專利名稱：生物分析用近紅外中位氮、硫七甲川菁類熒光染料的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物熒光分析技術領域所用的熒光染料。
背景技術：
隨著生物科學的飛速發展，熒光分析技術在基因測序、基因表達及臨床診斷等方面的應用越來越多。在醫學上，以熒光技術為核心的酶促免疫分析法和熒光偏振免疫分析法已經成為醫療診斷的標準手段。在細胞生物學上，熒光光譜被用于跟蹤細胞內成分的位置和移動情況。另外，細胞的辨別和分類也是依靠以熒光技術為核心的流式細胞計。熒光染料的開發是發展熒光分析技術的最具決定性的因素。熒光染料應用在生物分析中，早期的標志性成就是在八十年代中期，DNA自動測序技術利用4種不同熒光染料的標示，能夠自動快速獲得C、G、A、T四類堿基的序列。這項成就也成為了現代分子生物分析技術發展的重要里程碑。之后隨著激光技術，計算機處理技術及熒光光譜測定技術等新技術的不斷進步，熒光染料在基因芯片、免疫分析檢測、腫瘤細胞早期診斷和細胞內金屬離子的識別等許多方面都得到了廣泛的應用，而且每年都有大量文獻和專利報道這些方面的研究進展。
為滿足日新月異的生物分析應用對熒光染料的需求，研究開發出更多的具有良好熒光光譜性能的新型熒光染料，仍然是熒光分析技術發展的關鍵和核心。目前使用比較多的羅丹明類、熒光素類、BODIPY類和菁類等熒光染料，其中有些品種已經商品化了。但這些商品化的染料大部分光譜都處在紫外可見區，而生物樣品自身在這個區域有很強的吸收，熒光檢測時會顯現出一定強度的自發熒光，造成強的熒光背景，從而極大地降低了檢測的靈敏度。近紅外熒光染料由于能避開這個問題近年來受到了廣泛的重視。甚至有專家認為，在熒光技術從培養皿研究階段發展到動物模型研究階段過程中起最關鍵作用的就是近紅外熒光染料和以它們為基礎設計的分子探針。只有在近紅外區，熒光分析技術才能在組織細胞體內得到充分的應用。
七甲川菁染料作為最主要的近紅外熒光團是這方面研究和應用的焦點。開發具有良好光譜性質的七甲川菁染料對發展生物熒光標示技術起著至關重要的作用。
針對這類染料的光穩定性和水溶性差的缺點，前人在染料的分子結構設計上已經取得很多成果。第一、兩端的芳香母核有很多種，包括噻唑、噻吩、2-喹啉、4-喹啉和3H-吲哚啉等，但以吲哚啉為母核被證明性能最好。第二、甲川鏈增長導致光穩定性下降已經得到證實。GaborPatonay等在甲川鏈上引入一個環己烯的結構單元，合成的染料被認為相對于直鏈七甲川染料有更好的光穩定性，同時熒光也得到增強。第三、AS Wangger等在分子中引入磺酸基，提高了染料的水溶性。同時還有提高穩定性的作用。這個方法已經成為提高這類染料的水溶性最常用的方法。
盡管如此，目前長波長的七甲川吲哚菁染料在生物熒光分析的應用上仍然存在一些問題和不足。
第一、七甲川菁染料的光穩定性需要進一步提高。
第二、目前的多甲川菁染料一般都是對稱結構，缺少單一的熒光標記反應的活性位點。在熒光標記時，熒光菁染料最好在分子中含有一個單一的羧基基團，用于特定地衍生反應得到理想的熒光探針分子。而為得到這樣含單一羧基的多甲川菁染料，一般方法是合成出不對稱菁染料，在分子的一端引入一個羧基。但這個方法使得染料的合成和分離提純變得復雜和困難。
第三、菁染料的光譜性能也存在不足之處熒光壽命短；熒光量子產率低；在水溶液中常出現自聚等。特別是菁染料的斯托克斯位移非常小，在20nm左右，這一方面造成菁染料在溶液中存在相當程度的熒光自淬滅，這是小斯托克斯位移形成光譜交蓋的結果。另一方面在熒光檢測中常出現因激發光源波長過于接近發射檢測波長而引起測量誤差。近期兩篇文獻均談到常見多甲川菁染料存在斯托克斯位移小的弱點。文獻如下(1)Tolosa，L.；Nowaczyk，K.Lakowicz，J.An Introduction to Laser Spectroscopy，2nd ed.；KluwerNew York，2002.(2)Zhang Z.，Achilefu S.Synthesis and Evaluation of Polyhydroxylated Near-InfraredCarbocyanine Molecular Probes.Org.Lett.2004，6(12)2067-2070.
