素的吸附劑進行洗脫，收集吸附洗脫液，即為冠菌素。
[0008]上述方法中，所述吸附劑為硅膠、氧化鋁、活性炭、分子篩、聚合物吸附劑和生物吸附劑中的任一種或其中任意兩種或三種的組合。
[0009]上述方法中，所述吸附劑對應的吸附洗脫緩沖液為乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚、乙酸、甲醇和乙醇中的任一種或其中任意兩種或者三種的組合。
[0010]上述方法中，所述吸附劑為活性炭，其對應的吸附洗脫緩沖液為乙醇。
[0011]上述方法中，上述硅膠對應乙酸乙酯，上述分子篩對應二氯甲烷，上述活性炭對應乙醇，上述氧化鋁對應甲醇。
[0012]上述方法中，上述分子篩為鈉A型分子篩，上述氧化鋁為中性氧化鋁FCP。
[0013]上述方法中，步驟I)中，所述發酵液與所述吸附劑的加入配比為l-5g:1000L。
[0014]上述方法中，步驟2)中，所述洗脫緩沖液與所述吸附冠菌素的吸附劑的體積比為3-8:1。
[0015]上述方法中，步驟2)中，所述用吸附劑對應的洗脫緩沖液對吸附冠菌素的吸附劑進行洗脫為將所述用吸附劑對應的洗脫緩沖液浸泡所述吸附冠菌素的吸附劑2_6h，再洗脫。
[0016]上述方法中，步驟2)中，所述用吸附劑對應的洗脫緩沖液對吸附冠菌素的吸附劑進行洗脫為將所述用吸附劑對應的洗脫緩沖液浸泡所述吸附冠菌素的吸附劑3h，再洗脫。
[0017]上述方法中，所述混合的方式為10-1OOOrpm攪拌混合l-10h。
[0018]上述方法中，所述收集沉淀為在0-28°C、3000-10000g離心5-30min收集沉淀。
[0019]上述方法中，在所述吸附純化步驟后還包括如下層析純化的步驟:將所述吸附洗脫液經層析柱純化，用層析洗脫緩沖液洗脫，收集層析洗脫液，得到冠菌素。
[0020]上述方法中，在所述吸附純化步驟前還包括濃縮的步驟:將所述含有冠菌素的發酵液依次進行超濾和納濾，收集濾液。
[0021]上述方法中，所述吸附洗脫液和所述層析柱中介質的體積比為1:30-50。
[0022]上述方法中，所述介質為硅膠。
[0023]上述方法中，所述硅膠的粒徑為100-300目或200-300目。
[0024]上述方法中，所述層析洗脫緩沖液具體為如下I)或2):
[0025]I)將乙酸和乙酸乙酯-石油醚混勻，得到洗脫緩沖液，其中，乙酸在洗脫緩沖液中的體積百分含量為0.1-0.5%;乙酸乙酯-石油醚為將乙酸乙酯和石油醚按照體積比為2:1混合得到的混合液；
[0026]2)將乙酸和二氧甲烷-石油醚混勻，得到洗脫緩沖液，其中，乙酸在洗脫緩沖液中的體積百分含量為0.1-0.5%;二氧甲烷-石油醚為將二氧甲烷-和石油醚按照體積比為2:1混合得到的混合液；
[0027]上述方法中，或，所述超濾采用的膜的材質為聚醚砜樹脂，其截留分子量小于5000 ο
[0028]上述方法中，或，所述納濾采用的膜的材質為聚酰胺，其截留分子量為200-400。
[0029]上述方法中，在所述層析純化的步驟后還包括結晶的步驟:將所述層析洗脫液進行結晶，得到冠菌素晶體。
[0030]上述方法中，所述結晶所用的溶劑為乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、乙醇、丙酮和水中的一種，或者其中任意兩種或者三種的組合，所述結晶所用的溶劑具體為乙酸乙酯或丙酮溶液或甲醇。
[0031]上述方法中，所述丙酮溶液為丙酮和水按照體積比為5:1混合得到的混合液。
[0032]上述方法中，所述含有冠菌素的發酵液為丁香假單胞菌發酵液。
[0033]上述方法中，或，所述丁香假單胞菌為丁香假單胞大豆致病變種(Pseudomonas.syringae pv.glycinea)MW123CGMCC N0.1276。
[0034]由上述方法制備的冠菌素也是本發明保護的范圍。
[0035]上述所述冠菌素的純度大于等于99%。
[0036]本發明的實驗證明，本發明采用吸附劑分離冠菌素，穩定性好、再生容易，對冠菌素的吸附率高、吸附快、生產周期短;工藝簡單，操作十分簡便，條件溫和，對冠菌素沒有破壞作用，溶劑皆可回收利用，成本低，適用于大規模工業生產。
