專利名稱：4，5二氨基1-吡唑硫酸鹽降解菌及其生產的菌劑的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種4，5 二氨基I-吡唑硫酸鹽降解菌及其生產的菌劑，是利用微生物的方法降解染料，適用于環境污染的治理。
背景技術：
隨著現代合成工業的發展，大量異生化合物(Xenobiotics)進入工業廢水和城市污水中，由于其本身具有的結構復雜性和生物陌生性，污染環境中能降解轉化污染物的土著微生物種類和數量較少，甚至沒有能降解某些特殊污染物的土著微生物。即使土著微生物群落能降解污染物但也不能足夠快速地降解以阻止污染物的蔓延，當快速反應顯得非常重要時，少量的土著微生物群落就不適用了，這些有毒難降解有機物很難在短時間內被常規生物處理系統中的微生物分解氧化。由于(I)原有工藝不能有效維持連續的馴化培養 物；(2)廢水中含有不穩定的組分，沖擊負荷大；(3)有毒有機物在系統中降解速率緩慢，應用常規生物處理工藝已不能有效地予以處理，傳統的廢水生物處理技術面臨極大挑戰。為此，國外研究者提出生物強化(Bioaugmentation)技術提高現有處理工藝對有毒難降解有機物的生物降解效率。生物強化技術是指在生物處理系統中，通過投加具有特定功能的微生物、營養物或基質類似物，增強處理系統對特定污染物的降解能力，提高降解速率，達到有效處理含難降解有機物廢水的目的。目前，生物強化技術的應用方式、方法有很多，生物強化技術中投加的微生物可以來源于原有處理體系，也可以是原來不存在的外源微生物或遺傳工程菌。這些降解菌在純培養體系中大多數都能表現出高活性，但在多菌株共存的生物處理系統中，投加純培養高效降解菌株(菌劑)后，能否起到強化生物處理作用，在實際生產中，效果難以預料。要使高效菌持續發揮作用必須滿足下列條件(I)投加后菌體具有的高活性不被破壞；(2)菌體可快速降解目標污染物；(3)在系統中(如曝氣池)不僅要具有競爭性生存的能力，而且生物量還應具有一定的水平。自然界中能降解吡唑類的微生物資源正在不斷被發現，這些微生物資源為難降解有機工業廢水的強化處理奠定了基礎。4，5 二氨基-I-吡唑硫酸鹽(俗稱P5)是近年來國際上新開發的應用于生產染發劑的中間體，國際上該產品耗量為1000噸/年，該產品可溶于水。4，5 二氨基-I-吡唑硫酸鹽對環境的污染，已嚴重危害著人類的健康其環境的綜合治理，4，5 二氨基-I-吡唑硫酸鹽在環境中的降解行為一直未見有比較成熟的技術。
發明內容
本發明的一個目的是提供了一種4，5 二氨基I-吡唑硫酸鹽降解菌。本發明提供的4，5 二氨基-I-吡唑硫酸鹽降解菌，其菌株是皺膜假絲酵母菌{Candida rugopelliculosa)的菌株L_l,于2012年3月2日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)Jia :北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏編號CGMCC NO. 5834，主要生物學特性為兼性好氧，白色，卵形至臘腸形，大小為3.0 5.0 X
5.6 10. 2 um ;菌落松脆狀，淺褐色，無光澤，有紋狀皺折，邊緣蝕刻狀；玉米粉瓊脂Dalmau平板培養時有假菌絲產生；能以4，5 二氨基I-吡唑硫酸鹽或葡萄糖為碳源進行生長，最適生長溫度為30°C。本發明的另一個目的提供利用上述的4，5 二氨基-I-吡唑硫酸鹽降解菌生產菌劑的方法，其工藝為斜面種一搖瓶種子液一種子罐一產品(包裝劑型為液體菌劑)。該方法的具體步驟是
步驟(I).將4，5 二氨基-I-吡唑硫酸鹽降解菌的試管種接種于發酵培養基中，振蕩培養至對數期；
步驟(2).將上述培養好的菌種按10%的接種量接種入500L種子罐，培養至對數生長期，種子罐所用的培養基配方及質量含量為葡萄糖0. 1%、蛋白胨0. 5%、酵母膏0. 25%，用蒸餾水配制，pH為7. 2 7. 5 ； 步驟(3).將種子液按10%接種量接入生產罐培養，生產罐所用培養基與種子罐培養基相同；
步驟(4).在種子罐和生產罐的培養過程中無菌空氣的通氣量為1:0. 6 I. 2，攪拌速度為180 240r/min，培養溫度為30°C，整個工藝流程培養時間為48 60h，發酵結束后菌體數量達到10億個/ml以上，發酵完成后培養液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑，該液體劑即為菌劑。本發明的具體有益效果