發明內容
本發明的目的是選定長波長的七甲川菁染料，設計合成出適用于生物熒光標示的結構新穎、性能優良的近紅外七甲川菁染料作為研究目標。
第一、本發明首先設計了一個七甲川吲哚菁母體染料，結構充分考慮了前人工作成果，在染料結構中以吲哚啉作為芳香母核，在吲哚啉上引入磺酸基增加水溶性，在甲川鏈的中間引入六元橋環結構提高穩定性。
第二、本發明選定在七甲川菁染料的中位進行取代，合成出新型的七甲川菁染料，并將新染料的熒光光譜性能作為本發明研究的中心。
在最近常見的七甲川吲哚菁染料的結構中，由于甲川鏈引入含氯六元橋環結構來提高光穩定性，這樣同時在染料分子的結構上產生了一個獨特的用于衍生反應的位點，就是處于甲川鏈“中位”的氯原子，能被親核試劑取代。
七甲川菁染料這種“中位”取代前人研究相對較少，并集中在用氧原子或硫原子取代中位氯原子。這類衍生染料解決了在分子中引入單一活性位點的難題，能更為方便地用作新型熒光探針應用于生物熒光分析中。本發明著重研究中位氮、硫取代七甲川菁染料的光譜性能及其應用。
本發明的近紅外中位氮、硫取代七甲川菁類熒光染料的結構通式為 通式中X＝II、III、IV或V；R1、R2＝(CH2)nR7、(CH2)mOR8、(CHR9CH2O)pR10、CH2C6H4R11或環己基；R3、R4、R7＝H、SO3R12、CO2R13或NCS；R5＝(CH2)nR7、(CH2)mOR8、(CHR9CH2O)pR10、CH2C6H4R11、環己基、間位或對位的C6H4R14；R8、R9、R10＝H、C1-18烷基或環己基；R11＝H、間位、對位的SO3R12或CO2R13；R12＝H或M；M＝Na、K或N(R15R16R17R18)；R13＝H、M、R6、C1-18烷基或環己基；R14＝H、NH2、NHCOR10、(CH2)nR7、(CH2)mOR8、(CHR9CH2O)pR10、CH2C6H4R11或環己基；R15、R16、R17、R18＝H、C1-18烷基、環己基、(CH2)qOR9或(CHR9CH2O)rR10；n、m、p、q、r＝0-18。
1、染料的合成將起始原料對位取代苯肼與3-甲基-2-丁酮在冰醋酸中回流，吲哚化反應生成吲哚中間體，再與烷基化試劑于氮氣保護下發生季銨化反應生成烷基取代的中間體吲哚季銨鹽。然后與縮合劑2-氯-1-甲酰基-3-羥甲基環己烯在正丁醇/甲苯中脫水反應就得含氯六元橋環的七甲川3H-吲哚菁母體染料 含氯橋環母體染料與不同的含氨基或巰基親核試劑于無水無氧條件下，在DMF中攪拌反應，產物倒入乙醚中則析出大量固體，經過濾干燥后，采用反相填料柱以水/甲醇梯度洗脫，得到目標染料。
2、染料的特征本發明的中位氮衍生物取代七甲川菁染料的光譜性能與普通多甲川菁染料完全不同。主要體現在第一、新染料的斯托克斯位移最大能達到167nm，最少也能達到70nm，比普通菁染料的25nm左右大很多，而且熒光量子產率最大能超過0.4。第二、新染料的光譜相對于普通多甲川菁染料明顯變寬，尤其是吸收光譜。第三、吸收光譜與發射光譜失去鏡像對稱關系。吸收光譜的寬度明顯大于發射光譜。在光譜中存在這三個特征是染料分子存在分子內電荷轉移(ICT)激發態的外在表現。染料具有大的斯托克斯位移對于熒光分析技術具有十分重大的意義。現在用于熒光分析技術的眾多熒光染料中，絕大多數的斯托克斯位移不超過30nm。如羅丹明B在甲醇溶液中是23nm，BODIPY類染料約是20nm。小的斯托克斯位移造成的問題，一是使染料自淬滅，也稱為染料的自吸收。這是因為小斯托克斯位移的染料的吸收光譜與發射光譜有很大的交蓋，即染料有部分發射光能被其自身吸收，這樣導致熒光強度下降。另一個問題是造成熒光分析技術的測量誤差。這是因為小的斯托克斯位移使激發光波長與熒光檢測波長太過接近，激發波長易對熒光檢測狹縫造成散射光干擾。因而，這種具有大斯托克斯位移的熒光染料有著十分重要的應用價值。本發明的這類菁類熒光染料可用作高靈敏的蛋白質、糖、DNA等生物分子熒光標記探針。