【附圖說明】
[0037]圖1為HPLC測定COR標樣(A)、COR粗提樣品(B)及純化后的COR樣品(C)的色譜圖。
【具體實施方式】
[0038]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0039]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0040]下述實施例中所用的活性炭購自溧陽市東南活性炭廠，型號為DN-868。
[0041 ] 硅膠購自上海市上邦實業有限公司，型號為ZCX Π，試劑級，300-400目。
[0042]鈉A型分子篩購自上海國藥集團化學試劑有限公司，產品編號20027761，CAS號70955-01-0，鈉A型(Φ3-5ι?πι)，球狀。
[0043]中性氧化鋁FCP購自上海國藥集團化學試劑有限公司，產品編號20002361，CAS號1344-28-1，200-300 目。
[0044]實施例1、含有冠菌素發酵液的制備
[0045]丁香假單胞大豆致病變種(Pseudomonas.syringae pv.glycinea)CGMCCN0.1276，在本文中命名為MW123，已于2004年12月21日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC %.1276(在如下專利中公開:21^200510011466.2)。
[0046]將MW123菌在GC培養基中發酵培養，得到含有冠菌素發酵液，具體操作如下:
[0047]1、種子液制備
[0048]在無菌條件下，用接種環從劃線培養基挑取活化好的菌體MW123，接入液體MG培養基中，28 °C，180rpm，培養3_4天，待菌體0D6QQ> 1.2，得到種子液。
[0049]2、冠菌素發酵
[0050]將上述I得到的種子液以體積百分含量2%的接種量接種于GC培養基(GC培養基中需加入經0.22μπι濾膜過濾滅菌的Km和Sm，Km終濃度為10yg/ml，Sm終濃度為30yg/ml)，18°C，180rpm，通氣量1:1(發酵液體積/空氣體積.min)，灌壓0.03MPa，培養10天(此時為pH降到最低值之后24h，C0R含量最高)，得到含有冠菌素的發酵液。
[0051 ] 上述GC培養基配方:
[0052]A液:甘油 18.6g，NH4Cl 1-OgjKH2PO4 4.1gjK2HPO4 3.6g,MgSO4.7H20 0.2g，KN030.3g，蒸飽水0.99L，pH 6.8，121 °C 滅菌30min。
[0053]B液:2mM FeCb 1ml，121 °C滅菌30min。
[0054]在無菌條件下，將上述A液、B液混合均勻，待液體冷卻后加入經0.22μπι濾膜過濾滅菌的Km和Sm，且Km終濃度為10yg/ml，Sm終濃度為30yg/ml。
[0055]實施例2、提純冠菌素
[0056]一、冠菌素的提取和純化
[0057]1、發酵液的濃縮
[0058]將實施例1獲得的含有冠菌素的發酵液經超濾膜(美國Koch濾膜公司，2538k328)過濾除去雜質微粒、菌體及蛋白質、核酸、色素等生)過濾除去雜質微粒、菌體及蛋白質、核酸、色素等生物大分子雜質，得到澄清的濾液;再將濾液經過納濾膜(美國Koch濾膜公司，2538sr3d)過濾，獲得冠菌素濃縮液。
[0059]上述超濾膜材質為聚醚砜樹脂，孔徑大小為0.0005-0.02μπι，截留分子量小于5000，操作條件為壓力小于8bar，流速I.2t/h ；
[0060]上述納濾膜材質為聚酰胺，孔徑大小為0.l-10nm，截留分子量為200-400，操作條件為壓力20bar，流速I.2t/h。
[0061 ] 2、吸附劑純化
[0062]將上述I制備的冠菌素濃縮液按照硅膠質量與冠菌素濃縮液體積的比值5g: 10001加入娃膠，攪拌混勾，攪拌速度為100rpm，時間為8h ； 3000g，O °C下離心收集沉淀，得到吸附冠菌素的硅膠；
