專利名稱：：一株降解除草劑阿特拉津的高效菌株及其作用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于化學農藥生物降解
技術領域：
，涉及一株土生細菌Shinellasp.HBZA0511菌株(粒申氏桿菌)，及其對農藥阿特拉津的降解作用，可用于土壤農藥污染的原位修復工程。
背景技術：
：阿特拉津(Atrazine，化學名稱2-氯-4-乙胺基-6-異丙胺基-l，3，5-三嗪，分子式(^14(^5)，又名莠去津，屬均三氮苯類除草劑，廣泛用于玉米地、高粱地、甘蔗田、果園、苗圃、林地防除一年生禾本科雜草，對多年生雜草也有一定的抑制作用。阿特拉津可在苗前或苗后使用，但其在土壤中的殘留期較長，并具有生物活性，容易對一些后茬敏感作物，如小麥、大豆、水稻等產生藥害；阿特拉津在土壤中水溶性好，易被雨水、灌溉水淋溶至深層土壤，或是隨地表水徑流進入到河流、湖泊，造成地下水和地表水資源的污染，對人類健康、野生動物以及自然環境構成威脅。阿特拉津還可通過揮發和浮塵進入大氣，并通過干沉降和濕沉降返回地面，對生態環境的影響具有全球性。阿特拉津在土壤中有較長的殘留期。研究報道，當土壤中可溶性阿特拉津的含量為30mg/L時，其在土壤中的半衰期為15100d。在阿特拉津污染的水田時發現，切斷污染源1年后在農田灌溉水中仍能檢測出阿特拉津的殘留，在作物生長期內也可以檢測出作物體內的阿特拉津殘留。河北宣化農藥廠排污口下游的官廳水庫及其下游永定河中均檢出阿特拉津及其代謝物DEA、DIA和HA。1992年張家口市洋河下游農灌區因宣化農藥廠排放的廢水中含有高濃度的阿特拉津和乙草胺，造成農作物大面積死亡，其中水稻占95%。1997年，因條子河上游吉林省四平市四平聯合化工廠生產阿特拉津排放的廢水，遼寧省鐵嶺市昌圖縣發生全國特大水田污染事故，受污染面積達O.28萬公頃。利用多介質環境模型對白洋淀地區的土壤、地下水和玉米中30年阿特拉津的含量進行了預測，結果表明，在阿特拉津開始施用IO年后，在地下水中的濃度將超過美國環保局規定的3ug/L飲用水標準；5年后在玉米籽粒中的含量將接近加拿大規定0.lmg/kg的最高允許濃度。阿特拉津對人和動物有直接的不良影響。阿特拉津可使人體內CYP19酶的活性升高，干擾人體內分泌平衡，阿特拉津可能對人體具有致癌性，長期接觸阿特拉津會導致乳腺癌和卵巢癌的發生。美國EPA把阿特拉津列為可能的致癌物，并規定飲用水中阿特拉津的濃度不超過3ug/L。阿特拉津對人體淋巴細胞具有弱毒性，但不會引起染色體畸變的反應，但在一些試驗中阿特拉津也呈現出一定的遺傳毒性，低劑量(yg/L-mg/L)的阿特拉津具有內分泌干擾作用，是近期的發現，最令人擔憂，已被列為環境荷爾蒙的可疑物質。在水蚤胚胎形成期，低濃度(0.5-10ug/L)阿特拉津的暴露可使它的雄性后代的出生率增加。低劑量阿特拉津的長期暴露對非洲爪蟾性別的發育產生干擾。阿特拉津能抑制彈琴蛙(Ranaadenopleura)蝌蚪紅細胞生成，造成細胞供氧不足，能量利用率降低，進一步抑制蝌蚪生長，延遲發育，而變態時個體的大小會影響成體的捕食能力，可能通過此種途徑引起此類種群的衰減。阿特拉津還能抑制小鼠和魚等水生動物紅細胞生成，降低血液的攜氧能力。阿特拉津在土壤和水體中阿特拉津的降解主要是由微生物來完成的。微生物可利用阿特拉津作為碳源、氮源，使阿特拉津發生脫烷基、脫N-烷基甚至三氮環開裂，釋放出C02而發生徹底礦化降解。生物降解(Biodegradation)技術報道始見于20世紀80年代。20世紀90年代歐洲發達國家開始將生物降解技術應用于一些實際的污染處理工程，并獲得了很大的成功。通過工程措施，為天然或人工接種的微生物提供生長與繁殖必要的條件，從而加速污染物的降解或去除，將環境中的有機污染物轉化為C02和H20等無毒無害或毒性較小的物質，即生物修復(Bioremediation)。生物降解與物理、化學方法相比，具有成本低、效率高、無二次污染、易操作等優點，因此生物降解技術被認為是有機污染物修復技術中最有效、最可行和最可靠的方法。目前生物降解技術已廣泛用于土壤、水體、海灘的污染治理。