本發明的中位硫衍生物取代七甲川菁染料的光譜與普通多甲川菁染料相似，但發現這類衍生染料存在分子內PET現象。這個現象在近紅外的熒光團中極少發現。染料的PET效應與中位硫取代基團的供電能力直接相關。其中，一個取代基供電能力最強的染料表現出最有效的分子內PET，熒光量子產率最小。對這個染料進行的外加質子和金屬離子的熒光滴定實驗發現，在外加陽離子的一定濃度范圍內，染料的熒光增強。這個結果有效驗證了分子內PET的存在。對輕金屬三價鋁離子的熒光滴定實驗結果，發現熒光增強倍數大于10倍。這是迄今發現的最有效的近紅外熒光探針。這為設計基于這類染料的近紅外熒光金屬離子探針奠定基礎。
表1是兩個中位氮衍生物取代染料IIa，IIb和含氯母體染料Ib在水溶液(1×10-6M)中的光譜數掘。可以看到，其中烷基氨基取代衍生染料IIb的斯托克斯位移比達到140nm。更為重要的是，它們的熒光強度比含氯母體染料Ib要強兩倍以上。
圖1給出染料IIb在水溶液中的譜圖，圖2是含氯母體染料Ib在水溶液中的譜圖。通過比較可以看出，第一、新染料IIb的光譜相對于母體染料明顯變寬，尤其是吸收光譜。第二、吸收光譜與發射光譜失去鏡像對稱關系。吸收光譜的寬度明顯大于發射光譜。第三、新染料IIb的斯托克斯位移達到140nm，比普通菁染料大很多。
表2是中位硫取代的衍生染料IIIa-d及母體染料Ib在1×10-6M的水溶液中的光譜數據。可以看出中位硫取代對染料光譜的影響結果。
(1)與母體染料相比，衍生染料的吸收和發射峰形保持不變，斯托克斯位移也沒有明顯變化，最大吸收和發射波長稍有紅移。其中IIIa-c紅移超過10nm，而IIId只紅移了3-5nm。原因可能是IIIa-c中苯環延長了共軛體系，而IIId只有硫的p-π共振作用。
(2)熒光強度順序為IIId＞Ib＞IIIa＞IIIc＞＞IIIb。說明硫取代后取代基的結構對熒光量子產率影響很大。吸電的羧甲基的引入使染料IIId熒光增強。苯環的引入使染料IIIa熒光一定程度減弱，而氨基苯則使染料IIIb熒光淬滅，但引入乙酰氨基苯則使染料IIIc熒光恢復到接近于染料IIIa的水平。
從染料IIIb的取代基結構和極小的熒光量子產率我們能容易地推斷其發生了分子內PET。像其他的PET探針一樣，光激發后N原子上的一個高能的非鍵電子能夠轉移到熒光團的HOMO上，從而淬滅了分子的熒光。
染料IIIb已經被證實發生了強的PET過程，這從它的熒光量子產率(Φf＝0.0065)遠遠低于IIIa(Φf＝0.038)和IIIc(Φf＝0.036)可以看出。
同理，染料IIa除了具有大的斯托克斯位移(87nm)，可以推斷其發生了激發態的分子內電荷轉移(ICT)外，根據它的弱的熒光量子效率(Φf＝0.025)，也可以推斷其分子內發生一定程度的PET過程。
根據前面論述的PET原理，發生強PET將使染料的熒光淬滅，當供體氨基被質子化或與金屬陽離子結合后，熒光恢復。這種熒光恢復增強過程在對于短波長熒光團能容易實現，但對于近紅外熒光團，這個過程受制于客觀因素，難于實現。