[0063]將75L吸附冠菌素的硅膠裝入100L的中空玻璃柱(鄭州興華玻璃儀器廠)中，加入乙酸乙酯封住柱底浸泡3h，乙酸乙酯體積用量為硅膠體積的5倍，然后開放柱底開始自然流速洗脫，收集洗脫液，40°C，0.08MPA下旋蒸濃縮，收集濃縮液，即為吸附劑純化后冠菌素。
[0064]3、柱層析和結晶
[0065]將上述2制備的吸附劑純化后冠菌素流經硅膠柱純化，吸附劑純化后冠菌素與硅膠的體積配比為I: 30;用洗脫緩沖液洗脫，流速為lL/min，收集8個柱體積洗脫液，得到純化后冠菌素；
[0066]上述洗脫緩沖液按照如下方法配置:將乙酸和乙酸乙酯-石油醚混勻，得到洗脫緩沖液，其中，乙酸在洗脫緩沖液中的體積百分含量為0.1%;乙酸乙酯-石油醚為將乙酸乙酯和石油醚按照體積比為2: I混合得到的混合液。
[0067]將純化后冠菌素50g溶解在15mL乙酸乙酯中加熱回流(80攝氏度)，慢慢冷卻至室溫析出晶體，得到冠菌素晶體。
[0068]二、冠菌素的檢測
[0069]冠菌素濃度測定方法如下:
[0070](I)冠菌素標準曲線的建立
[0071]稱取冠菌素標準品0.005g(購自Sigma公司，精確至0.00002g)置于50mL容量瓶中配成母液(溶劑為甲醇)，分別稀釋至10011^凡、5011^凡、2511^凡、12.511^凡和6.2511^凡，用甲醇超聲溶解定容搖勻，過膜備用。
[0072](2)冠菌素待測樣品的配制
[0073]稱取試樣0.005g(精確至0.00002g)上述一制備的冠菌素晶體至50mL容量瓶中，用甲醇超聲溶解定容搖勻，過膜備用。
[0074](3)冠菌素測定
[0075]按以下色譜操作條件，待儀器基線穩定后，連續進數針標準樣品，至相鄰兩針的峰面積值相對變化在1.5%以內，按照標準溶液、試樣溶液、試樣溶液、標準溶液的順序進行測定。
[0076]HPLC 條件:
[0077].流動相:甲醇+0.5%乙酸水溶液= 70+30(V+V);
[0078]?流速:1.0mL/min;
[0079]?柱溫:3(TC;
[0080]?測定波長:220nm;
[0081]?進樣量:5.0yL;
[0082]?保留時間:冠菌素約為4.8min;
[0083](4)冠菌素濃度計算公式
[0084]將測得的三針試樣溶液中的冠菌素峰面積求平均值，帶入式(I)計算得冠菌素樣品含量:
[0085]y = 0.0372x-1.8614..................(I)
[0086]式中:
[0087]X—試樣溶液中冠菌素峰面積的平均值；
[0088]y—試樣溶液中冠菌素峰的濃度，mg/L。
[0089]收率=冠菌素晶體中冠菌素質量/發酵液中冠菌素的質量\100%
[0090]純度=(冠菌素晶體中冠菌素質量X50mL)/0.005gXl00%
[0091]結果如圖1所示。經過計算，冠菌素的收率為90%，冠菌素的純度為99.0%。
[0092]實施例3、精制冠菌素
[0093]一、冠菌素的提取和純化
[0094]1、發酵液的濃縮:將實施例1獲得的含有冠菌素的發酵液采用實施例2的方法濃縮，得到冠菌素濃縮液。
[0095]2、吸附劑純化
[0096]將上述I制備的冠菌素濃縮液按照鈉A型分子篩質量與冠菌素濃縮液體積的比值5g: 10001加入分子篩，攪拌混勾，攪拌速度為400rpm，時間為5h; 1000g，室溫下離心1min收集沉淀，得到吸附冠菌素的分子篩。
[0097]將75L吸附冠菌素的分子篩裝入100L中空玻璃柱中，加入二氯甲烷封住柱底浸泡3h，二氯甲烷體積用量為分子篩體積的3倍，然后開放柱底開始洗脫，收集洗脫液，40°C，
0.09MPA下旋蒸濃縮，收集濃縮液，即為吸附劑純化后冠菌素。
[0098]3、柱層析和結晶
[0099]將上述2制備的吸附劑純化后冠菌素流經硅膠柱純化，吸附劑純化后冠菌素與硅膠的體積配比為1:40;用洗脫緩沖液洗脫，流速為lL/min，收集8個柱體積洗脫液，得到純化后冠菌素；
[0100]上述洗脫緩沖液按照如下方法配置:將乙酸和二氯甲烷-石油醚混勻，得到洗脫緩沖液，其中，乙酸在洗脫緩沖液中的體積百分含量為0.5%； 二氯甲烷-石油醚為將二氯甲烷和石油醚按照體積比為2: I混合得到的混合液。
