基于核酸恒溫擴增技術檢測汞離子的dna結構探針的制作方法
【專利摘要】基于核酸恒溫擴增技術檢測汞離子的DNA結構探針，包括含錯配位點并能通過核酸雜交構成三重雜交結構的三條DNA結構探針的核酸序列，三重雜交結構特點是：由汞離子觸發DNA探針結構雜交形成，在空間上隔了汞離子結合區域與聚合酶識別區域，利用聚合酶的快速聚合作用，在生物硫醇分子破壞汞離子與胸腺嘧啶作用前獲得可持續聚合的穩定結構，巧妙的回避了生物硫醇分子的干擾。該方法可有效消除微量汞離子在應用核酸恒溫方法檢測時由于生物硫醇分子的干擾而造成的損失，在不引入任何試劑的前提下，有效提高痕量汞離子的檢測效率，同時進一步提高核酸恒溫擴增技術在汞離子檢測中的應用。
【專利說明】
基于核酸恒溫擴増技術檢測汞離子的DNA結構探針
技術領域
[0001]本發明屬于生物技術領域汞離子的痕量檢測，特別涉及基于核酸恒溫擴增技術檢測汞離子的DNA結構探針。
技術背景
[0002]重金屬離子在環境中具有相當高的穩定性，且難以被微生物降解。它們一旦進入環境，很難被自然修復，而且能夠在生態系統中不斷富集和傳遞，即使微量攝入也會產生很大毒性，是生態平衡和人類健康的重大威脅。作為重金屬離子污染的典型代表，汞離子在生物組織內積累導致DNA損傷，影響配體-受體的相互作用，破壞免疫系統，引發一系列的疾病，如腦損傷，腎衰竭，各種認知和運動紊亂等。因此，環境中汞離子的定量檢測具有重要的研究價值和現實意義。
[0003]傳統的檢測汞離子檢測的方法有原子吸收/發射光譜、色譜層析法、電感耦合等離子體質譜、冷蒸汽原子熒光光譜、高效液相色譜法、陽極溶出伏安法等，但這些方法大多依賴于大型設備，實驗成本高，需要專業人員操作，且樣品的預處理過程繁瑣，這些都制約了這些方法在實際檢測中的廣泛應用。
[0004]近年來，基于功能化核酸進行檢測的方法得到廣泛的發展。核酸以其高穩定性，生物相容性，易標記和修飾，成本低，應用廣等優點在生物檢測和生化分析中發揮越來越重要的作用。Akira Ono等于2004年首次發現并提出汞離子可與胸腺嘧啶堿基上第三個氮原子發生質子取代反應形成穩定的T-Hg2+-T結構。該結構甚至可以取代核酸序列中原有的A-T堿基配對結構，使核酸的二級結構發生重組。這種特殊的配位結構的發現在很大程度上提高汞離子檢測的靈敏度和特異性，為重金屬檢測做出突破性貢獻。目前已發展了多種基于該結構的核酸檢測汞離子的方法，包括比色、電化學、電化學發光、熒光光譜等檢測方法。然而比色法雖然結果肉眼可見但是靈敏度不夠高，并且納米金的合成與準備過程也較為繁瑣。而電化學法的靈敏度高但是操作復雜，時間較長，需要配備價格較為昂貴的電化學相關儀器，同時，相關的熒光法由于沒有進行放大雖然更加快速和簡便，但是比較難以獲得令人滿意的靈敏度和檢測范圍。
[0005]核酸恒溫擴增技術是近年來發展起來的，能夠在恒溫條件下迅速擴增出多條寡核苷酸單鏈。相比于傳統擴增技術如PCR，核酸恒溫擴增技術不僅具有較高的擴增效率，而且不需要熱循環設備，已被越來越多地用于DNA，micr0RNA，以及其它生物活性分子和金屬離子的檢測。利用核酸恒溫擴增技術檢測汞離子的方法得到一定發展，相比于傳統檢測方法，能快速高效地實現汞離子檢測。應用核酸恒溫擴增技術檢測汞離子也得到一定發展。
[0006]應用核酸恒溫擴增技術進行信號放大時，常常需要使用工具酶如KlenowFragment聚合酶(KF)。而在現有聚合酶的儲存液以及最適反應緩沖液中普遍含有生物硫醇分子如二硫蘇糖醇(DTT)、BSA等以保證酶的穩定結構和活性。以往研究表明，生物硫醇分子與汞離子具有很強的親和作用。生物硫醇分子的存在會與胸腺嘧啶競爭，捕獲體系中痕量汞離子，導致汞離子與胸腺嘧啶作用效果降低，造成痕量汞離子的檢測靈敏度偏低，影響核酸恒溫擴增方法在汞離子檢測方面的應用。
【發明內容】
[0007]為了克服上述現有技術存在的缺陷，本發明的目的在于針對核酸恒溫擴增過程中聚合酶KF中生物硫醇分子對汞離子檢測的影響，提供一種基于核酸恒溫擴增技術檢測汞離子的DNA結構探針，在錯配位點與引物3’末端之間預留了特定長度的雙鏈區，在空間上隔離了汞離子結合區域與聚合酶識別區域。利用聚合酶的快速聚合作用，在生物硫醇分子破壞汞離子與胸腺嘧啶作用前獲得可持續聚合的穩定結構，巧妙的回避了生物硫醇分子的干擾，促進了核酸恒溫擴增技術在痕量汞離子檢測中的廣泛應用。
