核酸擴增方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種核酸擴增方法。
【背景技術】
[0002] 近年來，因基因利用技術的發展，基因診斷、基因治療等利用基因的醫療受到矚 目，除此之外，在農業、畜牧業領域也已開發出多種將基因用于鑒別品種、改良品種的方法。 作為用于利用基因的技術，PCR(聚合酶鏈式反應，Polymerase Chain Reaction)法等核酸 擴增技術正在廣泛普及。近年來，開發了能夠在短時間內得到核酸擴增反應產物的PCR裝 置（例如，專利文獻1)。
[0003] 現有技術文獻
[0004] 專利文獻
[0005] 專利文獻1 :日本特開2012-115208
【發明內容】
[0006] 本發明的發明人等在使用了日本特開2012-115208中記載的PCR裝置的核酸擴增 反應中，發現如果縮短熱變性和退火/延伸時間，則有時核酸擴增效率下降。于是，為了尋 找其原因并解決問題，進行了深入研究，結果發現通過在該PCR裝置中使用人工核酸，能夠 有效地進行核酸擴增。因此本發明的目的在于提供一種能夠高效地核酸擴增的新的核酸擴 增方法。
[0007] 本發明的一個實施方式是一種核酸擴增方法，包含如下工序：將核酸擴增反應容 器的第1區域加熱到第1溫度的工序，其中，上述核酸擴增反應容器填充有核酸擴增反應液 和與核酸擴增反應液相比比重小且不與核酸擴增反應液混和的液體；將核酸擴增反應容器 的第2區域加熱到比上述第1溫度低的第2溫度的工序；將第1配置切換到第2配置的工 序，其中，上述第1配置為第1區域在重力作用的方向位于第2區域的下方，第2配置為第2 區域在重力作用的方向位于第1區域的下方；以及，將第2配置切換到第1配置的工序；并 且，核酸擴增反應液含有探針，探針含有人工核酸。探針與僅含有天然核酸的探針相比，可 以與模板核酸的結合力更大。人工核酸可以為LNA、3' -氨基-2'，4' -BNA、2'，4' -BNAC0C、 2'，4'-8熟％、？嫩、6熟或了嫩。人工核酸可以是1^熟。探針可以是被標記過的探針。標記 過的探針可以是進行了 RI標記、熒光標記或酶標記。
[0008] 本發明的另一實施方式是一種核酸擴增反應裝置，該核酸擴增反應裝置包含如下 結構：安裝部，可安裝填充有核酸擴增反應液和與所述核酸擴增反應液相比比重小且不與 所述核酸擴增反應液混和的液體的核酸擴增反應容器；第1加熱部，將所述核酸擴增反應 容器的第1區域加熱到第1溫度；第2加熱部，將所述核酸擴增反應容器的第2區域加熱到 第2溫度；以及，驅動機構，對第1配置和第2配置進行切換，所述第1配置為所述第1區域 在重力作用的方向位于所述第2區域的下方，所述第2配置為所述第2區域在重力作用的 方向位于所述第1區域的下方；并且，核酸擴增反應液含有探針，探針含有人工核酸。
[0009] 根據本發明，可提供一種能夠有效地進行核酸擴增的新的核酸擴增方法。
【附圖說明】
[0010] 圖1是本發明的一個實施方式中使用的核酸擴增反應容器的截面圖。g表示重力 方向。
[0011] 圖2是本發明的一個實施方式中使用的升降式PCR裝置的立體圖。（A)表示關閉 蓋的狀態，（B)表示打開蓋的狀態。
[0012] 圖3是本發明的一個實施方式中使用的升降式PCR裝置的主體的分解立體圖。
[0013] 圖4是示意地表示本發明的一個實施方式中使用的升降式PCR裝置的主體的沿圖 2㈧的A-A線的截面的截面圖。㈧表示第1配置，（B)表示第2配置。
[0014] 圖5是表示本發明的一個實施方式和比較例中的表示核酸擴增反應產物量的熒 光亮度測定值與熱循環數的關系的圖。
【具體實施方式】
[0015] 本發明的目的、特征、優點及其構思根據本說明書的記載對本領域技術人員而言 是明確的，根據本說明書的記載，只要是本領域技術人員，就能容易地再現本發明。以下記 載的發明的實施方式和具體的實施例等表示本發明優選的實施方式，是用于例示或說明而 示出的，本發明不限于這些。在本說明書中公開的本發明的意圖和范圍內，基于本說明書的 記載，可以進行各種改變和修飾，這對本領域技術人員而言是明確的。
[0016] (1)核酸擴增方法
[0017] 本發明的核酸擴增方法的特征在于，包含如下工序：將核酸擴增反應容器的第1 區域加熱到第1溫度的工序，其中，上述核酸擴增反應容器填充有核酸擴增反應液和與核 酸擴增反應液相比比重小且不與上述核酸擴增反應液混和的液體；將核酸擴增反應容器的 第2區域加熱到比第1溫度低的第2溫度的工序；將第1配置切換到第2配置的工序，其 中，上述第1配置為第1區域在重力作用的方向位于上述第2區域的下方，上述第2配置為 第2區域在重力作用的方向位于第1區域的下方；以及，將第2配置切換到上述第1配置的 工序；并且，核酸擴增反應液含有探針，探針含有人工核酸。