[0101]將純化后冠菌素10g溶解在50mL乙酸乙酯中，室溫打漿30min，抽濾得到冠菌素晶體。
[0102]二、冠菌素的檢測
[0103]與實施例1的相同，結果冠菌素的收率為80%，冠菌素的純度為99.3%。
[0104]實施例4、精制冠菌素
[0105]一、冠菌素的提取和純化
[0106]1、發酵液的濃縮:將實施例1獲得的含有冠菌素的發酵液采用實施例2的方法濃縮，得到冠菌素濃縮液。
[0107]2、吸附劑純化
[0108]將上述I制備的冠菌素濃縮液按照活性炭質量與冠菌素濃縮液體積的比值5g:10001加入活性炭，攪拌混勾，攪拌速度為400rpm，時間為10h; 3000g，室溫下離心1min收集沉淀，得到吸附冠菌素的活性炭。
[0109]將吸附冠菌素的活性炭裝入100L中空玻璃柱中，加入乙醇封住柱底浸泡3h，乙醇體積用量為活性炭體積的8倍，然后開放柱底開始洗脫，收集洗脫液，50°C，0.09MPA下旋蒸濃縮，收集濃縮液，即為吸附劑純化后冠菌素。
[0110]3、柱層析和結晶
[0111]將上述2制備的吸附劑純化后冠菌素流經硅膠柱純化，吸附劑純化后冠菌素與硅膠的體積配比為I: 50;用洗脫緩沖液洗脫，流速為lL/min，收集8個柱體積洗脫液，得到純化后冠菌素；
[0112]上述洗脫緩沖液按照如下方法配置:將乙酸和乙酸乙酯-石油醚混勻，得到洗脫緩沖液，其中，乙酸在洗脫緩沖液中的體積百分含量為0.5%;乙酸乙酯-石油醚為將乙酸乙酯和石油醚按照體積比為2: I混合得到的混合液。
[0113]將30g純化后冠菌素在50mL丙酮水溶液(丙酮和水按體積比丙酮:水=5:1混合的溶液)中打漿lh，抽濾得到冠菌素晶體。
[0114]二、冠菌素的檢測
[0115]與實施例1的相同，結果冠菌素的收率為85%，冠菌素的純度為99.8%。
[0116]實施例5、精制冠菌素
[0117]—、冠菌素的提取和純化
[0118]1、發酵液的濃縮:將實施例1獲得的含有冠菌素的發酵液采用實施例2的方法濃縮，得到冠菌素濃縮液。
[0119]2、吸附劑純化
[0120]將上述I制備的冠菌素濃縮液中按照中性氧化鋁FCP質量與冠菌素濃縮液體積的比值Ig: 10001加入氧化招，攪拌混勾，攪拌速度為600rpm，時間為lh; 10000g，0°C下離心收集沉淀，得到吸附冠菌素的氧化鋁。
[0121]將吸附冠菌素的氧化鋁裝入100L中空玻璃柱中，加入甲醇封住柱底浸泡4h，甲醇體積用量為氧化鋁體積的8倍，然后開放柱底開始洗脫，收集洗脫液，
[0122]450C，0.09MPA下旋蒸濃縮，收集濃縮液，即為吸附劑純化后冠菌素。
[0123]3、柱層析和結晶
[0124]將上述2制備的吸附劑純化后冠菌素流經硅膠柱純化，吸附劑純化后冠菌素與硅膠的體積配比為1:40;用洗脫緩沖液洗脫，流速為lL/min，收集8個柱體積洗脫液，得到純化后冠菌素；
[0125]上述洗脫緩沖液按照如下方法配置:將乙酸和乙酸乙酯-石油醚混勻，得到洗脫緩沖液，其中，乙酸在洗脫緩沖液中的體積百分含量為0.1%;乙酸乙酯-石油醚為將乙酸乙酯和石油醚按照體積比為2: I混合得到的混合液。
[0126]將純化后冠菌素50g溶解在15mL甲醇中加熱回流(65攝氏度)，慢慢冷卻至室溫析出晶體，抽濾得到冠菌素晶體。
[0127]二、冠菌素的檢測
[0128]與實施例1的相同，結果冠菌素的收率為83%，冠菌素的純度為99.5%。
[0129]現有的方法均是實施例2的一的I發酵液的濃縮，檢測冠菌素濃縮液的收率為80%，冠菌素的純度為20%。本發明是在膜濃縮的基礎上提高冠菌素的純度。
【主權項】