使用該發明的4，5 二氨基-I-吡唑硫酸鹽的降解菌劑具有生產使用成本低，使用方便，去除效果好的優點，適合水及土壤的污染治理。本發明對于保護生態環境，保護人類身體健康，提高農產品的附加值具有重要的意義。降解菌L-I能使4，5 二氨基-I-吡唑硫酸鹽的殘留量降低80%以上。L-I菌株能以4，5 二氨基-I-吡唑硫酸鹽為碳源和能源進行生長，并可在短時間內4，5 二氨基-I-吡唑硫酸鹽降解。
圖I菌株L-I菌落照片；
圖2菌株L-I電鏡照片；
圖3接種量對L-I降解效率的影響；
圖4初始pH對L-I降解效率的影響；
圖5溫度對L-I降解效率的影響。
具體實施例方式4，5 二氨基-I-吡唑硫酸鹽降解菌，于2012年3月2日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)Jia :北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏編號CGMCC NO. 5834，分類命名是皺膜假絲酵母菌rugopelliculosa),I.菌株的分離和鑒定
取污染土壤IOg,置于IOOml的無菌水中，振蕩5min,得土壤菌懸液；取5ml的土壤菌懸液，加入到 IOOml 的無機鹽培養基[NH4NO3 :407 mg/L ；KH2PO4 :98 mg/L ；K2HPO4 :33 mg/L ；NaCl 30 mg/L ；MgS04 : 2 00 mg/L ；pH 7. 0]中，添加4，5 二氨基I-吡唑硫酸鹽作為碳源，置于30°C，150r/min搖床培養獲得富集液，連續在添加4，5 二氨基I-吡唑硫酸鹽的培養基平板上涂布，直到獲得4，5 二氨基I-吡唑硫酸鹽的降解菌株。如圖I、圖2所示，該降解菌命名為L-1,進一步純化并鑒定為皺膜假絲酵母菌rugopelliculosa)。L_1菌株主要生物學特性為兼性好氧，白色，卵形至臘腸形，大小為3. O 5. O X 5. 6 10. 2 um ;菌落松脆狀，淺褐色，無光澤，有紋狀皺折，邊緣蝕刻狀；玉米粉瓊脂Dalmau平板培養時有假菌絲產生；能以4，5 二氨基I-吡唑硫酸鹽或葡萄糖為碳源進行生長，最適生長溫度為30°C。在實驗室搖瓶培養條件下4，5 二氨基I-吡唑硫酸鹽的降解率達70%以上(如圖I所示)。該菌可以用發酵工業通用發酵設備進行生產。2.實驗室生物降解實驗
2. I接種量對L-I降解效率的影響
菌株L-I在YEH)培養基(YEH)培養基配方g/1 :酵母粉10g/l，蛋白胨20g/l，，葡萄糖20g/l，pH7. 0)中培養至對數期，按0. 5%、1%、2%、3%、4%、5%的接種量分別接種到培 養液[無機鹽培養基(NH4NO3 :407 mg/L ；KH2PO4 :98 mg/L ；K2HPO4 :33 mg/L ；NaCl :30 mg/L ；MgSO4 200 mg/L) ;4, 5 二氨基 I-卩比唑硫酸鹽100 mg/L,葡萄糖 1000 mg/L, pH 7.0],置于30°C、150r/min搖床培養，在培養24 h后分別測定培養液在600 nm處的OD值。結果如圖3所示，接種量越大，4，5 二氨基I-吡唑硫酸鹽的降解效率就越高；當接種量大于2%時在增大接種量對4，5 二氨基I-吡唑硫酸鹽降解影響不大。雖然菌體的生長量隨著接種量增加而提高，考慮到菌體生長情況以及經濟的原因，采用1%的接種量即可達到要求。2. 2 pH對L-I降解效率的影響
PH值是影響微生物生長和生存的另一個重要環境因素，微生物生長有一個適宜的pH值范圍，超過適宜生長的pH值范圍，大多數微生物都不能很好人的生長。菌株L-I在YEro培養基(YEH)培養基配方酵母粉10g/l，蛋白胨20g/l，，葡萄糖20g/l，pH7. 0)中培養至對數期；按1%的接種量分別接種到七種不同pH的培養液，其中培養液[無機鹽培養基(NH4NO3 :407 mg/L ；KH2PO4 :98 mg/L ；K2HPO4 :33 mg/L ；NaCl :30 mg/L ；MgS04 200 mg/L) ;4, 5 二氨基 I-卩比唑硫酸鹽100 mg/L,葡萄糖 1000 mg/L] pH 值分別調至 2. 0、4. 0、6. 0、7. 0、8. 0,10. 0 ;置于 30°CU50r/min 搖床培養，在培養后 8h、16h、24h 和32h分別測定培養液在600 nm處的OD值。pH對菌株L-I生長的影響如圖4所示。結果表明L-1菌株生長的適宜pH值范圍在2 7，最佳pH值為6 7。2. 3溫度對L-I降解效率的影響
