一種免疫細胞無血清培養基及其制備和用圖
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物、醫學領域，具體地是涉及一種免疫細胞的無血清培養基及其用途。
【背景技術】
[0002]腫瘤過繼免疫治療(adoptive immunotherapy, ACI)是指通過向腫瘤患者輸注具有抗腫瘤活性的免疫細胞，直接殺傷或激發機體免疫反應殺傷腫瘤細胞，達到治療腫瘤的目的。它包括非特異性激活和特異性激活的效應細胞，前者是采用非特異性刺激因子(IL-2、干擾素)刺激前體效應細胞，使其活化為具有抗腫瘤活性的效應細胞，如LAK細胞、腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)、細胞因子誘導的殺傷細胞(Cytokine induced killer cells，CIK)等；特異性激活的效應細胞是指采用腫瘤抗原作刺激物所誘導的抗腫瘤效應細胞，如樹突狀細胞(DC)，細胞毒T淋巴細胞(CD8+細胞)等。ACI可通過體外擴增篩選出高活性的免疫效應細胞，將其轉入宿主體內并建立長期的特異性抗腫瘤免疫效應，克服了疫苗免疫治療的諸多缺陷，具有良好的應用前景。
[0003]CIK是單個核細胞在⑶3單抗和多種細胞因子(包括IFN- γ，IL-2等)的作用下培養獲得的一群以CD3+CD56+細胞為主要效應細胞的異質細胞群，其既具有T淋巴細胞強大的抗腫瘤活性，又具有NK細胞(自然殺傷細胞)的非MHC (主要組織相容性抗原)限制性腫瘤殺傷能力。CIK細胞具有殺瘤活性高、殺瘤譜廣，對正常組織毒性低，體外可高度擴增等特點。
[0004]傳統對CIK體外擴增的方法為從人外周血內提取單個核細胞，體外添加干擾素、CD3、白介素2進行誘導培養連續14天。傳統方法細胞增殖慢、倍增時間長、細胞CD3+CD56+陽性率比例不穩定。并且由于采用含有動物或人血清的細胞培養基培養，而動物或人血清中含有病原體或不確定物質，會對培養細胞帶來危險或不確定的危害。并且傳統培養基成分不穩定無法進行后期質量控制，無法在工業上大規模生產。
[0005]因此亟需開發能克服上述缺陷的無血清培養基。
【發明內容】
[0006]本發明將提供一種對人體安全的，能提高CIK細胞增殖速度和穩定細胞CD3+CD56+的培養基。
[0007]本發明提供一種免疫細胞細胞培養基，其特征在于包括如下成分:地塞米松、人轉鐵蛋白、胰島素、膽固醇、過氧化氫酶、亞砸酸鈉和二巰基乙醇。
[0008]優選的，其成分含量如下:地塞米松0.001?0.005mg/L、人轉鐵蛋白5?50mg/L、胰島素8-20mg/L、純化人轉鐵蛋白l_30mg/L、膽固醇20_60mg/L、過氧化氫酶20_50mg/L、亞砸酸鈉 17.3-35mg/L、l%二巰基乙醇溶液 0.35-1.0ml/L。
[0009]最優選的，各成分含量為:地塞米松0.003ml/L、人轉鐵蛋白30ml/L、胰島素1ml/L、純化人轉鐵蛋白5ml/L、膽固醇40ml/L、過氧化氫酶35ml/L，亞砸酸鈉17.3mg/L和1%二巰基乙醇溶液0.7ml/Lo
[0010]進一步地本發明還提供一種培養基，還包括如下成分:L_精氨酸、CuSO4.5H20、L-天門冬酰胺、L-天門冬氨酸、L-谷氨酸、Ni (NO3)2.6H20、L-谷氨酰胺、ZnSO4.7H20、甘氨酸、CoC12.6H20、L-組氨酸、NaS13.9H20、L-異亮氨酸、Na3VO4.12H20、L-賴氨酸鹽酸、SnCl2.2H20、L-蛋氨酸、Na2Se03、L-苯丙氨酸、FeSO4.7H20、L-脯氨酸、葡萄糖、L-絲氨酸、維生素C、L-蘇氨酸、對羥基苯甲酸、L-色氨酸、丙酮酸鈉、L-纈氨酸、亞油酸、L-亮氨酸、β -巰基乙醇、二水L-酪氨酸二鈉、乙醇胺、L-胱氨酸二鹽酸。
[0011]優選的，其含量的成分如下，所述含量單位為mg/L:L-精氨酸100?300、CuSO4.5H200.0005?0.005、L-天門冬酰胺25?75、L-天門冬氨酸10?30、L-谷氨酸10 ?30、Ni (N03) 2.6H20 0.00002 ?0.0002、L-谷氨酰胺 200 ?500、ZnSO4.7H200.06 ?0.6、甘氨酸 5 ?15、CoC12.6Η20 0.001 ?0.008^L-組氨酸 10 ?30^NaS13.9Η200.001 ?0.01、L-異亮氨酸 25 ?27、Na3VO4.12Η20 0.0005 ?0.005、L-賴氨酸鹽酸 20 ?60、SnCl2.2Η20 0.00001 ?0.000UL-蛋氨酸 10 ?30、Na2SeO30.002 ~ 0.0UL-苯丙氨酸 10 ?30、FeSO4.7Η20 0.2 ?1.6、L-脯氨酸 10 ?30、葡萄糖 1000 ?4000、L-絲氨酸 15 ?45、維生素C 0.176?0.704^-蘇氨酸10?30、對羥基苯甲酸0.5?1.5、L_色氨酸5?15、丙酮酸鈉55?550、L-纈氨酸10?30、亞油酸0.01?0.05,L-亮氨酸25?75、β -巰基乙醇0.8?4.0、二水L-酪氨酸二鈉144?432、乙醇胺I?5、L-胱氨酸二鹽酸25?75。