幸運的是，在外加質子或過渡金屬離子后，染料IIIb觀察到了較為明顯的熒光增強。而母體染料Ib和染料IIIa，IIIc只能觀察到熒光淬滅。見圖3-7。這一方面，證實了這類分子中確實存在PET現象。另一方面為研究設計這類近紅外區PET熒光探針奠定了基礎。
在熒光滴定實驗中，向染料IIIb加入質子或加入過渡金屬陽離子超過一定的濃度后，熒光也將出現淬滅。說明染料IIIb在外加陽離子的條件下，也存在兩種相反的效應。一是陽離子與氨基結合，抑制了PET過程，導致的熒光增強效應。二是這兩類陽離子誘導的熒光淬滅效應。強酸使得菁染料褪色，過渡金屬陽離子與染料分子間發生碰撞能量轉移，淬滅熒光。在陽離子的低濃度范圍，熒光增強效應占據了主導作用。但同時存在的淬滅效應使設計PET質子探針和過渡金屬離子探針變得不可行，因為很難得到大的熒光增強倍數和良好的線性關系。
另外，還嘗試了鑭系金屬離子，在染料IIIb中加入Ce(NO3)3后，也發現熒光先增強后淬滅的過程。但測試中發現，相對Zn離子，這類鑭系金屬離子熒光增強更難，淬滅現象在很低的濃度下就開始發生。這種淬滅選擇性源自于發生Frster型碰撞能量轉移的染料分子與金屬離子間的能量匹配。這也是設計過渡金屬離子的熒光淬滅探針的理論基礎。
但要設計金屬離子PET探針，就需要避開這種淬滅效應。圖8給出了染料IIIb在外加Al離子的熒光滴定光譜。可以看到，染料IIIb在外加Al離子后，熒光增強達到12倍。這個結果說明輕金屬離子與菁染料之間不會發生類似重金屬離子的能量轉移，從而避開了熒光淬滅效應。所以這類染料不適合設計成重金屬離子的近紅外PET熒光探針，但完全可用于輕金屬離子或中性小分子的PET熒光檢測。
圖1為染料IIb在水溶液(1×10-6M)中的吸收和發射光譜，橫坐標為波長(nm)，縱坐標左邊為吸收值，右邊為發射強度。
圖2為染料Ib在水溶液(1×10-6M)中的吸收和發射光譜，橫坐標為波長(nm)，縱坐標左邊為吸收值，右邊為發射強度。
圖3為染料IIIb在含不同濃度HCl的水溶液中熒光發射光譜(λex＝795nm)，橫坐標為波長(nm)，縱坐標為相對熒光強度；HCl濃度a0mM，b0.096mM，c0.0192mM，d0.480mM，e0.720mM，f0.960mM，g1.200mM；圖4為染料Ib在含不同濃度HCl的水溶液中熒光發射光譜(λex＝767nm)，橫坐標為波長(nm)，縱坐標為相對熒光強度；HCl濃度a0mM，b0.048mM，c0.096mM，d0.240mM，e0.960mM，f2.400mM，g4.800mM，h9.600mM；圖5為染料IIIa在在不同濃度ZnSO4的緩沖溶液中熒光發射光譜(λex＝795nm)，緩沖體系是烏洛托品-鹽酸，pH＝7.04，橫坐標為波長(nm)，縱坐標為相對熒光強度；ZnSO4濃度a0mM，b0.04mM，c0.08mM，d0.20mM，e0.40mM，f0.80mM，g2.00mM；
圖6為染料IIIb在在不同濃度ZnSO4的緩沖溶液中熒光發射光譜(λex＝795nm)，緩沖體系是烏洛托品-鹽酸，pH＝7.04，橫坐標為波長(nm)，縱坐標為相對熒光強度；ZnSO4濃度a0mM，b0.08mM，c0.16mM，d0.32mM，e0.60mM，f0.80mM，g1.20mM，h1.40mM；圖7為染料IIIc在在不同濃度ZnSO4的緩沖溶液中熒光發射光譜(λex＝795nm)，緩沖體系是烏洛托品-鹽酸，pH＝7.04，橫坐標為波長(nm)，縱坐標為相對熒光強度；ZnSO4濃度a0mM，b0.10mM，c0.20mM，d0.40mM，e0.80mM，f2.00mM，g4.00mM；圖8為染料IIIb在在不同濃度Al2(SO4)3的緩沖溶液中熒光發射光譜(λex＝795nm)，緩沖體系是烏洛托品-鹽酸，pH＝7.04，橫坐標為波長(nm)，縱坐標為相對熒光強度；Al2(SO4)3濃度0mM---22.0mM.
