一種軟骨再生干細胞制劑及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及干細胞治療領域，特別是涉及一種軟骨再生干細胞制劑及其應用。
【背景技術】
[0002]干細胞不僅具有自我復制能力，還能分化成其它多種細胞，是一種多潛能細胞。由于干細胞的此種特性，最近數年來利用干細胞的治療制劑及再生醫學領域受到了高度關注。一般干細胞可分為胚胎干細胞和成體干細胞，胚胎干細胞涉及倫理問題，并且存在引發癌變的潛在風險。近年來，成體干細胞的分化機理研究和治療方法及治療后效果的體系研究正積極展開，骨髓中提取的干細胞和臍帶血干細胞在疑難病中的臨床治療效果就是有力地證明了干細胞的重要性。
[0003]脂肪干細胞作為成體干細胞的一種，它可分化成脂肪、骨骼、軟骨肌肉、心臟、血管和神經等多種細胞及組織，由于脂肪干細胞的分離提取容易，單位體積中含有的干細胞數量多，所以目前以廣泛應用于疑難癥的研究和提高脂肪干細胞分化成軟骨細胞效率的研究居多，有研究表明，添加適量的TGF-beta，thrombospondin-2, BMP-2, BMP-7等生長因子更能提高軟骨的分化能力。近些年來，整形美容及再生醫學領域也對其進行著廣泛的研究和應用，由此可見，脂肪干細胞的市場應用前景極其廣泛。
[0004]人的關節由關節頭和關節窩組成，兩個骨骼間形成的關節腔內有起潤滑作用的潤滑液3-3.5ml。關節是人體組織中承受體重負荷最大的組織，是最容易磨損的部位，關節軟骨是一層軟骨組織，由軟骨細胞和豐富的細胞外基質組成，軟骨細胞占軟骨總體積的10%，在細胞外基質的合成和分泌中起重要的作用。關節軟骨組織沒有血管、神經及淋巴組織，如果受損就不會再生，關節損傷嚴重就會引發退行性關節炎等關節疾病，給日常生活和工作帶來極大的不便，軟骨損傷嚴重時只能用新的人工組織代替原有組織，到目前為止，這是唯一的代替不可再生關節的治療方法，但該方法半永久性的給患者帶來極大的經濟負擔。
[0005]雖然利用自體軟骨細胞移植的軟骨組織再生在近些年的臨床中得到應用，但受軟骨損傷部位和年齡等的限制，且若軟骨大范圍受損時不宜使用該法。因此為了克服以上問題，更有預測性的，更加安全的治療方法就是利用自體干細胞的軟骨再生治療術。脂肪干細胞有可分化成各種細胞的特性，為使其成為適合治療制劑，如何對其進行有效培養和分化能力最大化也在不斷的研發中。
[0006]當前脂肪干細胞的關節軟骨再生治療中需要解決以下幾個問題:1.通過脂肪干細胞的有效培養增加細胞的數量；2.避免使用牛血清帶來的病毒，細菌感染的可能性，免疫反應和感染等副作用；3.尋找使脂肪干細胞向軟骨細胞分化最大化的方法。
[0007]中國專利CN103087992A公開了一種用于軟骨損傷修復的改良脂肪干細胞，通過基因轉導技術誘導脂肪干細胞表達骨形態發生蛋白(BMP-4)或轉化生長因子(TGF-13 3)，這種性能增強的干細胞具有很好的增殖能力和軟骨修復能力，是一種很好的用于軟骨損傷修復的工具，BMP-4和TGF-β 3對干細胞有調節和營養作用，此發明通過病毒載體轉導的方法讓干細胞充分的表達這些營養因子，這些改良的脂肪干細胞和軟骨細胞共培養在成軟骨誘導培養基中向軟骨細胞分化的能力比普通的脂肪干細胞高，產生更多的II型膠原，形成的軟骨球更大更致密，同時，移植的干細胞在體內存活周期延長，延長了生長因子和營養因子對損傷部位的修復作用，促進軟骨的生長和傷口的較快愈合。但是，此方法通過病毒載體轉導的方式改良干細胞，其實這是一種轉基因技術，在沒有得到時間證明的情況下，無法預知是否對人體造成損傷，而且干細胞培養會出現癌變，若轉導基因，會大大提高癌變幾率。
【發明內容】
[0008]為了解決軟骨損傷治療成本高，治療效果差的問題，我們提出了一種軟骨再生干細胞制劑及其應用，采用本發明可以達到降低治療成本，治療效果好，治愈能力強，無副作用的目的。
[0009]本發明是通過以下技術方案實現的:
[0010]為實現上述目的，本發明提供一種軟骨再生干細胞制劑及其應用，步驟如下:
[0011](I)血清分離:從患者身上采集50ml血液，在常溫中放置1_3小時進行凝固；之后以1000-3000rpm，4°C離心5_20分鐘，收集血清；血清用滅菌的0.2μπι網過濾，分裝后在_20°C條件下長期保存；血清使用前在50-60°C水浴中進行滅活處理20-40分鐘。
[0012](2)分離脂肪干細胞:利用一般吸脂術從患者的大腿和/或腹部提取20-30ml脂肪；提取的脂肪組織利用磷酸鹽緩沖液PBS(phosphate buffer sulfate)和裂解緩沖液(lysis buffer)洗滌3-4次以清除紅血球；洗滌完畢后在1.5mg/ml膠原酶(collagenasetype I) 37°C條件下處理0.5-2小時，攪拌反應后1000-2000rpm離心5_20分鐘，分離提取出脂肪干細胞；利用100 μ m細胞篩過濾，過濾液1000-2000rpm離心5_20分鐘，分離提取高純度的脂肪干細胞。
