專利名稱：產酸克雷伯氏菌mow-02-05及其篩選方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于染料廢水凈化處理技術領域，具體涉及一種產酸克雷伯氏菌M0W-02-05及其篩選方法和應用。
背景技術：
偶氮染料是合成染料的最主要的品種，廣泛應用在印染、紡織和造紙等行業。偶氮染料具有-N=N-發色基團，需要得到電子才能將偶氮鍵脫色還原，但是由于空氣中氧氣的存在，它們穩定的存在自然環境中很難被微生物降解。偶氮染料的排放一方面會引起水體色度的增加，抑制水體中光合作用的過程，進而影響到生物鏈各級生物的生長，破壞區域的水體生態系統；另一方面染料降解的中間產物(多為芳香胺類化合物)對動植物、人類和生態環境具有嚴重的危害。目前能夠有效處理染料廢水，且經濟、環保、可持續的方法是微生物處理法。在微生物法處理染料廢水工藝中，染料的降解效率是衡量反應器處理能力的一個重要指標，如何有效的將復雜有機碳源的化學能轉化為生物能(產氫、產乙醇、產甲烷等)則是微生物處理廢水和可再生能源技術的另一個重要指標。因此，篩選能同時高效降解染料和產能的細菌具有重要的現實意義。實驗室規模的間歇式厭氧污泥反應器中微生物對染料的降解專一性強，馴化程度高，有利于篩選出高效降解染料與產氫的細菌。目前報道的很多細菌都具有染料降解或發酵產氫能力，但同時具有上述作用的細菌還未見報道。本發明因此而來。
發明內容
本發明目的在于提供一種產酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)M0W-02-05，解決了現有技術中染料廢水難以進行生物降解、難以進行凈化處理等問題。為了解決現有技術中的這些問題，本發明提供的技術方案是一種產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)M0W-02_05,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為CGMCC No. 5237。優選的,所述細菌菌落圓點狀,淡黃色,表面光滑。優選的，所述細菌的16S rRNA序列為SEQ No.1。本發明的另一目的在于提供一種所述的產酸克雷伯氏菌M0W-02-05的培養篩選方法，其特征在于所述方法包括將間歇式厭氧污泥反應器中污泥樣品進行稀釋后按照常規培養形成菌落，然后挑單菌落分離純化得到純化的產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)M0W-02-05 的步驟。優選的,所述方法中還包括將所述純化的產酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)M0W-02-05菌株按照3 5%的接種量接入液體培養基，液體培養基的pH值控制在6. 8 7. 2范圍內，培養溫度為33 38°C，培養時間為24h 48h，得到擴大培養的產酸克雷伯氏菌 M0W-02-05 菌株。
優選的，所述方法中所述的液體培養基以其組分的配比計包括蛋白胨10重量份數，酵母膏5重量份數，氯化鈉10重量份數，水1000重量份數，且液體培養基的pH值控制在 6. 8 7. 2。本發明的又一目的在于提供一種所述的產酸克雷伯氏菌M0W-02-05在染料廢水凈化處理以及生物產氫中的應用。優選的，所述應用中以所述的產酸克雷伯氏菌M0W-02-05菌株為菌種，碳源為電子供體，偶氮染料為電子受體，同時進行脫色和產氫作用。優選的，所述應用中所述的產酸克雷伯氏菌M0W-02-05菌株進行培養的培養基組分為蔗糖6. 84重量份數，染料O. 327重量份數，K2HPO41. O重量份數，KH2PO4 O. 5重量份數，(NH4)2SO4 2. O重量份數，MgSO4 · 7H20 O.1重量份數，微量元素溶液I重量份數。本發明的又一目的在于提供一種染料廢水凈化處理方法，其特征在于所述方法中以權利要求1所述的產酸克雷伯氏菌M0W-02-05菌株為菌種，碳源為電子供體，偶氮染料為電子受體，進行脫色凈化處理。使用的微生物產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)M0W-02-05菌株分離自中國科學技術大學蘇州研究院的環境科學技術實驗室的間歇式厭氧污泥反應器，現在已經保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，分類命名為Klebsiella oxytoca M0W-02-05,保藏編號為CGMCC No. 5237，保藏日期為2011年9月9日。