1.一種從含有冠菌素的發酵液提取冠菌素的方法，包括如下步驟:用吸附劑對含有冠菌素的發酵液進行吸附純化，即得到冠菌素。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于: 所述用吸附劑對含有冠菌素的發酵液進行吸附純化的方法包括如下步驟: 1)將含有冠菌素的發酵液與所述吸附劑混合，收集沉淀，得到吸附冠菌素的吸附劑； 2)用所述吸附劑對應的洗脫緩沖液對所述吸附冠菌素的吸附劑進行洗脫，收集吸附洗脫液，即為冠菌素。3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于:所述吸附劑為硅膠、氧化鋁、活性炭、分子篩、聚合物吸附劑和生物吸附劑中的任一種或其中任意兩種或三種的組合； 所述吸附劑對應的吸附洗脫緩沖液為乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚、乙酸、甲醇和乙醇中的任一種或其中任意兩種或者三種的組合； 或，所述分子篩為鈉A型分子篩，所述氧化鋁為中性氧化鋁FCP; 或，所述吸附劑為活性炭，其對應的吸附洗脫緩沖液為乙醇。4.根據權利要求2或3所述的方法，其特征在于: 步驟I)中，所述發酵液與所述吸附劑的加入配比為l-5g:1000L; 或，步驟2)中，所述洗脫緩沖液與所述吸附冠菌素的吸附劑的體積比為3-8:1; 或，步驟2)中，所述用吸附劑對應的洗脫緩沖液對吸附冠菌素的吸附劑進行洗脫為將所述用吸附劑對應的洗脫緩沖液浸泡所述吸附冠菌素的吸附劑2_6h，再洗脫。5.根據權利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于: 所述混合的方式為攪拌混合1-1Oh; 所述收集沉淀為在0-28°(:、3000-1000(^離心5-301^11收集沉淀。6.根據權利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于: 在所述吸附純化步驟后還包括如下層析純化的步驟:將所述吸附洗脫液經層析柱純化，用層析洗脫緩沖液洗脫，收集層析洗脫液，得到冠菌素； 或，在所述吸附純化步驟前還包括濃縮的步驟:將所述含有冠菌素的發酵液依次進行超濾和納濾，收集濾液。7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于: 所述吸附洗脫液和所述層析柱中介質的體積比為1:30-50; 或，所述介質為硅膠； 或，所述硅膠的粒徑為100-300目或200-300目； 或，所述層析洗脫緩沖液具體為如下I)或2): 1)將乙酸和乙酸乙酯-石油醚混勻，得到洗脫緩沖液，其中，乙酸在洗脫緩沖液中的體積百分含量為0.1-0.5%;乙酸乙酯-石油醚為將乙酸乙酯和石油醚按照體積比為2:1混合得到的混合液； 2)將乙酸和二氧甲烷-石油醚混勻，得到洗脫緩沖液，其中，乙酸在洗脫緩沖液中的體積百分含量為0.1-0.5%;二氧甲烷-石油醚為將二氧甲烷-和石油醚按照體積比為2:1混合得到的混合液； 或，所述超濾采用的膜的材質為聚醚砜樹脂，其截留分子量小于5000; 或，所述納濾采用的膜的材質為聚酰胺，其截留分子量為200-400。8.根據權利要求6或7所述的方法，其特征在于: 在所述層析純化的步驟后還包括結晶的步驟:將所述層析洗脫液進行結晶，得到冠菌素晶體； 所述結晶所用的溶劑為乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、乙醇、丙酮和水中的一種，或者其中任意兩種或者三種的組合，所述結晶所用的溶劑具體為乙酸乙酯或丙酮溶液或甲醇。9.根據權利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于: 所述含有冠菌素的發酵液為丁香假單胞菌發酵液； 或，所述丁香假單胞菌為丁香假單胞大豆致病變種(Pseudomonas.syr ingaepv.glycinea)CGMCC N0.1276。10.由權利要求1-9中任一所述方法制備的冠菌素。
【文檔編號】C07C235/82GK106083640SQ201610520942
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月5日
【發明人】段留生, 于春欣, 姜峰, 劉少金, 胡堂路, 于莎, 王春燕, 譚偉明, 李召虎
【申請人】中國農業大學