[0013](3)培養脂肪干細胞:分離出的高純度脂肪干細胞在0.5_2g/L葡萄糖(glucose)，0.5-2%青霉素(penicillin)或鏈霉素(str印tomycin)，含有5-20%血清的DMEM培養基在37°C，5% CO2濃度條件下培養，24小時后更換培養基清除未附著的細胞并每3天更換一次培養基。
[0014](4)軟骨再生干細胞制劑的準備:培養出的脂肪干細胞通過胰酶-EDTA(trypsin-EDTA)處理，用1000-2000rpm離心10分鐘，離心完畢后用PBS溶液洗滌3-4次；提取1.0X 18個脂肪干細胞；用臺盼藍(trypan blue)染色確認細胞的成活率；在這些細胞中添加4-10ng/ml的細胞生長因子TGF-beta，50_200ug/ml的血小板反應蛋白2 (thrombospondin-2), 90-400ng/ml 的重組人骨形態發生蛋白-2 (BMP-2)，90-400ng/ml 的人骨形態發生蛋白-7 (BMP-7)后再追加1%透明質酸(hyaluronic acid) l_2ml制成自體干細胞混合制劑。
[0015](5)注射治療:制成的軟骨再生干細胞制劑用24-26gaze的針頭緩慢注射進關節腔內，劑量為l_3ml。
[0016]優選地，上述步驟(3)中血清為自體血清(AS)或胎牛血清(FBS)。異種血清可能帶來感染和免疫反應，因此，利用自體血清為治療載體更為常用，對有多分化能力的脂肪干細胞的培養數量和治療效果達到最優化。
[0017]本發明的有益效果在于:
[0018]1、自體血清培養基培養的脂肪干細胞，提高了該干細胞生長，可獲得有效性關節治療制劑。
[0019]2、為促進脂肪干細胞轉變成軟骨，添加適量生長因子(TGF-beta, thrombospondin-2，BMP-2, BMP-7)，做成高效干細胞混合制劑。
[0020]3、把干細胞混合制劑直接注射到關節腔這種安全方式。
【附圖說明】
[0021]圖1: 10%的自體血清(AS)和對比血清10%胎牛血清(FBS)中脂肪干細胞的培養及形態確認在顯微鏡下的結果。
[0022]圖2A，2B:通過FACS分析，從10%自體血清(AS)和對比血清10%胎牛血清(FBS)中培養出的脂肪干細胞的表現型確認結果。
[0023]圖3:利用免疫學染色法，確認10%自體血清(AS)和10%對比血清-胎牛血清(FBS)中培養細胞的表現型的結果。
[0024]圖4A: 10 %自體血清(AS)和10 %對比血清胎牛血清(FBS)中測出的單位時間內脂肪干細胞的數量圖。
[0025]圖4B:利用WST-8分析法體現10 %自體血清和(AS) 10 %對比血清牛血清(FBS)時表現脂肪干細胞增殖的圖。
[0026]圖5:利用Oil red O染色法確認使用10%自體血清和(AS) 10%的對比血清牛血清(FBS)時分化成脂肪的分化能力。
[0027]圖6A:關節內結構。
[0028]圖6B:關節內注入關節治療劑一干細胞混合制劑。
【具體實施方式】
[0029]下面結合實施例，更具體地說明本發明的內容。應當理解，本發明的實施并不局限于下面的實施例，對本發明所做的任何形式上的變通或改變都落入本發明保護范圍；且下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領域的常規方法。
[0030]實施例:
[0031]—種軟骨再生干細胞制劑及其應用，步驟如下:
[0032](I)血清分離:從患者身上采集50ml血液，在常溫中放置2小時進行凝固；之后以1800rpm，4°C離心10分鐘，收集血清；血清用滅菌的0.2 μ m網過濾，分裝后在_20°C條件下長期保存；血清使用前在56°C水浴中進行滅活處理30分鐘。
[0033](2)分離脂肪干細胞:利用一般吸脂術從患者的大腿和/或腹部提取25ml脂肪；提取的脂肪組織利用磷酸鹽緩沖液PBS(phosphate buffer sulfate)和裂解緩沖液(lysisbuffer)洗滌3次以清除紅血球；洗滌完畢后在1.5mg/ml膠原酶(collagenase typeI)37°C條件下處理I小時，攪拌反應后1500rpm離心10分鐘，分離提取出脂肪干細胞；利用100 μ m細胞篩過濾，過濾液1500rpm離心10分鐘，分離提取高純度的脂肪干細胞。
[0034](3)培養脂肪干細胞:分離出的高純度脂肪干細胞在lg/L葡萄糖(glucose) ,1%青霉素(penicillin)或鏈霉素(str印tomycin)，含有10%血清的DMEM培養基在37°C，5%CO2濃度條件下培養，24小時后更換培養基清除未附著的細胞并每3天更換一次培養基。
[0035](4)細胞培養檢測:為確認脂肪干細胞在10%自體血清(AS)和10%胎牛血清(FBS)條件下的培養，在原代培養(PC)和繼代培養第3代(paSSage3 ;P3)中利用顯微鏡觀察細胞的形態。其結果10%自體血清(AS)和胎牛血清(FBS))條件下肉眼確認了脂肪干細胞形態的一致(圖1).。這個結果揭示利用培養脂