專利名稱：一種產acc脫氨酶的根癌農桿菌ljl-6及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物促生菌技術領域，涉及一種產ACC脫氨酶的根癌農桿菌LJL-6及
其應用。
背景技術：
土壤鹽堿化、重金屬污染、干旱以及有機物污染越來越嚴重，這些逆境條件造成了農作物的減產。如何有效提高植物的抗逆能力和增加農作物的產量已經成為了廣泛關注的問題。環境脅迫可以導致植物體內脅迫乙烯的大量積累，而過量的乙烯會導致植物生長受阻甚至死亡。I-氨基環丙燒-I-羧酸(l-aminocyclopropane-l-carbo xylate,ACC)是物體內乙烯的合成前體。很多研究發現，多種植物根際促生細菌(plant growth-promotingrhizobacteria,PGPR)能分泌一種能抑制植物體內乙烯合成的胞內聚合酶,ACC脫氨酶(ACCdeaminase)，可將ACC分解為α - 丁酮酸和氨，可減少脅迫乙烯的產生，從而提高植物在逆境脅迫下的適應能力。因此，亟待開發一種能夠有效緩解逆境脅迫的危害且能夠促進植物生長的植物根際促生細菌。
發明內容
本發明解決的問題在于提供一種產ACC脫氨酶的根癌農桿菌LJL-6及其應用，該根癌農桿菌是一種新的植物促生菌，有望在石油污染的鹽堿土壤的植物修復中發揮重要作用。本發明是通過以下技術方案來實現—種產ACC脫氨酶的根癌農桿菌LJL-6,其分類命名為根癌農桿菌LJL-6(Agrobacterium tumefaciens),保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為 CGMCC NO. 6289。該菌能夠在好氧條件下將ACC作為唯一氮源進行生長，同時將其分解。該菌能夠在胞內合成ACC脫氨酶，在好氧條件下將ACC作為唯一氮源進行生長，同時將其分解。進一步的，該菌能夠合成吲哚乙酸。而且，該菌能夠合成嗜鐵素。該菌的應用包括所述的產ACC脫氨酶的根癌農桿菌LJL-6在促植物生長的應用。所述在制備促植物生長的制劑或提高植物抗逆性的應用。所述的制劑為抑制ACC生成的制劑、促吲哚乙酸合成的制劑、促嗜鐵素合成的制劑中的一種或幾種。所述的產ACC脫氨酶的根癌農桿菌LJL-6在石油污染的土壤的植物修復中的應用。
所述在制備提高植物在石油污染的鹽堿土壤中的抗逆性的制劑的應用。所述的在植物在脅迫環境下通過抑制體內乙烯合成以提高抗逆能力中的應用，所述的脅迫環境包括鹽堿、干旱、金屬、有機物污染等脅迫環境。與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果本發明提供的產ACC脫氨酶的根癌農桿菌LJL-6，是以ACC作為唯一 N源的培養基對從石油污染的鹽堿土中生長的植物的根際土中的微生物進行篩選分離，得到的能夠以ACC作為唯一 N源生長的微生物，檢測結果表明該菌是一種能夠合成ACC脫氨酶的新的根癌農桿菌，分類命名為 Agrobacterium tume faciens。本發明提供的產ACC脫氨酶的根癌農桿菌UL-6，由于其合成ACC脫氨酶，所以能夠抑制植物體內ACC的合成，進而降低由于環境脅迫所導致植物體內乙烯的大量積累，從而提聞其抗逆性。本發明提供的產ACC脫氨酶的根癌農桿菌LJL-6，還能夠合成吲哚乙酸和嗜鐵素，從而能夠幫助植物提供吲哚乙酸及促進鐵元素的吸收，起到促植物生長的作用。本發明提供的產ACC脫氨酶的根癌農桿菌LJL-6，在石油污染的鹽堿土中對燕麥的生長有促進作用，包括株高、株鮮重、根長及根鮮重的促生長作用與對照相比，株高增加55. 81%，植株鮮重/5株增加16. 39%，根長增加25. 38%，根鮮重/5株增加6. 89%。該菌株可在鹽堿、干旱、金屬、有機物污染等脅迫環境下提高植物的抗逆能力，促進植物生長。保藏說明本發明所述的根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens) LJL-6進行了下述保藏保藏時間2012年6月26日，保藏地點北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所；保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，CGMCC ;保藏號為 CGMCC NO. 6289。