溫度是影響微生物生長和生存的最重要的環境因素之一。菌株L-I在YEH)培養基(YEro培養基配方g/1 :酵母粉10g，蛋白胨20g，，葡萄糖20g，pH7. 0)中培養至對數期，按1%的接種量接種到培養液[無機鹽培養基(NH4NO3 :407 mg/L ；KH2PO4 :98 mg/L ；K2HPO4 :33mg/L ；NaCl :30 mg/L ；MgSO4 :200 mg/L)；4, 5 二氨基 I-卩比唑硫酸鹽:100 mg/L,葡萄糖 1000mg/L, pH 7.0]，分別置于 18°C、28°C、30°C、33°C、37°C下培養，在培養后 8 h、16 h 和 24h 分別測定培養液在600 nm處的OD值。溫度對菌株L-I生長的影響如圖5所示。結果表明在實驗的溫度范圍內，菌體均有不同程度的生長，溫度為28 30°C時，生長最好，超過或低于該溫度時，菌體生長速度減慢，而在37°C下培養時菌種易老化。因此，假絲酵母菌L-I的最佳生長溫度為28 30°C。3.生產實施例
將4，5 二氨基-I-吡唑硫酸鹽降解菌的試管種接種到發酵培養基中，振蕩培養至對數期,準備接種種子罐；然后將上述培養好的菌種按10%的接種量接種到500L種子罐，恒溫培養至對數生長期，無菌空氣的通氣量為1:0. 6 I. 2，培養溫度為30°C，攪拌速度為180 240r/min，種子罐所用的培養基配方的質量含量為葡萄糖0. 1%，蛋白胨0. 5%，酵母膏0. 25%，用無菌水配制，pH7. 2 7. 5 ;將種子罐中的種子液按10%接種量接入生產罐中培養，生產罐所用培養基與種子罐培養基相同，無菌空氣的通氣量為1:0. 6 I. 2,培養溫度為30°C，攪拌速度為180 240r/min，整個工藝流程培養時間為48 60h。發酵結束后菌體數量達到10億個/ml以上。發酵完成后培養液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑。該液體劑即為 菌劑。
權利要求
1.4, 5 二氨基I-批唑硫酸鹽降解菌，其特征在于該菌株是皺膜假絲酵母菌Candidarugopelliculosa的菌株L_l,于2012年3月2日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCCJia :北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏編號CGMCC NO. 5834，主要生物學特性為兼性好氧，白色，卵形至臘腸形，大小為3. 0 5. 0 X 5. 6 10. 2 um ；菌落松脆狀，淺褐色，無光澤，有紋狀皺折，邊緣蝕刻狀；玉米粉瓊脂Dalmau平板培養時有假菌絲產生；能以4，5 二氨基I-吡唑硫酸鹽或葡萄糖為碳源進行生長，最適生長溫度為30。。。
2.一種用權利要求I所述的4，5 二氨基I-吡唑硫酸鹽降解菌生產的降解菌劑，通過以下方法生產而成 步驟(I).將4，5 二氨基-I-吡唑硫酸鹽降解菌的試管種接種于發酵培養基中，振蕩培養至對數期； 步驟(2).將上述培養好的菌種按10%的接種量接種入500L種子罐，培養至對數生長期，種子罐所用的培養基配方及質量含量為葡萄糖0. 1%、蛋白胨0. 5%、酵母膏0. 25%，用蒸餾水配制，pH為7. 2 7. 5 ； 步驟(3).將種子液按10%接種量接入生產罐培養，生產罐所用培養基與種子罐培養基相同； 步驟(4).在種子罐和生產罐的培養過程中無菌空氣的通氣量為1:0. 6 I. 2，攪拌速度為180 240r/min，培養溫度為30°C，整個工藝流程培養時間為48 60h，發酵結束后菌體數量達到10億個/ml以上，發酵完成后培養液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑，該液體劑即為菌劑。
全文摘要
本發明公布一種4，5二氨基1-吡唑硫酸鹽降解菌及其生產的菌劑。所用的菌株為皺膜假絲酵母菌Candidarugopelliculosa的菌株L-1，保藏編號CGMCCNO.5834，主要生物學特性為兼性好氧，白色，卵形至臘腸形，大小為3.0～5.0×5.6～10.2um；菌落松脆狀，淺褐色，無光澤，有紋狀皺折，邊緣蝕刻狀；玉米粉瓊脂Dalmau平板培養時有假菌絲產生；能以4，5二氨基1-吡唑硫酸鹽或葡萄糖為碳源進行生長，最適生長溫度為30℃。在實驗室搖瓶培養條件下4，5二氨基1-吡唑硫酸鹽的降解率達70％以上。該降解菌劑具有成本低，使用方便，去除效果好的優點，適合水及土壤的污染治理。
文檔編號C02F3/34GK102776132SQ201210125540
公開日2012年11月14日 申請日期2012年4月26日 優先權日2012年4月26日
發明者劉秀艷, 張跡 申請人:杭州電子科技大學