一種石油降解菌p-6及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明具體涉及一種石油降解菌p-6及其應用。
【背景技術】
[0002] 在原油的開采、運輸、儲存、煉制和使用過程中，大量原油及其衍生產品不可避免 地進入環境，對河流、土壤、地下水以及海洋等環境造成嚴重污染。在陸地，原油污染一般由 輸油管道破裂、儲油罐滲漏等造成；在海洋中，沿海工業尤其是煉油廠的排放以及各類溢油 事故是原油污染的重要來源。據不完全統計，全世界平均每年有600-1000萬噸原油通過各 種途徑進入環境（王連生，1994)，之后通過機械作用、物理化學作用和生物作用等擴散至 污染點以外的更大范圍。原油的化學組成復雜，包括烷烴、環烷烴、芳香烴等多種有毒物質， 其中一些化合物如多環芳烴具有潛在或被證實的致癌變、致突變和致畸變作用，并能通過 食物鏈在動植物及人體內富集，對生態環境和人類健康造成巨大威脅。
[0003] 近年來，采用生物修復技術去除環境中的原油污染物已成為國內外學者的熱點 之一，該技術具有經濟高效、環境友好，不產生二次污染的特點，較之傳統的物理、化學修 復法具有明顯優勢。生物修復技術的關鍵是篩選出能夠高效降解目標污染物的微生物。 原油中包含了以稠環芳香烴為代表的多種難降解有機物，生物可利用性低，已有降解微生 物對原油的降解能力存在很大差異。信艷娟等分離出一株原油降解菌Nitratireductor basaltis，14d內對原油（初始濃度為lg/L)的平均降解率為63.5%。（信艷娟，劉亞男， 吳佩春，曹旭鵬，薛松，一株原油降解菌的分離鑒定及降解特性研宄，微生物學通報，2013， 40(4) :558_566.)袁紅莉等篩選出的原油降解菌Corynebacterium ptrl3,對原油（0.05g/ L)的7d降解率為41 %。（袁紅莉，楊金水，王占生，李寶珍，仉嘉，林壬子，降解石油微生物 菌種的篩選及降解特性，中國環境科學，2003,23(2) :157-161.)馮晉陽和吳小寧從長期被 石油污染土壤中馴化得到的Microbacterium菌屬原油降解菌SY1，雖然SY1對原油的5d降 解率為66. 1%，但是降解體系中原油的初始濃度僅為0. 5g/L。（馮晉陽，吳小寧，高效原油 降解菌的篩選及其在生物活性炭中的應用，環境污染與防治，2011，33(6) :39-43.)因此， 有必要進一步篩選高效原油降解菌，研宄其降解特性，為原油污染環境的生物治理提供菌 株和基因材料。
【發明內容】
[0004] 發明目的：本發明的目的在于提供一種石油降解菌P-6,該菌已于2014年10月31 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 9913。
[0005] 本發明的另一個目的在于提供上述石油降解菌p-6的應用。
[0006] 為實現上述技術目的，本發明采取的技術方案如下：
[0007] -種石油降解菌P-6,其分類命名為微桿菌Microbacterium sp. P-6,已于2014年 10月31日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽 區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研宄所，登記入冊編號為CGMCC No. 9913。所述 石油降解菌P-6以沙特原油為唯一碳源和能源篩選得到，菌株P-6呈桿狀，革蘭氏染色結果 呈陰性。菌株P-6能夠在溫度15-35°C，pH 5-9的范圍內以原油為唯一碳源進行生長繁殖。 菌株P-6在NCBI的GenBank數據庫中的序列登錄號為HM107776。該細菌與微桿細菌聚在 一群，其中，p-6 與 Microbacterium sp.Sq(NCBI 登錄號 EU293209)同源性最高，達 100%。 用MEGA4. 1計算出序列的系統進化距離，采用鄰位相連法構建系統進化樹，將菌株P-6鑒定 為 Microbacterium sp. P-6〇
[0008] 本菌株于2009年9月篩選得到，篩選方法如下：
[0009] 原油污染土樣：某加油站儲油管道長期滴漏部分下方地表以下0. 5m~lm處的被 污染土壤。
[0010] 原油：來自中石化加油站提供的沙特原油。
[0011] 富集培養基：牛肉膏0. 5%、蛋白胨1. 0%、NaC10. 5%，pH7. 0~7. 2。配制固體培 養基時添加2.0 %的瓊脂。
[0012] 無機鹽基礎培養基（mineral salt medium，MSM) (I71) :100mL磷酸鹽緩沖液 (pH7. 0)，0? 0675g MgS04,0 . 0 3 64g CaCl2,1. OmL FeCl3溶液（0? 25g .L-1)，1. OmL 微量元素溶 液[Mn2S04 39 . 9mg，ZnS04 ? H20 42. 8mg，（NH4)6M07024 ? 4H20 34. 7mg，水 1. 0L]，pH 7. 0。
[0013] 原油選擇培養基：在無機鹽基礎培養基中加入一定量的原油。為了使原油在MSM 中分布均勻，采用帶棉塞的滅菌錐形瓶蒸發含有目標濃度原油的石油醚，使得原油在玻璃 器皿壁上形成一薄層，在無菌條件下加入MSM，30°C恒溫水浴超聲，直至形成乳濁液。
[0014] 原油固體選擇培養基：在55°C的恒溫水浴條件下，將液態原油選擇培養基與熔化 的瓊脂溶液相混合。使用雙層瓊脂技術，將混合液傾倒至已事先制備好的MSM固態培養基 上。
[0015] 以上培養基使用前均在0? 1M Pa，121°C，滅菌30min。
[0016] 篩選步驟：稱取10g原油污染土樣于200mL無菌去離子水中溶解振蕩，靜置ld，取 上清液接入原油選擇培養基中，接種量5%，原油濃度1000mg/L。30°C、120rpm下連續培養 7d。取5%培養液接入原油濃度為1200mg/L的原油選擇培養基中，繼續30°C、130rpm下連 續培養7d，重復上述步驟連續培養5次，每次原油濃度遞增100mg/L。吸取經多次馴化后的 培養液涂布于原油固體選擇培養基平板上，待菌落長好后，選擇生長良好，菌苔較大且形態 特征各異的菌落，于富集培養基固體平板上劃線分離、純化。連續多次劃線純化后，得到不 同形態特征且生長良好的菌株，進一步接種至原油選擇培養基中測定其原油降解能力，最 后獲得一株高效原油降解菌P-6。
[0017] 本發明同時提出了上述石油降解菌P-6在降解石油中的應用。
[0018] 本發明進一步提出了上述石油降解菌P-6在生物修復去除環境中的原油污染物 中的應用。
[0019] 本發明還提出了上述石油降解菌P-6在生物修復原油污染土壤和污染地下水中 的應用。
[0020] 有益效果：研宄結果表明，本發明提出的石油降解菌p-6在最適溫度20°C