圖I為根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens) LJL-6在ADF培養基上的生長狀況。圖2 為根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)LJL_6 在不同濃度 L-Trp 中 IAA合成量的變化。圖3為根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens) LJL-6在絡奧醇CAS固體培養基上形成橘黃色暈圈。圖4為根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens) LJL-6對燕麥促生3周時盆栽效果。
具體實施例方式下面結合具體的實施例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
實施例I、根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens) LJL-6的分離和鑒定I、根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens) LJL-6 的分離根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)LJL_6的分離包括取樣,篩選和純化兩個步驟，具體方法如下I. I、取樣篩選植物根際促生菌的土壤取自黑龍江省大慶市采油廠附近鹽堿土中生長的燕麥的根際土，將根際土裝入滅過菌的采集瓶中帶回實驗室，放入4°C冰箱保存備用。I. 2、篩選和純化(I)取Ig根際土樣于50mL PAF培養基中，28°C振蕩培養24h。該PAF培養基中含有蛋白胨，酪蛋白水解物，MgSO4,K2HPO4,甘油，具體參照Penrose D M, Glick B R. Methods forisolating and characterizing ACC deaminase-containing plant growth-promotingrhizobacteria[J]. Physiologia PI ant arum, 2003, 118 (I) : 10-15 來配制。(2)取ImL上述(I)震蕩后的PAF培養液(混懸液)，于50mL PAF培養基中，28°C振蕩培養24h。(3)取ImL上述(2)得到的PAF培養液，于50mL DF鹽培養液中，28°C振蕩培養24h。該DF鹽培養液含有KH2PO4, Na2HPO4,MgSO4, FeSO4,葡萄糖，葡萄糖酸，檸檬酸，(NH4) 2S04，H3BO3, MnSO4, ZnSO4, CuSO4, MoO3。(4)取ImL上述(3)得到的DF鹽培養液，于50mL不含(NH4)2S04，但含有3mM I-氨基環丙烷-I-羧酸(ACC)的DF鹽培養液中(即以ACC作為唯一 N源)，28°C振蕩培養48h。(5)取ImL上述(4)得到的培養液，涂布于含3mM ACC的DF鹽瓊脂培養基上，28°C培養。(6)取上述(5)培養基上生長的菌落，在ADF培養基上劃線純化，得到單一菌落。這樣經過以ACC作為唯一 N源的培養基對根際土中能夠利用其作為N源生長的細菌進行篩選，從而得到了單一菌落。2、根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens) LJL-6 的鑒定對上述分離純化得到的純培養菌株進行一系列生理生化鑒定，并進行DNA提取，16S rDNA的擴增和測序。2. I該菌株在ADF培養基上形成圓形、不透明、淡黃色、突起光滑、邊緣整齊、有粘性的菌落，如圖I所示。2. 2利用引物F8和R1541進行擴增16S rDNA，引物序列如下F8 :5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3'，F 1541 :5’AAGGAGGTGATCCAGCCGCA3'。PCR 擴增條件為94°C 3min ；94°C 30s，55°C 30s, 72 °C 90s，30 個循環；72 °CIOmin0對PCR擴增產物進行測序，測序結果如SEQ. ID. NO. I所示。將上述獲得的純培養菌株中的一株命名為根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens) LJL-6,并將其保藏,保藏號為 CGMCC NO. 6289。實施例2、CGMCC NO. 6289的ACC脫氨酶活性測定供試菌株CGMCC NO. 6289在TSB培養液(胰蛋白胨17. 0g，大豆胨3. 0g，NaCl 5. Og,葡萄糖2. 5g，K2HP04 2. 5g，蒸餾水1000mL，pH 7. 5)中過夜培養，4°C離心收集菌體。