[0008]為了達到上述目的，本發明通過以下技術方案來實現:
[0009]基于核酸恒溫擴增技術檢測汞離子的DNA結構探針，包括含錯配位點并能通過核酸雜交構成三重雜交結構的三條DNA結構探針的核酸序列，其核苷酸序列(5’到3’):
[0010]3-WJ 探針 1AGAGGTAGTAGGTGATAGTCGG[0011 ] 3-WJ 探針 2CCGTCTTTCTCCCCATAT
[0012]3-WJ 模板:TGAGGCTAGAGCGAGCTGAGGCGGATATGGAATACTACCTCTAAA。
[0013]本發明設計含錯配位點并能通過核酸雜交構成三重雜交結構的三條DNA結構探針的核酸序列。
[0014]三重雜交結構特點在于由汞離子觸發DNA探針結構雜交形成后，即使汞離子被生物硫醇分子捕獲，三重雜交結構仍穩定存在，并引發聚合反應。在汞離子觸發下，DNA結構探針可形成穩定的三重雜交結構，引發聚合反應;汞離子觸發DNA結構探針形成穩定的三重雜交結構后，在聚合酶KF作用下延伸，之后Nt.BbvCI識別并切割延伸序列上的特定位點，產生單鏈產物1，剩余部分再次在KF作用下聚合，形成第一輪聚合-酶切的循環反應，同時產生大量單鏈產物I。切割下來的產物I和具有序列特異性且末端熒光標記的分子信標(MB)進行雜交產生熒光信號，同時以MB為模板進行擴增，同時在MB上產生Nt.BbvCI識別并切割延伸序列的特定位點。Nt.BbvCI識別并且切割后，產生單鏈產物2。產物2可以和MB雜交，產生熒光信號。同時，釋放產物2后的剩余MB和產物I的雜交結構再次在聚合酶作用下聚合，形成第二輪聚合-酶切的循環放大，產生大量單鏈產物2，與MB雜交后，產生放大的熒光信號。
[0015]與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果:
[0016]1.比較傳統的汞離子檢測方法有原子吸收/發射光譜、色譜層析法、電感耦合等離子體質譜、冷蒸汽原子熒光光譜、高效液相色譜法、陽極溶出伏安法等，但這些方法大多依賴于大型設備，實驗成本高，需要專業人員操作，且樣品的預處理過程繁瑣，這些都制約了這些方法在實際檢測中的廣泛應用。
[0017]2.現有核酸恒溫擴增方法雖然操作簡便，但是由于所用聚合酶中普遍含有DTT、BSA等生物硫醇分子，該物質與汞離子具有很強的親和能力，會干擾痕量汞離子檢測，造成靈敏度低，重現性差等問題。本發明針對核酸恒溫擴增技術在汞離子檢測方面的應用中生物硫醇分子的干擾問題，提出的一種利用DNA結構探針增強核酸恒溫擴增技術在汞離子檢測中檢測效果的方法，在不引入外來試劑的情況下，能有效避免聚合酶中生物硫醇分子的干擾，提高核酸擴增效率，具有重要的應用前景。
【附圖說明】
[0018]圖1是本發明的反應流程原理示意圖。
[0019]圖2是本發明所用來表征的核酸恒溫擴增方法的信號來源示意圖。
[0020]圖3比較本發明與現有方法的擴增效果。
【具體實施方式】
[0021]下面結合附圖對本發明做詳細敘述。
[0022]基于核酸恒溫擴增技術檢測汞離子的DNA結構探針，包括含錯配位點并能通過核酸雜交構成三重雜交結構的三條DNA結構探針的核酸序列，其核苷酸序列(5’到3’):
[0023 ] 3-WJ 探針 IAGAGGTAGTAGGTGATAGTCGG
[0024]3-WJ 探針 2CCGTCTTTCTCCCCATAT
[0025 ] 3-WJ 模板:TGAGGCTAGAGCGAGCTGAGGCGGATATGGAATACTACCTCTAAA。
[0026]本發明的工作原理為:
[0027]將本發明的DNA結構探針利用核酸恒溫擴增技術來檢測汞離子，步驟如下:
[0028](I)將含錯配位點并能通過核酸雜交構成三重雜交結構的三條DNA結構探針的核酸序列按濃度20nM混合，探針結合待測溶液中的20nM汞離子之后可形成可被聚合酶識別的穩定雜交結構；同現有擴增方法比較時，利用錯配引物和模板按濃度20nM混合，加入20nM汞離子進行雜交反應；
