專利名稱：一種氯代乙酰胺類除草劑降解菌及其生產的菌劑和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于環境污染生物修復領域，涉及一種氯代乙酰胺類除草劑降解菌及其生產的菌劑和應用。
背景技術：
氯代乙酰胺類除草劑是一類高效、高選擇性除草劑，因分子結構中具有氯乙酰胺基團而得名。目前主要品種包括乙草胺、丁草胺、甲草胺和異丙甲草胺等，在農業上廣泛用于防除一年生禾本科雜草及部分闊葉雜草。氯代酰胺類除草劑是目前國際上大量使用的除草劑之一，目前年產量與使用面積僅次于有機磷除草劑，居世界第二位，且隨著農業勞動 力的減少和農業耕種方式的改變，該類除草劑的需求和使用量還將持續增加。氯代乙酰胺類除草劑不易揮發及化學水解，在土壤殘留期長達I個月以上，其殘留進入環境及農產品對人類健康和環境產生嚴重的危害，研究表明該類除草劑有些品種具有一定的致畸變和致突變性，乙草胺、丁草胺和甲草胺被美國環保局定為B-2類致癌物，異丙甲草胺被定為C類致癌物(USEAP，1994)。氯代乙酰胺類除草劑對魚類有很強的毒性，比對哺乳動物的毒性大500-10000倍，如丁草胺對鯉魚和藍鰓魚96h的致死濃度分別僅有0. 32mL kg—1和0. 044mL -kg^1,因此該類除草劑進入水體將會對漁業資源帶來嚴重的危害。此外，氯代乙酰胺類除草劑如乙草胺和丁草胺對農作物具有較嚴重的藥害，特別是在有機質含量較低的砂型土壤、或用藥量過大、或施藥后遇持續低溫高濕天氣時，會嚴重影響作物的生長，近年來我國因乙草胺和丁草胺因使用不當帶來的作物藥害時有發生，對農業造成嚴重的損失。因此，土壤和水體環境中氯代乙酞胺類除草劑殘留污染嚴重危害人類健康、破壞生態環境及對作物具有嚴重藥害，其在環境中的吸附、遷移、轉化和降解等生態行為越來越受到關注。微生物降解修復技術是近幾十年才興起的一種新型的環境污染修復技術。該技術和物理化學方法相比，具有很多無可比擬的優點，如處理效果好，適合有毒有害有機污染物大面積面源污染的降解修復，修復費用較低(僅為傳統化學、物理修復經費的10%左右)，不產生二次污染等。在國內外，生物修復技術已經廣泛應用于石油、化工和農藥殘留有機污染的清除。目前，國內外已經有關于氯代乙酰胺類除草劑微生物降解的報道，但到目前為止還未見能同時降解甲草胺，乙草胺和丁草胺等多種氯代乙酰胺類除草劑生物修復技術專利的研究和應用報道。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供一種氯代乙酰胺類除草劑降解菌。本發明的另一目的是提供該氯代乙酰胺類除草劑降解菌生產的菌劑。
本發明的友誼目的是提供該降解菌的應用。本發明的目的可通過如下技術方案實現鞘酯菌(Sphingobiumquisquiliarum)DC_2，2012 年 5 月 30 日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO M 2012190。一種用所述的鞘酯菌DC-2生產的環境修復菌劑，是通過以下方法生產而成I)將保藏編號為CCTCC NO M 2012190的鞘酯菌DC-2試管種接種于發酵培養基中，振蕩培養至對數期；2)將上述培養好的菌種按1%的接種量接種入種子罐,培養至對數生長期；3)將種子液按10%的接種量接入生產罐培養；
4)在種子罐和生產罐的培養過程中無菌空氣的通氣量為1:0. 6-1. 2，攪拌速度為180-240轉/分，培養溫度為30°C，全流程培養時間為48-60小時，發酵結束后菌體數量達到10億個/ml以上，發酵完成后培養液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑；其中，所述的發酵培養基、種子罐所用的培養基、生產罐所用的培養基相同，配方均為:葡萄糖 0. lwt%, NaCl I. 0wt%，蛋白胨 0. 5wt%，酵母膏 0. 25wt%, pH7. 2-7. 5。所述的保藏編號為CCTCC NO M 2012190的鞘酯菌DC-2在降解氯代乙酰胺類除草劑中的應用。優選所述的鞘酯菌DC-2在降解土壤或水體環境中氯代乙酰胺類除草劑中的應用。所述的氯代乙酰胺類除草劑優選甲草胺，乙草胺和丁草胺中的一種或多種。所述的由保藏編號為CCTCC NO M 2012190的鞘酯菌DC-2環境修復菌劑在降解氯代乙酰胺類除草劑中的應用。優選所述的環境修復菌劑在降解土壤或水體環境中氯代乙酰胺類除草劑中的應用。所述的氯代乙酰胺類除草劑優選甲草胺，乙草胺和丁草胺中的一種或多種。有益效果本發明篩選獲得一株鞘酯菌(Sphingobiumquisqui liarum) DC-2 (CCTCC NO:M2012190)，該菌株制備的菌劑能同時降解甲草胺，乙草胺和丁草胺等多種氯代乙酰胺類除草劑，使用本菌劑可在短時間內使土壤和水體環境中甲草胺，乙草胺和丁草胺的殘留量降低95%以上，消除農產品中甲草胺，乙草胺和丁草胺殘留，解決甲草胺，乙草胺和丁草胺對土壤水體環境、農作物和人體健康的危害問題。本發明描述的環境修復菌劑可以用發酵工業通用發酵設備進行生產，具有生產成本低，使用方便，去除效果好的優點，適合治理土壤和水體環境中甲草胺，乙草胺和丁草胺造成的污染。本發明對于保護生態環境，降低除草劑對農作物藥害，保護人民的身體健康，提聞農廣品的附加值具有重要的意義。