發明內容本發明從土壤樣本中分離篩選得到一株對除草劑阿特拉津具有高效降解能力的細菌菌株；本發明提供該菌株的鑒定特征和16SrDNA序列、菌株的分離篩選、菌株的生理生化特征、菌株對阿特拉津的降解作用、菌株生長的基本特性；本發明在發現和確定該菌株對阿特拉津具有高效降解特性的基礎上，還提供了應用該菌株降解土壤中阿特拉津殘留的方法。本發明的技術方案概述如下本發明所提供的土生細菌菌株，其特征在于該菌株為Shinellasp.HBZA0511菌株(粒申氏桿菌)，2006年9月7日保存于"中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)"，其保藏號為CGMCCNo.1801。菌株分離與篩選該菌株Shinellasp.HBZA0511菌株從被農藥高度污染的農藥廠排污口土壤中分離得到，具體分離、篩選、馴化步驟為利用基礎無機鹽培養基馴化分離土樣中的阿特拉津降解菌株。取土樣5g，在無菌操作條件下，分別加入到含有100ml、200mg/L阿特拉津的培養液(100ml基礎無機鹽培養基+20mg阿特拉津，阿特拉津作為唯一氮源)的250ml三角瓶中，在3(TC恒溫搖床上180r/min馴化培養；每隔7取培養物接種到新鮮的培養基中，接種量為10%，同時培養基中阿特拉津的含量增加100mg/L。阿特拉津在水溶液中溶解度較小，25t:時為33mg/L，可邊培養邊通過觀察原藥粉末的消失與否來判斷其降解情況。連續馴化培養2個月，直至培養基中阿特拉津的終濃度達到1000mg/L，馴化培養結束；將阿特拉津馴化濃度為600mg/L、700mg/L、800mg/L、900mg/L、1000mg/L時的富集培養物分別稀釋10—\10—2、10—3、10—4、10—5、10—6、10—7、10一8倍，各取100iU分別涂布于添加相應阿特拉津濃度的無機鹽平板上，置于3(TC恒溫培養箱中培養；培養結束后，在無機鹽平板上挑取有透明降解圈的單菌落，降解圈可作為初步判定菌株對阿特拉津有降解能力的標志，連續劃線純化培養3次，得到純化菌株。菌株形態特征菌株HBZA0511為革蘭氏陰性菌，無芽孢，有運動性。掃描電鏡下(圖1.HBZA0511菌株掃描電鏡圖)可見菌株菌體為長桿狀。透射電鏡下(圖2.HBZA0511菌株透射電鏡圖)可見該菌體具有極生鞭毛。菌株在無機鹽固體平板培養基上，菌落白色，透明，圓形，邊緣整齊，菌落表面略突5起。在牛肉蛋白胨固體培養基上，菌落圓形，邊緣整齊，表面隆起，淺黃色，不透明。在以阿特拉津為唯一碳源的固體培養基上，菌落圓形，邊緣整齊，表面隆起，乳白色，不透明，15天菌落周圍形成明顯的降解圈。菌株生理生化特征碳源利用該菌株能利用葡萄糖和乙醇，不能利用甲醇和乳酸。氮源利用該菌株可以利用磷酸氫二胺和硝酸鉀，即可以利用氨態氮和硝態氮化合物。氧和二氧化碳的需要開管處理，培養基液面處先變混濁，顯紅色，然后從上至下逐漸顯紅色，變混濁，說明菌體先在液面生長，隨著氧氣逐漸向下滲透，菌體逐漸生長；閉管處理，與對照相比，培養基沒有顯色，菌體完全沒有生長；證明此菌株為好氧菌。耐鹽性最高耐受NaCl的濃度為2%生長溫度和耐熱性生長溫度耐受范圍為445°C接觸酶陽性氧化酶陽性葡萄糖氧化發酵開管處理培養基產酸變黃，閉管處理培養基沒有顏色變化，說明此菌株為氧化型。