[0018] 核酸擴增反應液可含有核酸擴增反應用試劑和擴增對象的靶核酸。作為靶核酸， 例如，可舉出由血液、尿、唾液、腦脊髓液、組織等被檢測物制備得到的DNA，或將由這些被檢 測物制備得到的RNA進行逆轉錄的cDNA等。核酸擴增反應用試劑可含有用于擴增靶核酸的 引物對、緩沖液、聚合酶、dNTP、MgCl 2和用于對靶核酸的擴增產物進行檢測的熒光標記等。 DNA聚合酶沒有特別限定，優選耐熱性的酶、PCR用酶，例如，Taq聚合酶、Tfi聚合酶、Tth聚 合酶或者它們的改良型等大量市售品，優選進行熱啟動的DNA聚合酶。dNTP、鹽的濃度只要 為對于使用的酶而言適當的濃度即可，通常可以為如下濃度：使dNTP為10~1000 μΜ，優 選100~500 μ Μ，使Mg2+為1~lOOmM，優選5~10mM，使C1為1~2000mM，優選200~ 700mM，對總離子濃度沒有特別限定，可以為高于50mM的濃度，優選高于100mM的濃度，更優 選高于120mM的濃度，進一步優選高于150mM的濃度，進一步優選高于200mM的濃度。上限 優選500mM以下，更優選300mM以下，進一步優選200mM以下。引物用寡聚核苷酸分別使用 0. 1~10 μ M，優選使用0. 1~1 μ M。
[0019] 本發明中，核酸擴增反應液含有包含人工核酸的探針。本說明書中，人工核酸是 指可通過氫鍵能夠與DNA、RNA的堿基鍵合的天然核酸分子以外的核酸分子。本發明中使 用的人工核酸的種類沒有特別限定，但特別優選與僅由天然核酸構成的探針相比，使探針 與互補鏈的Tm值變高、與模板核酸的結合力提高的人工核酸，優選使核酸的核糖環的2' 位的氧原子與4'位的碳原子進行亞甲基交聯的2'，4' -BNA(2' -0,4' -C-甲醇交聯核 酸，2' _0,4' -C-methano-bridged nucleic acid，別名 LNA(鎖核酸，Locked Nucleic Acid))。以下示出LNA的化學式。 「00201
[0021 ] 上述式中，堿基可舉出T (胸腺嘧啶）、C(胞嘧啶）、G(鳥嘧啶）、A(腺嘌呤）、U(尿 嘧啶）、1(肌苷）等作為例子，沒有特別限定。也可以是用甲基化、乙酰化等修飾而得到的 堿基。另外，也可以使用對LNA進行修飾而得的LNA類似物，可例示3'氨基-2'，4' -BNA、 2'，4' -BNA·、或 2'，4' 3熟％等。或者使用 PNA(核酸肽，P印tide Nucleic Acid)、 GNA (Glycol Nucleic Acid)、或 TNA(蘇糖核酸，Threose Nucleic Acid)、或對它們進行修 飾的類似物。LNA類似物以及PNA、GNA、TNA和它們的類似物也與LNA同樣地不限定堿基。
[0022] 探針所含有的人工核酸的數量沒有特別限定，可根據靶核酸、探針的排列等而任 意設定。一個探針可以具有多種人工核酸。
[0023] 含有人工核酸的探針優選為了檢測靶核酸的擴增而進行了標記。標記的種類沒有 特別限定，可以根據目的從TaqMan(注冊商標）MGB探針（AppliedBiosystems)等焚光標 記、SYBR Green(注冊商標）等嵌入劑、以32P為代表的放射性同位素（RI)等放射性物質標 記、以生物素、異羥基洋地黃毒甙元為代表的酶標記等可得到的標記中任意地選擇。含有人 工核酸的探針的制造方法也沒有特別限定，可用公知的方法制造。
[0024] 這里，Tm值是指雙鏈的核酸的50%解離成單鏈的核酸的溫度，即解鏈溫度 (Melting Temperature)。Tm值的計算方法沒有特別限定，通常可以單獨使用或組合使用 GC%法、最鄰近喊基對法、或Wallace法進彳丁計算。
[0025] 通過使用含有這樣的人工核酸的探針，與使用僅含有天然核酸的探針的情況相 比，擴增的引發更快，在相同的循環數下可更多地得到核酸擴增反應產物，還能夠更多地得 到最終產物。換言之，如果將變性溫度、退火溫度、延伸溫度設為一定值，則通過使用含有人 工核酸的探針，與使用了僅含有天然核酸的探針的情況相比，能夠在更短時間內得到相同 量的擴增產物。
[0026] 核酸擴增反應液還可以含有表面活性劑。表面活性劑沒有特別限定，可例示NP40、 TritonX-100、Tween20等。表面活性劑的濃度沒有特別限定，優選不阻礙核酸擴增反應的濃 度，可以為〇· 001 %~〇· 1 %以下，優選為〇· 002 %~0· 02 %，最優選為(λ 005 %~(λ 01 %。 表面活性劑可以從上述的酶的儲液帶入，也可以與上述的酶的儲液相獨立地將表面活性劑 溶液添加到核酸擴增反應液。
[0027] 對于液體130,通過使用不與反應液140混和的物質，將反應液140加入容器150 時，反應液140與液體130相分離，因