具體實施例方式
實施例1含氯橋環母體染料Ib的合成路線 (1)中間體2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸鉀的合成1000ml三口燒瓶中，依次加入150ml冰醋酸，84ml(0.8mol)3-甲基-2-丁酮和50g(0.26mol)對肼基苯磺酸。混合物加熱回流3小時，反應物倒入燒杯中，靜置冷卻后有粉紅色固體析出。過濾，真空干燥，得2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸鹽48克，產率75％，R1＝0.58，展開劑為正丁醇∶乙酸∶水(2∶1∶5)。
250ml園底燒瓶中，依次加入50ml甲醇，50ml異丙醇，48g(0.2mol)2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸鹽和12.3克(0.22mol)KOH。混合物加熱回流，粉紅色迅速退去，冷卻有大量黃色固體析出。過濾，真空干燥，得中間體2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸鉀54克，產率97％。
(2)中間體N-芐基-2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸的合成在100ml圓底燒瓶中，依次加入15.6g(0.06mol)2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸鉀，9.8g(0.063mol)芐基溴，甲苯65ml，在氮氣保護下加熱回流反應5小時，得到粉紅色固體，超聲使壁上固體進入液體中，過濾，用甲苯洗滌，真空干燥。
(3)縮合劑2-氯-1-甲酰基-3-羥甲基環己烯的合成在冰浴(0-5℃)下將37ml三氯氧磷的35ml干燥的二氯甲烷的混合液滴加入80ml由干燥的二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺(1∶1，V/V)的混合液中，然后再逐滴加入10g環己酮。撤下冰浴，將反應液加熱到回流，反應3h后，用冰水浴冷卻，然后分批倒入200g碎冰中。放置過夜，得到紅色固體，過濾，固體以冰凍的丙酮分批少量洗滌至黃色。產品于氮氣保護下置于冰箱中保存，備用。
(4)含氯母體染料Ib的合成及表征在250ml圓底燒瓶中依次加入8mmol季銨鹽5和4mmol(692mg)縮合劑6(2-氯-1-甲酰基-3-羥甲基環己烯)，再加入正丁醇∶甲苯(7∶3)300ml，加上分水器，分水器中加入甲苯溶劑，氬氣保護下，加熱回流5小時，溶液逐漸由淺紅色變成深紅色，最后出現大量綠色組分。旋轉蒸發除去正丁醇和苯，加入甲醇，超聲溶解，加入相對于甲醇量1.5-2倍激烈攪拌中的乙醚，立即有大量的固體析出，用砂心漏斗過濾，乙醚洗滌，粗品干燥后用水重結晶兩次，密封避光保存。染料Ib1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ1.58(m，2H，CH2)，1.72(s，12H，CH3)，2.09(t，4H，CH2)，5.52(s，4H，CH2)，6.36-6.40(d，2H J＝13.6Hz，CH)，7.26-7.40(m，12H，CH)，7.62-7.64(d，2H，CH)，7.85(s，2H，CH)，8.22-8.25(d，2H，J＝13.6Hz，CH).Q-TOFMSM-1計算值793.2173，測試值793.2186。