生化鑒定試劑管將過夜培養的HBZA0511菌株接種于生化鑒定試劑盒中各項檢測的相應試管中，檢測14項，其中有6項(尿酶、七葉靈(苷)水解酶、蔗糖水解酶、麥芽糖水解酶、木糖水解酶、葡萄糖水解酶)顯示陽性，8項(精氨酸脫羧酶、鳥氨算脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、枸櫞酸鹽、硝酸鹽還原、蛋白胨水(靛基質試驗)、0-硝基苯-13-D吡喃半乳糖苷酶(0NPG)、硫化氫)顯示陰性。菌株16SrDNA序列HBZA0511菌株的16SrDNA核苷酸序列測定及比對結果。重組質粒由上海生工生物工程技術服務有限公司測序，獲得序列后登陸www.ncbi.nlm.nlh.gov網站，對菌株16SrDNA基因核苷酸序列進行BLAST比對，比對結果(如下)顯示，本菌株的16SrDNA基因核苷酸序列與Shinillagra皿li的有99%的同源性，只有一個堿基不同(A-G)，位于第1265個堿基處。>gi|62546345|gb|AY995149.1IShinillagra皿li16SribosomalRNAgene，partialsequenceLength=1415;Score=2773bits(1399)，Expect=0.0;Identities=1402/1403(99%)，G即s=0/1403(0%);Strand=Plus/Plus。Query1TGG60Sbjct5TGG64Query61CTT120SbjctACTT124QueryGCGT180SbjctGCGT184QueryTGAG240SbjctTGAG244QueryAGTG300SbjctAGTG304QueryGGCC360SbjctGGCC364QueryCCCC420SbjctCCCC424QueryTTAC■Sbjct425TTAC484Query481AACT540Sbjct485AACT544Query541GAGT600Sbjct545GAGT604Query601GGTC660Sbjct605GGTC664Query661TAGT720Sbjct665TAGT724Query721AGCTAA780Sbjct725AGCTAA784Query781TTGACG840Sbjct785TTGACG844Query841CTTACC900CTTACCGACCGASbjet904Query960845901GACCGACCCGCASbjet964Query1020905961CCCGCAACTGCCSbjet1024Query10809651021ACTGCCGGCTGGSbjet1084Query114010251081GGCTGGGCTAATSbjet1144Query120010851141GCTAATGGAATCSbjet1204Query1260114512019GGAATCCACCGCSbjet1264Query132012051261CACCGCGGCAGTSbjet1324Query138012651321GGCAGTSbjet1384Query13251381CGACCACGGTAGGGTCAGCGACT14031407Sbjct1385CGACCACGGTAGGGTCAGCGACT菌株生長的基本特性菌株的生長曲線在牛肉膏蛋白胨液體培養基中，該菌在0-6h時處于延遲期，從6h開始進入對數生長期，在20h時對數生長期結束，進入穩定期。菌株最適生長溫度在牛肉膏蛋白胨液體培養基中，接菌量為5.45X107cfu/ml時，供試菌株在445°C的條件下均能夠生長，在溫度為4°C、10°C、35°C、40°C、45°C時菌體生長比較緩慢，而在15t:、2(TC、25t:時菌體生長速度明顯加快，在3(TC時菌株生長速度達到峰值。