圖I菌株DC-2菌落照片和電鏡照片A圖為菌株DC-2菌落照片，B圖為菌株DC-2電鏡照片。生物材料保藏信息
氯代乙酰胺類除草劑降解菌DC-2 (Sphingobium quisqui liarum DC-2),保存在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，地址為中國武漢，武漢大學，保藏編號為CCTCC NO M2012190，保藏日期為2012年5月30日。
具體實施例方式實施例I菌株的分離和鑒定用來富集氯代乙酰胺類除草劑降解菌株的富集基質取自江蘇昆山市綠利來農藥廠農藥廢水生化處理池的活性污泥 ，取活性污泥5. Og加入IOOml基礎鹽培養基中，加入50mg L—1的丁草胺，30°C，180r mirT1培養7d天，以5%的接種量轉接到相同的培養基中，連續轉接3次，梯度稀釋富集液，取10_4 10_7稀釋度的富集液各0. ImL涂布于加有IOOmg L-1 丁草胺的固體培養基平板上，30°C培養4d后，挑取長出的單菌落接種于分別含IOOmg L-1各種氯代乙酰胺類除草劑(丁草胺、乙草胺、甲草胺和異丙甲草胺)的培養基中，30°C, 180r mirT1搖床培養5d,驗證其降解效果。基礎鹽培養基配方為5. Og葡萄糖，I. OgNH4NO3, I. Og NaCl, I. 5g K2HPO4, 0. 5g KH2PO4, 0. 2g MgSO4 7H20.加水至 1L, pH 7. 0.固體培養基加15. Og瓊脂。降解效果的驗證方法在培養液中加入等體積的二氯甲烷進行全量提取，劇烈振蕩后靜置分層，然后取Iml下層二氯甲烷揮發完全后，加入ImL甲醇溶解(色譜純)，用濾膜(孔徑0.22pm)過濾。采用紫外和高效液相色譜測定提取液中丁氯代乙酰胺類除草劑的含量，液相色譜條件流動相為甲醇水(80 20, V/V)，Zorbax C218 ODSSpherex反相柱(5iim,4. 6mmX250mm, Agilent, USA),柱溫為室溫，紫外檢測器，測定波長230nm,進樣量20 ii L,流速為0. 8mL mirT1。外標法按峰面積定量。另外還可采用氣相色譜檢測提取液中氯代乙酰胺類除草劑的含量，檢測方法柱型BD-5MS石英毛細管柱(15mX0. 25mmX0. 25 u m);樣品進樣量2yL ;分流比30 ;載氣氦氣；載氣流速Iml/min ;進樣口溫度為230°C，柱溫為200°C。一級質譜條件離子檢測方式為多反應離子檢測；離子極性為負離子；離子化方式為電噴霧離子化；毛細管電壓為4000伏；干燥氣溫度3300C ;干燥氣流速10. OL/min，霧化氣壓力35psi，碰撞電壓135伏；質量掃描范圍(m/z) :300-500。二級子離子質譜條件碰撞電壓90伏；質量掃描范圍(m/z) 30-4000從富集液中，分離到I株氯代乙酰胺類除草劑降解菌，命名為DC-2。菌株DC-2降解丁草胺、乙草胺和甲草胺前后的有機相提取液紫外掃描和液相色譜檢測結果表明菌株DC-2能降解丁草胺、乙草胺和甲草胺。菌株DC-2在固體培養基上生長3d后，菌落表面光滑，有光澤，邊緣整齊，隆起，呈淡黃色，經過負染，在透射電子顯微鏡下該菌呈桿狀，無鞭毛，無莢膜，不形成芽孢(圖I)。G_，菌體為短桿狀，大小為0.5-1. OX I. 0-1.5 iim。好氧生長，具有過氧化氫酶和氧化酶活性，V.P.反應為陽性，甲基紅反應為陰性，產黃色色素，菌體周圍產莢膜，能利用葡萄糖、半乳糖和木糖糖氧化產酸。菌株DC-2的形態和生理生化特征和 Bergey' s manual of systematic bacteriology 上對鞘酯菌屬的描述是一致的。以菌株DC-2的基因組DNA為模板，用細菌16S rRNA基因序列通用引物進行PCR擴增，得到長度約為1400bp的16S rRNA基因序列(Genbank登錄號為EU781657. I)。在RDP數據庫(https://rdp.cme.msu.edu/)中進行Blast,結果表明菌株DC-2與鞘脂菌屬(Sphingobium)菌株的同源性最近，與模式菌株Sphingobium quisqui liarum P25的同源性為100%。結合生理生化特征將該菌鑒定為鞘酯菌屬(Sphingobium quisqui I iarum),將該菌株送交位于中國武漢，武漢大學的中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC)保藏，保藏編號為CCTCC NO M 2012190，保藏日期為2012年5月30日。實施例2修復菌劑的發酵使用上述菌株DC-2生產修復菌劑的工藝為斜面種一搖瓶種子液一種子罐一產品(包裝劑型為液體菌劑)。