[0029](2)將結合汞離子之后的核酸雜交結構與擴增底物(1奶1^、狀、財.81^(:1、分子信標、以及擴增反應緩沖液混合反應，反應溫度為37°C，反應時間為60min。混合物中各個組分濃度分別為:序列20nM、擴增底物dNTPs 40yM、KF聚合酶0.5U、Nt.BbvCI 4U，擴增反應緩沖液為1mM Tris,75mM KAc11mM Mg(Ac)2，pH=7.9，探針序列形成穩定雜交結構后引發后續核酸恒溫擴增反應，并通過MB產生熒光信號；
[0030](3)利用熒光分光光度計檢測熒光信號，對熒光信號分析得到待測溶液中汞離子的含量。
[0031]從參照圖1可以看出，現有核酸擴增方法為汞離子觸發錯配引物和模板雜交，進而引發恒溫擴增反應。但是，當反應體系中存在聚合酶KF時，KF中自帶的DTT會與核酸鏈競爭結合汞離子，造成錯配引物和模板雜交不穩定，不能引發后續聚合反應的正常進行。本發明設計能形成三重雜交結構的特異性DNA探針序列。三重雜交結構的特點是其由汞離子觸發DNA探針雜交形成后，即使汞離子被DTT捕獲，三重雜交結構仍穩定存在，并引發聚合反應，并可通過恒溫擴增實現信號放大。因此，相比于現有檢測方法，能提高核酸恒溫反應的聚合效率，從而提高痕量汞離子的檢測效率。
[0032]參照圖2，為了驗證本發明增強核酸恒溫擴增的效果，選用已有的核酸恒溫擴增方法產生熒光信號的強度進行表征。
[0033]汞離子觸發DNA結構探針形成穩定的三重雜交結構后，在聚合酶KF作用下延伸，之后Nt.BbvCI識別并切割延伸序列上的特定位點，產生單鏈產物I，剩余部分再次在KF作用下聚合，形成第一輪聚合-酶切的循環反應，同時產生大量單鏈產物I。切割下來的產物I和具有序列特異性且末端焚光標記的分子信標(MB)進行雜交產生焚光信號，同時以MB為模板進行擴增，同時在MB上產生Nt.BbvCI識別并切割延伸序列的特定位點。財.BbvCI識別并且切割后，產生單鏈產物2。產物2可以和MB雜交，產生熒光信號。同時，釋放產物2后的剩余MB和產物I的雜交結構再次在聚合酶作用下聚合，形成第二輪聚合-酶切的循環放大，產生大量單鏈產物2，與MB雜交后，形成信號的級聯放大。
[0034]參照圖3，比較了本發明所提出的DNA結構探針與現有錯配引物與模板雜交結構在結合核酸恒溫擴增技術進行放大檢測時，熒光信號的差異。
[0035]現有錯配引物與模板雜交結構構成:
[0036]錯配引物:TAGAGGTT
[0037]模板:TGAGGCTAGAGCGAGCTGAGGCGGATATGGAATACTACCTCTAAA
[0038]曲線a、b為汞離子觸發錯配引物和模板雜交并結合上述核酸恒溫擴增方法產生的信號和背景熒光光譜。曲線c、d表示由汞離子觸發DNA探針形成三重雜交結構，同樣結合后續核酸恒溫擴增產生的信號和背景的熒光光譜。插圖為放大的a、b、c所對應的熒光光譜圖。從圖中可以看出，現有由引物和模板雜交再進行擴增的方法，信號和背景均很低，表明對痕量汞離子的檢測效率很低。而基于DNA探針結構的恒溫擴增方法，信號和背景具有很大的差異，表明體系中確實存在影響汞離子與核酸鏈穩定結合的干擾因素，并且三重雜交結構確實可以明顯增強核酸恒溫擴增技術在汞離子檢測中的效果，證明DNA結構探針在基于核酸恒溫擴增技術檢測汞離子方面具有重要應用價值。
【主權項】
1.基于核酸恒溫擴增技術檢測汞離子的DNA結構探針，其特征在于，包括含錯配位點并能通過核酸雜交構成三重雜交結構的三條DNA結構探針的核酸序列，其核苷酸序列(5’到.3，): .3-WJ 探針 1AGAGGTAGTAGGTGATAGTCGG .3-WJ 探針 2CCGTCTTTCTCCCCATAT .3-WJ 模板:TGAGGCTAGAGCGAGCTGAGGCGGATATGGAATACTACCTCTAAA。
【文檔編號】C12Q1/68GK106086188SQ201610460403
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月22日
【發明人】趙永席, 趙越, 劉華青, 袁慧, 董繪陽, 白凱, 王芳霞, 楊衛軍, 魏帥
【申請人】西安交通大學, 中國煙草總公司陜西省公司