菌體細胞用DF培養液洗滌三次，重新懸浮于ADF培養液，室溫28°C振蕩培養2天后，4°C離心收集菌體，用O. Imol .L-1Tris-HCl緩沖液(pH=7. 6)洗滌離心三次，重懸浮于600 μ L O. Imol Γ1Tris-HCl緩沖液(ρΗ=8. O)中，加入30 μ L甲苯并迅速振蕩30s以破碎細胞，轉移200 μ L含甲苯的細胞提取物至I. 5mL離心管中，加入20 μ L O. 5mol · T1ACC混勻，同時做不添加ACC的空白試驗，30°C培養15min。添加ImL O. 56mol *L 1HCl, 16000g離心5min,取ImL懸浮液至試管中，加入800 μ L O. 56mol .L-1HCl和300 μ L 2,4- 二硝基苯肼，30。。孵育30min,加入2mL 2mol · !/1NaOH, 540nm 波長測吸光度。以 ImL 濃度為 0,0. 1,0. 3,0. 7、I 和 2μπιο1 · Γ1的α-丁酮酸為標準液，測540nm波長下吸光值。蛋白質測定采用考馬斯亮藍法測定。以ImL濃度為0、20、40、60、80和lOOyg.L—1的牛血清白蛋白溶液為標準溶液，加5mL考馬斯亮藍G250染色液，反應5min后測定595nm下吸光值。ACC脫氨酶的活性以在測酶體系中每毫克蛋白每小時形成α-丁酮酸的量表示，單位為ymola-KA· (mgPr · h)'酶活性測定均扣除樣品對照空白后計算，重復3次。 采用α-丙酮酸標準品為標準樣制作標準曲線，標準曲線方程(方程甲)如下y=3. 6928x-0. 035 (R2=O. 9879)，其中 x 代表 OD54tol 數值，y 代表 α - 丁酮酸含量(μ mol)。采用考馬斯亮藍法檢測細胞提取物的總蛋白含量。以采用牛血清白蛋白為標準品，制作標準曲線，標準曲線方程(方程乙)如下y=205. 73x-l. 3251 (R2=O. 9846)，其中x代表OD595nm數值，y代表蛋白含量(mg)。根據制作標準曲線和檢測結果，即可獲得ACC脫氨酶活性的活性。檢測結果表明CGMCC NO. 6289的細胞破碎物中具有ACC脫氨酶活性，酶活性最高可達4. 86 μ mola -KA · (mg Pr · h)—1，這表明CGMCC NO. 6289能夠胞內合成ACC脫氨酶。實施例3、CGMCC NO. 6289的IAA合成量測定將CGMCC NO. 6289先在DF培養液中培養2天，再微量轉入添加不同濃度色氨酸(L-Trp)的DF培養液(含0、50、100、200和500 μ g L-Trp · ml/1)中繼續培養2天，取樣測菌液0D600，其余培養液室溫下800(^離心，取50(^1^上清液，添加21^ Salkowski試劑(含150mL H2SO4,250mL ddH20 和 7. 5mL O. 5mol .L-1FeCl3),黑暗下室溫培養 20min 后，在 535nm處測吸光值(OD535 ),無菌培養基同上做相同的處理作為對照調零。以濃度為0、0. 01,0. 05、O. 25,0. 5mg ι Γ1的IAA標準液同方法做標準曲線，標準曲線方程如下y=0. 1701χ-0. 0237(R2=O. 9855)，其中 X 代表 OD535nm 數值，y 代表 IAA 濃度(μ g · mL-1)。根據制作標準曲線和檢測結果，即可獲得CGMCC NO. 6289的IAA合成量；而且檢測結果還表明，根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens) LJL-6不僅能夠利用色氨酸產生吲哚乙酸，而且隨著L-Trp濃度的不同，其IAA的合成量不同。如圖2所示，根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens) LJL-6 的 IAA 合成量在 L-Trp 濃度為 500 μ g · πιΤΓ1 范圍內與L-Trp的增加成正比。CGMCC NO. 6289以色氨酸(L-Trp)為前體合成植物生長激素吲哚乙酸(ΙΑΑ)，由于其吸附在種子和根的表面，從而被植物所利用，同時也可以和植物內生的IAA共同作用刺激植物細胞生長和增殖，可促進植物根系的生長發育及有效吸收土壤中的水分和養分，同時對植物的其他生命活動進行調節。