I)將DC-2 (CCTCC NO M 2012190)試管種接種于發酵培養基中，振蕩培養至對數期；2)將上述培養好的菌種按10% (v/v,以培養基體積為基準)的接種量接種入裝液量為70% (v/v,以發酵罐體積為基準，下同)的500升種子罐，培養至對數生長期；3)將種子液按10% (v/v,以培養基體積為基準，下同)的接種量接入裝液量為70% 的生產罐培養；4)在種子罐和生產罐的培養過程中無菌空氣的通氣量為1:1.0，攪拌速度為220轉/分，培養溫度為30°C，全流程培養時間為50小時，發酵結束后菌體數量達到10億個/ml以上，發酵完成后培養液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑。以上所用的發酵培養基、種子罐培養基及生產罐培養基相同，配方為葡萄糖
0.lwt%，蛋白胨 0. 5wt%，酵母膏 0. 25wt%, pH7. 2-7. 5。實施例3培養基中DC-2對氯代乙酰胺類除草劑生物降解實驗在基礎鹽培養基(同實施例I)中加入終濃度為100mg/L的甲草胺，乙草胺和丁草胺，1%的接種量接入DC-2 (CCTCC NO M 2012190)菌液，設接種滅活的DC_2 (CCTCC NO M2012190)對照，30°C恒溫培養箱中培養。定時取樣檢測菌株對甲草胺，乙草胺和丁草胺的降解情況，結果見表I。菌株DC-2 (CCTCC NO M 2012190)在3天內對甲草胺，乙草胺和丁草胺的降解率分別達到93. 4%,96. 7%和90. 5%，5天內對甲草胺，乙草胺和丁草胺的降解率分別達到 98. 2%、99. 6%和 95. 7%。表I菌株DC-2在培養基中對甲草胺，乙草胺和丁草胺解效果
權利要求
1.鞘酯菌(Sphingobiumquisquiliarum) DC-2，2012年5月30日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC M2012190。
2.一種用權利要求I所述的鞘酯菌DC-2生產的環境修復菌劑，其特征在于是通過以下方法生產而成 1)將保藏編號為CCTCCM2012190的鞘酯菌DC-2試管種接種于發酵培養基中，振蕩培養至對數期； 2)將上述培養好的菌種按1%的接種量接種入種子罐,培養至對數生長期； 3)將種子液按10%的接種量接入生產罐培養； 4)在種子罐和生產罐的培養過程中無菌空氣的通氣量為1:0.6-1. 2，攪拌速度為180-240轉/分，培養溫度為30°C，全流程培養時間為48-60小時，發酵結束后菌體數量達到10億個/ml以上，發酵完成后培養液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑； 其中，所述的發酵培養基、種子罐所用的培養基、生產罐所用的培養基相同，配方均為葡萄糖 0. lwt%, NaCll. 0wt%，蛋白胨 0. 5wt%，酵母膏 0. 25wt%, pH7. 2-7. 5。
3.權利要求I所述的鞘酯菌DC-2在降解氯代乙酰胺類除草劑中的應用。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于所述的鞘酯菌DC-2在降解土壤或水體環境中氯代乙酰胺類除草劑中的應用。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于所述的氯代乙酰胺類除草劑選自甲草胺，乙草胺和丁草胺中的一種或多種。
6.權利要求2所述的環境修復菌劑在降解氯代乙酰胺類除草劑中的應用。
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于權利要求2所述的環境修復菌劑在降解土壤或水體環境中氯代乙酰胺類除草劑中的應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于所述的氯代乙酰胺類除草劑選自甲草胺，乙草胺和丁草胺中的一種或多種。
全文摘要
本發明屬于環境污染生物修復領域，公開了一種氯代乙酰胺類除草劑降解菌及其生產的菌劑和應用。鞘酯菌(Sphingobium quisquiliarum)DC-2，2012年5月30日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC M2012190。該菌株制備的菌劑能同時降解甲草胺，乙草胺和丁草胺等多種氯代乙酰胺類除草劑，使用本菌劑可在短時間內使土壤和水體環境中甲草胺，乙草胺和丁草胺的殘留量降低95％以上，消除農產品中甲草胺，乙草胺和丁草胺殘留，解決甲草胺，乙草胺和丁草胺對土壤水體環境、農作物和人體健康的危害問題。
文檔編號C02F3/34GK102757915SQ20121022877
公開日2012年10月31日 申請日期2012年7月2日 優先權日2012年7月2日
發明者何健, 李怡, 李順鵬, 陳青 申請人:南京農業大學