菌株最適生長的pH值菌株在牛肉膏蛋白胨液體培養基中生長時，當接入菌體濃度為1.02X106cfu/ml時，在pH為7、8的條件下，菌株生長速度較快，且pH為7時達到峰值；在pH為6、9的條件下，菌株生長緩慢；在pH為5、10的條件下，菌株幾乎不能生長。菌株最適生長通氧量在牛肉膏蛋白胨液體培養基中，當接種的菌體濃度為1.02X106cfu/ml時，隨著三角瓶中裝液量的增加，菌株的生長速度呈現先上升后下降的趨勢。在裝液量為50ml的條件下，菌株生長量最小；隨著裝液量的增加和氧氣的減少，菌株生長速度加快，裝液量為170ml時，菌體的生長量達到峰值；其后，隨著通氧量的繼續減少，菌株生長速度受到抑制開始下降。菌株的降解作用應用氣相色譜檢測阿特拉津的降解效果，在50ml無機鹽液體培養基反應體系菌體濃度為8.9X107cfu/ml的條件下，30。C恒溫搖床120r/min培養7天后，菌株HBZA0511對阿特拉津的降解效率最高，達到96.9%，空白對照的降解率為29.6%。該菌株為高效降解菌株。菌株對阿特拉津的降解能力<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>本發明的有益效果本發明的菌株，可將除草劑阿特拉津快速的降解，適用于土壤有機磷農藥污染的原位修復。圖1.為Shinellasp.HBZA0511菌株菌體的掃描電鏡形態圖圖2.為Shinellasp.HBZA0511菌株菌體的透射電鏡形態圖□體系接種終濃度菌株編號(cfu/ml)HBZA05118.9X10具體實施例方式實施例1:環境因子對菌株降解效率的影響。當阿特拉津濃度較低時(200mg/L)，菌株在3天內即可將其完全降解(100%)，隨阿特拉津濃度升高，其完全降解的時間也相應明顯延長。隨著培養基中接種的菌體濃度的提高，阿特拉津的降解率也逐漸增加，在無機鹽液體培養基中，當接菌濃度從2.56X106cfu/ml增加到3.28X108cfu/ml時，其相應的降解率從54.0%提高到99.7%。在無機鹽液體培養基中，弱酸性及中性環境(pH為5、6、7)較弱堿性(pH為8、9、10)環境中降解率高，降解最適pH為7。溫度154(TC范圍內，降解率變幅為88%99%。實施例2:菌株生長的基本條件。菌株在牛肉膏蛋白胨培養基上生長時，06h處于延遲生長期，6-20h時處于對數生長期，20h以后進入穩定及衰亡期；菌株HBZA0511對溫度的適應范圍較廣，在445t:的條件下均能生長，最適生長溫度為30°C;菌株適宜的pH為69之間，最適pH為7;菌株生長對氧的需求量不高。實施例3:菌株對阿特拉津的降解動態。菌株接種于以阿特拉津為唯一氮源的無機鹽液體培養基的條件下，當菌體濃度為6.59X108cfu/ml時，菌株對阿特拉津前3天的降解速度，可達到了89.5%，第7天降解率可達100%(培養基中阿特拉津未檢出，檢測限為0.01ng/iU)。降解率％=(培養后體系中殘留的農藥量/農藥起始加入量)X100X實施例4:菌株降解酶粗酶液的基本特性。該菌株的阿特拉津降解酶位于細胞內，粗酶液與阿特拉津(底物濃度50mg/L，pH7.O，磷酸緩沖液體系3ml，溫度30°C)作用2h，其對底物的去除率可達到99.0%;實驗結果表明，菌株分泌的降解酶為組成型酶，在無底物誘導的牛肉膏蛋白胨培養基上連續轉接培養8代后，該菌對阿特拉津的降解能力仍保持在較高水平，底物誘導前后該菌對阿特拉津的降解能力無顯著變化。降解酶適宜的溫度為2535t:，35t:時粗酶液對阿特拉津的降解率為73.5%(酶與底物作用0.5h)，高溫會使酶的降解活性驟然下降(4(TC對底物的降解率為34.5%)。