實施例4、CGMCC NO. 6289的嗜鐵素合成量測定參照Schwyn 和 Neilands 的方法(Schwyn B, Neilands J B. Universal chemicalassay for the detection and determination of siderophores[J]. AnalyticalBiochemistry, 1987，160:47-56.),對根癌農桿菌LJL-6進行嗜鐵素合成定性實驗。將根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens) LJL-6 接于絡奧醇 CAS (chrome azurol S)固體培養基上，28°C培養48h，觀察菌落周圍的顏色變化，有橘黃色圈產生即可產生嗜鐵素。檢測結果如圖3所示,根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)LJL_6在CAS瓊脂平板上菌落周圍有橘黃色暈圈形成，即產生了嗜鐵素。參照趙翔等的方法測定嗜鐵素。將根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)LJL-6接種于MKB培養基中，28°C 180r ^mirT1搖床培養48h ;菌液離心，取上清液，以1:1的體積比加入CAS檢測液，充分混勻。靜止Ih后，630nm處測吸光值(A)，去離子水與CAS檢測液等體積混合測得的Ar為對照，A/Ar代表樣品中嗜鐵素的相對含量，該值越低，表明嗜鐵素含量越高。A/AK0.5，可認為產嗜鐵素能力較高。·檢測結果表明，CGMCC NO. 6289的A/Ar值為2. 07，說明其能夠合成嗜鐵素。這樣CGMCC NO. 6289能通過產生和分泌對鐵具有高親和力的嗜鐵素，溶解并結合土壤中的鐵元素供植物細胞利用，增加鐵營養，促進植物生長。實施例5、CGMCC NO. 6289在石油污染鹽堿土壤環境下對燕麥的促生效應用于CGMCC NO. 6289對燕麥促生實驗的鹽堿土壤取于黑龍江省大慶市，采集樣品時在每個區域內設置5個樣方，樣方面積為IX Im2,收集表層土壤((T20cm), 土壤混合后，裝入事先準備好的干凈保鮮袋中，迅速將土樣帶回實驗室，土壤經碾碎，混勻，風干后過篩保存。供試土壤的理化性質見表I。表I供試土壤理化性質
權利要求
1.一種產ACC脫氨酶的根癌農桿菌LJL-6，其特征在于，其分類命名為根癌農桿菌LJL-6 (Agrobacterium tumefaciens),保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為 CGMCC NO. 6289。
2.如權利要求I所述的產ACC脫氨酶的根癌農桿菌LJL-6，其特征在于，該菌能夠在胞內合成ACC脫氨酶，在好氧條件下將ACC作為唯一氮源進行生長，同時將其分解。
3.如權利要求I所述的產ACC脫氨酶的根癌農桿菌LJL-6，其特征在于，該菌能夠合成吲哚乙酸。
4.如權利要求I所述的產ACC脫氨酶的根癌農桿菌LJL-6，其特征在于，該菌能夠合成嗜鐵素。
5.權利要求I所述的產ACC脫氨酶的根癌農桿菌LJL-6在促植物生長的應用。
6.如權利要求5所述的應用，其特征在于，在制備促植物生長的制劑或提高植物抗逆性的應用。
7.如權利要求6所述的應用，其特征在于，所述的制劑為抑制ACC生成的制劑、促吲哚乙酸合成的制劑、促嗜鐵素合成的制劑中的一種或幾種。
8.權利要求I所述的產ACC脫氨酶的根癌農桿菌LJL-6在石油污染的土壤的植物修復中的應用。
9.如權利要求8所述的應用，其特征在于，在制備提高植物在石油污染的鹽堿土壤中的抗逆性的制劑的應用。
10.權利要求I所述的產ACC脫氨酶的根癌農桿菌LJL-6在植物在脅迫環境下通過抑制體內乙烯合成以提高抗逆能力中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種產ACC脫氨酶的根癌農桿菌LJL-6及其應用，其分類命名為根癌農桿菌LJL-6(Agrobacterium tumefaciens)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC NO.6289。該菌可以1-氨基環丙烷-1-羧酸(ACC)為唯一氮源生長，同時將其分解。該細菌的ACC脫氨酶活性最高可達4.86μmol α-KA·(mg Pr·h)-1；隨著L-Trp的濃度增加其合成IAA的量增加；且可以合成嗜鐵素。該菌株可在鹽堿、干旱、金屬、有機物污染等脅迫環境下提高植物的抗逆能力，促進植物生長；對石油污染的鹽堿土中對燕麥的生長有促進作用。
文檔編號B09C1/10GK102816721SQ201210284869
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月10日 優先權日2012年8月10日
發明者郭長虹, 劉佳莉, 馬軍, 束永俊, 杜瀅鑫 申請人:哈爾濱師范大學