，吸取上層淡黃色血楽，轉移至新的50ml離心管中，置于56°C滅活30min，2000rpm(900g)離心lOmin，取上清分裝后置于4°C保存備用。
[0027]實施例5
[0028]CIK細胞誘導及測試準備
[0029]在上述分離的單個核細胞懸液中添加重組人IFN-γ終濃度為1000U/ml，然后均分為四份移入四個培養瓶中。其中1-3號培養瓶分別用實施例1-3的培養基調整細胞為I X 106/ml得到實驗組細胞。第4號培養瓶用GT551培養基調整細胞為I X 106/ml,添加重組人IFN-γ終濃度為1000U/ml得到GT551對照組。所有培養瓶置于37°C，5% CO2飽和濕度培養箱中培養24小時，之后，每瓶添加人CD3單克隆抗體，人重組白介素I和人重組白介素2，終濃度分別為100ng/ml，100U/ml和500U/ml。此后，每隔48小時進行一次換液，培養至第14天時收集CIK細胞待用。
[0030]實施例6
[0031 ] CIK細胞增殖的對比測試試驗
[0032]方法:細胞在37°C,5% 0)2飽和濕度條件下，在相應無血清細胞培養液中生長(14天)，觀察細胞形態并進行細胞計數。
[0033]結果:培養(14天)的細胞一部分為圓形，一部分呈不規則形態，一部分懸浮生長，一部分抱團生長。14天后細胞計數，GT551組的細胞擴增了 120倍左右，細胞數量為3xl09，本發明培養基組平均擴增了 240倍，細胞數量6xl09。
[0034]實施例7
[0035]⑶3+⑶56+陽性率試驗
[0036]方法:用熒光素標記的單克隆抗體及流式細胞儀檢測細胞抗原CD3和CD56的表達。
[0037]結果:14天⑶3+⑶56+雙陽性率，GT551組為11.59 %，本發明培養基組平均為53.73%。
[0038]實施例8
[0039]細胞存活率試驗
[0040]方法:用臺盼藍染色檢測細胞存活率。
[0041]結果:14天細胞存活率，GT551組為90%，本發明培養基組平均為95%。
[0042]實施例9
[0043]質控方法
[0044]鑒別:
[0045]1、滲透壓
[0046]按滲透壓測量儀進行測定，滲透壓在260?320m0sm/kg范圍為合格。
[0047]2、內毒素
[0048](I).標準品稀釋:取1EU/支工作標準品I支，加BET水1ml，在漩渦混合器上混合15分鐘后，制成10EU/ml的工作標準品母液；用檢查用水將內毒素標準品稀釋制成2 λ濃度的內毒素標準溶液。
[0049](2).根據鱟試劑靈敏度的標示值(λ)用BET水將標準品母液稀釋至2λ、λ、0.5 λ、0.25 λ四個濃度，每稀釋一步均應在旋渦混合器上混勻30s。
[0050](3).取鱟試劑2支加BET水0.2ml作為陰性對照，2支加0.1mlBET水和2 λ的工作標準品0.1ml作為陽性對照。取鱟試劑各加0.1mlBET水和0.1ml2 λ、λ、0.5 λ、0.25 λ四個濃度的樣品作為供試品管，放入37°C ±1°C水浴，保溫60±2分鐘。產品內毒素指標小于 0.1EU0
[0051]3、無菌
[0052]供試品的制備:用滅菌鑷取出注射器，在火焰旁將針芯插入針管并安上針頭，供試品瓶蓋和注射器針頭均應迅速通過火焰數次，用注射器吸取已混合好的供試品2ml。
[0053]取上述供試品在近火焰上以右手小指為主拔開培養基管的塞子，管口通過火焰后，移至火焰下側，沿培養管壁分別接種于需氧菌、厭氧菌培養6管(其中I管于操作結束后移至接種室接種金黃色葡萄球菌對照菌液Iml)，真菌培養基5管，輕搖使勻，需氧菌、厭氧菌培養基在30-35 °C培養，真菌培養基在20-25 °C培養7日，培養期間應逐日檢查是否有菌生長(陽性對照在24h內應有菌生長)，并填寫檢查記錄。
[0054]在加入供試品后，培養基出現混濁，培養7日后，不能從外觀上判斷無微生物生長，可取該培養液適量接種于同種新鮮培養基中或斜面上，繼續培養，細菌培養2日，真菌培養3日，觀察是否再現混濁或斜面上有無菌落生長，在接種同時，取培養液少量，涂片制成染色標本，用顯微鏡觀察是否有菌生長。
[0055]4、支原體檢測
[0056]供試品如在分裝后24小時內進行支原體檢查可儲存在2?8°C，超過24小時應置-20°C以下貯存。
[0057]檢查支原體采用支原體半流體培養基和支原體肉湯培養基(或支原體瓊脂培養基)，半流體培養基(或支原體瓊脂培養基)121°C高壓滅菌25分鐘，冷卻至56°C左右加入滅活的小牛血清(培養基:血清為8:2)并可酌情加入適量青霉素，充分搖勻。液體培養基除無需煮沸外，使用前亦應同樣補加上述成分。