該菌株的篩選方法是使用常規的分離、純化和篩選過程，活化培養基(IL):蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化鈉10g, pH 7 ;篩選培養基(IL):葡萄糖l.Og,甲基橙0. 5g，K2HPO41.llg, KH2PO4 2. 09g, NaHCO3 0. 5g，NH4Cl 0. 28g，MgSO4 · 7H20 0. lg，酵母膏 0.1g ;厭氧脫色和生物產氫培養基(IL): 蔗糖6. 84g，甲基橙0.327g，K2HPO41. Og，KH2PO4 0. 5g,(NH4) 2S042. 0g, MgSO4 · 7H20 0. lg,微量元素溶液 Iml ;微量元素溶液(IL)FeSO4 · 7H205g，ZnSO4 · 7H20 0. Ollg, MnCl2 · 4H20 0. lg, CuSO4 · 5H20 0. 392g, Co (NO3)2 · 6H20 0. 248g,NaB4O7 · IOH2O 0. 177g, NiCl2 · 6H20 0. 025g。本發明提供的產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)菌株，命名為M0W-02-05，此菌經過Biolog微生物鑒定系統鑒定以及此菌16S rDNA序列分析，其屬于產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)中的成員。產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)M0W-02-05的16S rDNA全基因序列已向美國國家生物技術信息中心(NCBI)的Genebank基因序列數據庫遞交，登錄號為FJ816026。產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)M0W-02-05的微生物學特性1、形態學方面的特性微生物本身形態學特性菌體為革蘭氏陰性短桿狀，大小為(0.2 0.4)μ mX (2. O 2. 3) μ m，無鞭毛，有動力，無芽孢，無莢膜。2、培養學方面的特性培養基用的是Luria-Bertani (LB)培養基。其在LB固體培養基上的微生物學特性菌落呈圓形，光滑，濕潤，表面凸起，中心不透明，邊緣規則，大小為l_3mm，有輕微異味。該菌為兼性厭氧菌。3、生理生化特征( I)桿狀；
(2)革蘭氏陰性；(3)氧化/發酵(0/F) :F發酵型；(4)氧化酶陰性；(5) DNA 酶(37° C):陰性；(6)檸檬酸陽性；(7)乳糖陽性;(8)蔗糖陽性；(9)苯丙氨酸脫氨酶陰性；(10) D-葡萄糖，產酸陽性；(11) D-葡萄糖，產氣陽性；(12)甘露醇陽性；(13)尿素陽性；(14)丙二酸鹽陽性；(15)半乳糖陽性;(16)硝酸鹽還原 陽性；(17)木糖陰性；(18)蜜二糖陽性；(19)鼠李糖陽性；(20)纖維二糖陽性；(21)肌醇陽性；(22)吲哚陰性;(23)甲基紅陰性(24) V-P 實驗陽性；通過生理生化檢測、Biolog微生物鑒定系統鑒定以及此菌16S rDNA序列分析均表明此菌為產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)中的成員，因此可以精確地將本發明的M0W-02-05分類為產酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)，從而建立了分類鑒定微生物的一種快速(利用Biolog微生物鑒定系統，16h內即可得到鑒定結果)、可靠、準確的途徑。本發明的細菌經鑒定為Klebsiella oxytoca M0W-02-05，實驗表明該菌株能在24小時能將培養基中的327mg/l的甲基橙染料全部降解。并且，該細菌對多種染料如活性黑-5、甲基紅、消散橙_3、酸紅-88等均具有良好的脫色能力，同時產氫量可達到1. 6mol/mol glucose。充分說明該菌株可用于各種含染料廢水的生物系統，具有廣泛的實際應用前
旦