實施例2目標染料IIa的合成及表征
母體染料Ib預先在50-60℃下真空干燥8小時，親核試劑苯胺預先減壓蒸餾精制。所用玻璃儀器預先在120℃下干燥3小時，50mL的三口圓底燒瓶在氮氣氛下冷卻后，加入100mg(0.12mmol)原料染料Ib和1.2mmol的親核試劑和一個磁力攪拌子。氮氣氛下用注射器加入無水DMF約15mL。反應混合物在氮氣保護下保溫100℃攪拌2小時。反應液倒入快速攪拌的300mL乙醚中，大量綠色固體沉淀生成。用砂芯漏斗過濾掉濾液，得到固體用甲醇從漏斗上溶解下來，蒸干甲醇，得到染料粗品用反相填料柱提純。
染料IIa，1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ1.35(s，12H，CH3)，1.72-1.74(m，2H，CH2)，2.39-2.42(t，4H，CH2)，5.32(s，4H，CH2)，5.99-6.02(d，2H J＝13.6Hz，CH)，6.79-6.83(t，1H，CH)，6.97-6.99(d，2H，CH)，7.14-7.16(d，2H，CH)，7.20-7.22(d，4H，CH)，7.24-7.28(t，4H，CH)，7.30-7.34(t，4H，CH)，7.55-7.57(d，2H，CH)，7.63(s，2H，CH)，7.90-7.93(d，2H，J＝13.6Hz，CH).MS，m/z851.3(M-)實施例3目標染料IIb的合成及表征 合成方法同實例2，其中親核試劑使用γ-氨基丁酸，反應溫度為40℃。
染料IIb，1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ0.86(m，2H，CH2)，1.25(m，4H，CH2)，1.63(s，12H，CH3)，1.93(m，2H，CH2)，2.29(t，4H，CH2)，5.20(s，4H，CH2)，5.72(d，2HJ＝13.2Hz，CH)，7.00-7.02(d，2H，CH)，7.25(m，6H，CH)，7.34(m，4H，CH)，7.53(m，4H，CH)，7.64(s，2H，CH).MS，m/z861.3(M-).
實施例4目標染料IIIa的合成及表征 合成方法同實例2，其中親核試劑使用苯硫酚，反應溫度為室溫。
染料IIIa，1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ1.48(s，12H，CH3)，1.80(m，2H，CH2)，2.56(t，4H，CH2)，5.48(s，4H，CH2)，6.36-6.39(d，2H J＝13.2Hz，CH)，7.13-7.17(t，1H，CH)，7.23-7.26(t，6H，CH)，7.29-7.33(t，6H，CH)，7.34-7.38(t，4H，CH)，7.59-7.61(d，2H，CH)，7.74(s，2H，CH)，8.59-8.62(d，2H，J＝13.2Hz，CH).Q-TOFMSM-1計算值867.2596，測試值867.2598.