當pH值為59.2，酶的活性隨pH值的升高而上升，pH值為9.2時酶的活性最高(69.6%，酶與底物作用時間0.5h)。實例5:本發明菌株的應用方法。用一般細菌培養基(如，牛肉膏蛋白胨培養基)3(TC有氧發酵培養25-30小時(0D6。。=0.450.48)，其發酵液可用作田間降解制劑，稀釋300倍直接噴施或澆灌于有污染的土壤表面，施后略作翻耕(10-15厘米)，7天的降解效果可達到90%。附圖圖1.圖2.權利要求一株降解除草劑阿特拉津的高效菌株及其作用，其特征為該菌株是Shinellasp.HBZA0511菌株(粒申氏桿菌)，2006年9月7日保存于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)”，其保藏號為CGMCCNo.1801。2.根據權利要求1所述的Shinellasp.HBZA0511菌株，其特征在于，該菌株為革蘭氏陰性菌，無芽孢，有運動性；掃描電鏡下可見菌株菌體為長桿狀；透射電鏡下可見該菌體具有極生鞭毛；菌株在無機鹽固體平板培養基上，菌落白色，透明，圓形，邊緣整齊，菌落表面略突起；在牛肉蛋白胨固體培養基上，菌落圓形，邊緣整齊，表面隆起，淺黃色，不透明；在以阿特拉津為唯一碳源的固體培養基上，菌落圓形，邊緣整齊，表面隆起，乳白色，不透明，15天菌落周圍有明顯的降解圈。3.根據權利要求1所述的Shinellasp.HBZA0511菌株，其特征在于，該菌株是從被除草劑阿特拉津高度污染的農藥廠排污口土壤中分離得到的；該菌株能利用葡萄糖和乙醇，不能利用甲醇和乳酸；該菌株可以利用磷酸氫二胺和硝酸鉀；氧和二氧化碳的需要，開管處理，培養基液面處先變混濁，顯紅色，然后從上至下逐漸顯紅色，變混濁；閉管處理，與對照相比，培養基沒有顯色，菌體完全沒有生長；最高耐受NaCl的濃度為2%;生長溫度耐受范圍為4-45°C;接觸酶陽性；氧化酶陽性；葡萄糖氧化發酵，開管處理培養基產酸變黃，閉管處理培養基沒有顏色變化，菌株為氧化型；生化鑒定試劑管，其中6項(尿酶、七葉靈苷水解酶、蔗糖水解酶、麥芽糖水解酶、木糖水解酶、葡萄糖水解酶)顯示陽性，8項(精氨酸脫羧酶、鳥氨算脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、枸櫞酸鹽、硝酸鹽還原、蛋白胨水、0-硝基苯-|3-D吡喃半乳糖苷酶、硫化氫)顯示陰性。4.根據權利l所述的Shinellasp.HBZA0511菌株，其特征在于，該菌株的16SrDNA序列如下，1381CGACCACGGTAGGGTCAGCGACT14035.根據權利1所述的Shinellasp.HBZA0511菌株對阿特拉津的降解作用，其特征是，HBZA0511菌株能將阿特拉津降解，在50ml無機鹽液體培養基反應體系中，菌體濃度為8.9X107cfu/ml的條件下，3(TC恒溫搖床120r/min培養7天后，菌株對阿特拉津的降解效率可達到96.9%，空白對照的降解率為29.6%，菌株表現為高效降解。全文摘要一株降解除草劑阿特拉津的高效菌株及其作用本發明屬于化學農藥生物降解
技術領域：
，涉及一株土生細菌及其對農藥阿特拉津的降解作用，該菌株為Shinellasp.HBZA0511菌株(粒申氏桿菌)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCCNo.1801，可用于土壤農藥污染的原位快速修復工程。文檔編號C12N1/20GK101735960SQ20081018061公開日2010年6月16日申請日期2008年11月18日優先權日2008年11月18日發明者萬方浩,應飛,謝明,邱衛亮申請人:謝明