[0012]本發明提供的培養基，可用于CIK細胞培養。
[0013]本發明還提供一種培養CIK細胞的方法，使用本發明的培養基培養。
[0014]本發明還提供一種培養基的檢測方法，從如下幾個方面檢測細胞培養基:滲透壓、內毒素指標、無菌性、支原體檢測。
[0015]用本發明的培養基最終誘導的CIK細胞總數在14天內可達到2Χ101(]個，⑶3+、⑶56+陽性率最低10%，最高可達到50%，細胞存活率大于95%，優于傳統的培養基。本發明的培養基還有穩定性好、可質控的特點。
【具體實施方式】
[0016]實施例1
[0017]按如下配比稱取試劑，其最終的濃度單位為mg/L:L-精氨酸300、CuSO4.5H200.005、L-天門冬酰胺 75、L-天門冬氨酸 30、L-谷氨酸 30、Ni (NO3)2.6H20 0.0002、L-谷氨酰胺 500、ZnSO4.7H20 0.6、甘氨酸 15、CoCl2.6H20 0.008、L-組氨酸 30、NaS13.9H200.01、L-異亮氨酸 27、Na3VO4.12H20 0.005、L-賴氨酸鹽酸 60、SnCl2.2H20 0.0001、L-蛋氨酸 30、Na2SeO30.01、L-苯丙氨酸 30、FeSO4.7Η20 1.6、L-脯氨酸 30、葡萄糖 4000、L-絲氨酸45、維生素C 0.704,L-蘇氨酸30、對羥基苯甲酸1.5、L_色氨酸15、丙酮酸鈉550,L-纈氨酸30、亞油酸0.05、L-亮氨酸75、β -巰基乙醇4.0、二水L-酪氨酸二鈉432、乙醇胺5、L-胱氨酸二鹽酸75、地塞米松0.005、人轉鐵蛋白50、胰島素20、純化人轉鐵蛋白30、膽固醇60、過氧化氫酶50、亞砸酸鈉35和I %二巰基乙醇溶液1.0ml/Lo
[0018]實施例2
[0019]按如下配比稱取試劑，其最終的濃度單位為mg/L:
[0020]L-精氨酸100、CuSO4.5H200.0005、L-天門冬酰胺25、L-天門冬氨酸10、L-谷氨酸 10、Ni (NO3)2.6H20 0.00002、L-谷氨酰胺 200、ZnSO4.7Η200.06、甘氨酸 5、CoCl2.6Η200.001、L-組氨酸 10、NaS13.9Η200.001、L-異亮氨酸 25、Na3VO4.12Η20 0.0005、L-賴氨酸鹽酸 20、SnCl2.2Η20 0.0000UL-蛋氨酸 10、Na2SeO30.002、L-苯丙氨酸 10、FeSO4.7Η200.2、L-脯氨酸10、葡萄糖1000、L-絲氨酸15、維生素C 0.176、L-蘇氨酸10、對羥基苯甲酸0.5、L-色氨酸5、丙酮酸鈉55、L-纈氨酸10、亞油酸0.01、L-亮氨酸25、β -巰基乙醇0.8、二水L-酪氨酸二鈉144、乙醇胺1、L-胱氨酸二鹽酸25、地塞米松0.001、人轉鐵蛋白
5、胰島素8、純化人轉鐵蛋白1、膽固醇20和、過氧化氫酶20、亞砸酸鈉17.3和1%二巰基乙醇溶液0.35ml/L。
[0021]實施例3
[0022]按如下配比稱取試劑，其最終的濃度單位為mg/L:
[0023]L-精氨酸150、CuSO4.5H200.001、L-天門冬酰胺50、L-天門冬氨酸20、L-谷氨酸 20、Ni (NO3)2.6H20 0.0001、L-谷氨酰胺 300、ZnSO4.7Η200.03、甘氨酸 10、CoCl2.6Η200.004、L-組氨酸 20、NaS13.9Η200.008、L-異亮氨酸 26、Na3VO4.12Η20 0.000UL-賴氨酸鹽酸 30、SnCl2.2Η20 0.00008、L_ 蛋氨酸 20^Na2SeO30.008^L-苯丙氨酸 20^FeSO4.7Η201.0、L-脯氨酸20、葡萄糖2000、L-絲氨酸30、維生素C 0.374、L-蘇氨酸20、對羥基苯甲酸1.0、L-色氨酸10、丙酮酸鈉350、L-纈氨酸20、亞油酸0.04、L-亮氨酸50、β -巰基乙醇2.3、二水L-酪氨酸二鈉319、乙醇胺4、L-胱氨酸二鹽酸50、地塞米松0.003、人轉鐵蛋白25、胰島素:10、純化人轉鐵蛋白5、膽固醇40、過氧化氫酶30、亞砸酸鈉17.3，以及I %二巰基乙醇溶液0.8ml/L
[0024]實施例4
[0025]CIK細胞獲取
[0026]取患者外周血50ml，轉入2支50ml離心管，1600rpm(400g)離心5min