實施例5目標染料IIIb的合成及表征 合成方法同實例2，其中親核試劑使用對氨基苯硫酚，反應溫度為室溫。
染料IIIb，1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ1.58(s，12H，CH3)，1.72(m，2H，CH2)，2.55(t，4H，CH2)，5.46(s，4H，CH2)，6.31-6.35(d，2H J＝13.6Hz，CH)，6.50-6.52(d，3H，CH)，6.95-6.98(d，2H，CH)，7.05-7.07(d，2H，CH)，7.23-7.25(d，3H，CH)，7.28-7.31(t，3H，CH)，7.33-7.37(m，3H，CH)，7.60-7.62(d，2H，CH)，7.77(s，2H，CH)，8.69-8.73(d，2H，J＝13.6Hz，CH).Q-TOFMSM-1計算值882.2705，測試值882.2742.
實施例6目標染料IIIc的合成及表征 合成方法同實例2，其中親核試劑使用對乙酰氨基苯硫酚，反應溫度為室溫。
染料IIIc，1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ1.51(s，12H，CH3)，1.79(m，2H，CH2)，1.98(s，3H，CH3)，2.55(t，4H，CH2)，5.47(s，4H，CH2)，6.35-6.38(d，2H J＝13.6Hz，CH)，7.17-7.19(d，2H，CH)，7.23-7.25(d，4H，CH)，7.29-7.31(t，4H，CH)，7.34-7.38(t，4H，CH)，7.51-7.54(d，2H，CH)，7.59-7.61(d，2H，CH)，7.75(s，2H，CH)，8.60-8.63(d，2H，J＝13.6Hz，CH)，9.95(s，1H，NH).13C NMR(400MHz，DMSO-d6)δ20.5，23.9，25.7，27.3，47.0，48.9，102.7，110.7，119.9，120.3，126.3，126.6，126.9，127.8，129.0，130.0，134.1，135.0，137.6，140.4，142.4，145.4，145.6，151.1，168.3，172.7.Q-TOFMSM-1計算值924.2811，測試值924.2845.
實施例7目標染料IIId的合成及表征 合成方法同實例2，其中親核試劑使用巰基乙酸，反應溫度為室溫。
染料IIId，1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ1.63(m，2H，CH2)1.71(s，12H，CH3)，2.40(t，4H，CH2)，5.48(s，4H，CH2)，6.31-6.34(d，J＝13.6Hz，2H，CH)，7.26-7.27(m，8H，CH)，7.33-7.35(d，4H，CH)，7.61(d，2H，CH)，7.80(s，2H，CH)，8.79-8.82(d，2H，J＝13.2Hz，CH).13C NMR(400MHz，DMSO-d6)δ20.5，25.6，27.6，47.0，49.0，102.3，110.5，120.0，126.3，126.6，127.8，129.0，133.5，135.0，140.3，142.7，144.8，145.6，157.3，172.4.Q-TOFMSM-1計算值849.2338，測試值849.2297.
表1染料IIa，IIb和母體染料Ib在水溶液(1×10-6M)中的光譜數據
a摩爾消光系數單位為cm-1Mb熒光量子產率的測量溶劑為甲醇，參比染料為羅丹明B的甲醇溶液(Φf＝0.69).
表2硫取代的衍生染料及母體染料在水溶液(1×10-6M)中的光譜數據。
a摩爾消光系數單位為cm-1Mb熒光量子產率的測量溶劑為二甲基亞砜，參比染料為IR-125的DMSO溶液(Φf＝0.13).