[0058]取每支裝量為1ml的支原體半流體培養基(已冷至36°C士 TC )和支原體肉湯培養基各4支，每支培養基接種供試品0.5?1.0ml，置36°C士 1°C培養21天。于接種后的第7天從4支中取2支進行次代培養，每I支培養基轉種支原體半流體培養基及支原體肉湯培養基各2支，置36°C士 1°C培養21天，每隔3天觀察I次。
[0059]結果判定:培養結束時，如接種供試品的培養基均無支原體生長，則供試品判為合格；如疑有支原體生長，可取加倍量供試品復試，如無支原體生長，供試品判為合格，如仍有支原體生長，則供試品判為不合格。
【主權項】
1.一種免疫細胞細胞培養基，其特征在于包括如下成分:地塞米松、人轉鐵蛋白、胰島素、膽固醇、過氧化氫酶、亞砸酸鈉和二巰基乙醇。2.如權利要求1所述的培養基，其特征在于還包括如下成分: L-精氨酸、CuSO4.5H20、L-天門冬酰胺、L-天門冬氨酸、L-谷氨酸、Ni (NO3)2.6H20、L-谷氨酰胺、ZnSO4.7H20、甘氨酸、CoCl2.6H20、L-組氨酸、NaS13.9H20、L-異亮氨酸、Na3VO4.12H20、L-賴氨酸鹽酸、SnCl2.2H20、L-蛋氨酸、Na2Se03、L-苯丙氨酸、FeSO4.7H20、L-脯氨酸、葡萄糖、L-絲氨酸、維生素C、L-蘇氨酸、對羥基苯甲酸、L-色氨酸、丙酮酸鈉、L-纈氨酸、亞油酸、L-亮氨酸、β -巰基乙醇、二水L-酪氨酸二鈉、乙醇胺、L-胱氨酸二鹽酸。3.如權利要求1所述的培養基，其特征在于各成分含量如下:地塞米松0.001?0.005mg/L、人轉鐵蛋白5?50mg/L、胰島素8_20mg/L、純化人轉鐵蛋白l_30mg/L、膽固醇20-60mg/L、過氧化氫酶20-50mg/L、亞砸酸鈉17.3_35mg/L、I % 二巰基乙醇溶液0.35-1.0ml/Lo4.如權利要求3所述的培養基，其特征在于各成分含量為:地塞米松0.003ml/L、人轉鐵蛋白30ml/L、胰島素10ml/L、純化人轉鐵蛋白5ml/L、膽固醇40ml/L、過氧化氫酶35ml/L，亞砸酸鈉17.3mg/L和I %二巰基乙醇溶液0.7ml/L。5.如權利要求1、3-4之一所述的培養基，其特征在于還包括如下含量的成分，所述含量單位為mg/L: L-精氨酸100?300、CuS04.5Η200.0005?0.005、L-天門冬酰胺25?75、L-天門冬氨酸 10 ?30^L-谷氨酸 10 ?30、Ni (NO3)2.6Η200.00002 ?0.0002、L_ 谷氨酰胺 200 ?500、ZnSO4.7Η200.06 ?0.6、甘氨酸 5 ?15、CoCl2.6Η20 0.001 ?0.008、L-組氨酸 10 ?30、NaS13.9Η200.001 ?0.0UL-異亮氨酸 25 ?27、Na3V04.12Η200.0005 ?0.005、L_ 賴氨酸鹽酸 20 ?60、SnCl2.2H20 0.00001 ?0.0001、L-蛋氨酸 10 ?30、Na2SeO30.002 ?0.01、L-苯丙氨酸10?30、FeSO4.7Η20 0.2?L 6、L-脯氨酸10?30、葡萄糖1000?4000、L-絲氨酸15?45、維生素C 0.176?0.704、L_蘇氨酸10?30、對羥基苯甲酸0.5?1.5、L-色氨酸5?15、丙酮酸鈉55?550、L_繳氨酸10?30、亞油酸0.01?0.05、L_亮氨酸25?75、β -巰基乙醇0.8?4.0、二水L-酪氨酸二鈉144?432、乙醇胺I?5、L-胱氨酸二鹽酸25?75。6.如權利要求1-5之一所述的培養基，其為用于CIK細胞培養的培養基。7.一種培養CIK細胞的方法，其特征在于使用如權利要求1-5之一所述的培養基培養。8.一種培養基的檢測方法，其特征在于，從如下幾個方面檢測1-5之一的細胞培養基:滲透壓、內毒素指標、無菌性、支原體檢測。
【專利摘要】本發明涉及生物、醫學領域，具體地是涉及一種免疫細胞的無血清培養基及其制備和用途。本發明的無血清培養基的主要成分為：地塞米松、人轉鐵蛋白、胰島素、膽固醇、過氧化氫酶、亞硒酸鈉和二巰基乙醇。本發明的無血清培養基對人體安全，能提高CIK細胞增殖速度和穩定細胞CD3+CD56+，并且有成分簡單、性狀穩定、誘導CIK增殖效率高、CD3+CD56+的陽性比例高，培養獲得的CIK細胞質量穩定的優點。
【IPC分類】C12N5/078, C12N5/0783
【公開號】CN105176925
【申請號】
【發明人】曲寶赤
【申請人】友康恒業生物科技（北京）有限公司
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年9月26日