權利要求
1.一類用于生物熒光分析的近紅外中位取代七甲川菁染料，其特征在于該染料具有下列結構通式I 通式中X＝II、III、IV或V；R1、R2＝(CH2)nR7、(CH2)mOR8、(CHR9CH2O)pR10、CH2C6H4R11或環己基；R3、R4、R7＝H、SO3R12、CO2R13或NCS；R5＝(CH2)nR7、(CH2)mOR8、(CHR9CH2O)pR10、CH2C6H4R11、環己基、間位或對位的C6H4R14；R8、R9、R10＝H、C1-18烷基或環己基；R11＝H、間位、對位的SO3R12或CO2R13；R12＝H或M；M＝Na、K或N(R15R16R17R18)；R13＝H、M、R6、C1-18烷基或環己基；R14＝H、NH2、NHCOR10、(CH2)nR7、(CH2)mOR8、(CHR9CH2O)pR10、CH2C6H4R11或環己基；R15、R16、R17、R18＝H、C1-18烷基、環己基、(CH2)qOR9或(CHR9CH2O)rR10；n、m、p、q、r＝0-18。
2.按照權利要求1所述的近紅外中位取代七甲川菁染料，其特征在于近紅外中位氮衍生物取代的七甲川菁染料具有在70-170nm范圍內大的斯托克斯位移，熒光量子產率最大能超過0.4。
3.按照權利要求1所述的近紅外中位取代七甲川菁染料，其特征在于近紅外中位氮衍生物取代的七甲川菁染料光譜明顯變寬，而且吸收光譜與發射光譜失去鏡像對稱關系，吸收光譜的寬度明顯大于發射光譜。
4.按照權利要求1所述的近紅外中位取代七甲川菁染料，其特征在于近紅外中位氮衍生物取代的七甲川菁染料分子在激發態發生分子內電荷轉移(ICT)。
5.按照權利要求1所述的近紅外中位取代七甲川菁染料，其特征在于近紅外中位硫、氮衍生物取代的七甲川菁染料分子都會存在分子內光誘導電子轉移(PET)現象。并且能夠通過調節取代基的供電能力，來控制PET過程發生的強弱程度。
6.按照權利要求1所述的近紅外中位取代七甲川菁染料的用途，其特征在于近紅外中位氮衍生物取代的七甲川菁染料，利用染料分子在激發態發生分子內電荷轉移(ICT)效應，產生的大斯托克斯位移和強的熒光量子產率，用作高靈敏的蛋白質、糖、DNA等生物分子熒光標記探針。
7.按照權利要求1所述的近紅外中位取代七甲川菁染料的用途，其特征在于近紅外中位硫衍生物取代的七甲川菁染料，利用染料分子發生光誘導電子轉移(PET)效應，在中位硫衍生物取代的七甲川菁染料IIIb的1×10-6M的水溶液中外加0-22mM Al2(SO4)3，使得熒光增強10-12倍，可用作熒光增強的輕金屬離子的探針。
全文摘要
本發明涉及一類新型的近紅外七甲川菁類熒光染料，該染料是傳統七甲川菁染料與含氮、硫的親核試劑在染料結構的中位進行取代所得到的新型染料。其中中位氮衍生物取代七甲川菁染料在激發態發生分子內電荷轉移(ICT)效應，產生大斯托克斯位移(70－170nm)和良好熒光性能(熒光量子產率最大能超過0.4)，可用作高靈敏的蛋白質、糖、DNA等生物分子熒光標記探針。中位硫衍生物取代七甲川菁染料存在分子內光誘導電子轉移(PET)現象。作為輕金屬離子探針的熒光增強倍數超過10－12倍。
文檔編號C09B23/00GK1702118SQ20051004662
公開日2005年11月30日 申請日期2005年6月6日 優先權日2005年6月6日
發明者彭孝軍, 宋鋒玲, 周偉, 舒凡 申請人:大連理工大學