-5^ O一株脫色、產氫細菌，命名為產酸克雷伯氏菌M0W-02-05 (KlebsiellaoxytocaM0W-02-05)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo. 5237。所述的Klebsiella oxytoca MOff-O2-O5菌落圓點狀，淡黃色，表面光滑，GenBank注冊號為FJ816026，它的16SrRNA序列為SEQ No.1所示的序列，即GCAGTCGACGGTAGCACAGAGAGCTTGCTCTCGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGCGATAAGGTTAATAACCTTGTCGATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTGGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTTCCCTTGAGGAGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGGGAACTTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTA。
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所述的菌株Klebsiella oxytoca M0W-02-05使用常規的分離、純化的培養方法，其特征是用接種環挑取活化平板培養基上的細菌菌株接到裝有菌種活化培養基的三角瓶中，在設置溫度設置為35°C、轉速為180rpm的搖床里震蕩8小時，所得菌體離心(8，OOOg)20分鐘，菌體用磷酸鹽緩沖液洗滌，再離心，反復3次，即可獲得乳白色無污染的菌株細胞。所述培養基組成成分為蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化鈉10g，加水至1L，pH 7。所述菌株Klebsiella oxytoca M0W-02-05的用途,能使多種偶氮染料脫色,且能利用溶液中的有機碳源(葡萄糖、蔗糖等進)產氫，厭氧脫色和生物產氫培養基組成成分為蔗糖 6. 84g,染料 0. 327g，K2HPO41. 0g, KH2PO4O. 5g，(NH4)2SO4 2. 0g, MgSO4 · 7H20 0.1g,微量元素溶液1ml。微量元素溶液(IL)=FeSO4 · 7H20 5g, ZnSO4 · 7H20 0. Ollg, MnCl2 · 4Η200· lg,CuSO4 · 5Η20 O. 392g, Co (NO3) 2 · 6Η20 O. 248g, NaB4O7 · IOH2O O. 177g, NiCl2 · 6Η20 O. 025g,加水至lL，pH7.0。以該菌株為菌種，葡萄糖為碳源(電子供體)，偶氮染料為電子受體，同時進行脫色和產氫作用。相對于現有技術中的方案，本發明的優點是本發明的目的是提供一株分離自間歇式厭氧污泥反應器的能夠高效降解染料且生物產氫的菌株，并利用該菌株對染料廢水進行脫色處理同時回收氫氣。該細菌是一株具有極高活力，對染料具有廣譜的脫色能力，同時對葡萄糖等有機碳源具有高效的產氫能力，其培養方法簡單，生長速度快，不易變異，可以用作研究細菌對染料脫色和生物產氫機制雙重作用的模式菌株，具有在染料廢水處理以及生物產氫的工業化應用前景。
下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述圖1為本發明篩選所得的染料降解與產氫細菌的電鏡圖。
圖2為本發明細菌的產氫動力學實驗圖。
具體實施例方式以下結合具體實施例對上述方案做進一步說明。應理解，這些實施例是用于說明本發明而不限于限制本發明的范圍。實施例中采用的實施條件可以根據具體廠家的條件做進一步調整，未注明的實施條件通常為常規實驗中的條件。實施例1菌體的篩選I)待間歇式厭氧污泥反應器間歇停止時，取反應器的底泥Iml ；2)加入充滿氮氣且裝有IOOml篩選培養基的血清瓶中，在設置溫度為35° C、轉速為120rpm的搖床中震蕩至血清瓶內液體無色；3)取此時血清瓶中的菌液1ml，再重復步驟2，得到篩選5次后的菌液；4)取Iml篩選5次的菌液，用無菌水稀釋5000倍后涂布到固體LB培養基平板上，在通過平板劃線分離法得到單個菌株；5)用接種環挑取平板培養基上的單個菌株，接入到LB液體培養基中好氧生長8小時，離心，收集菌體；6)將收集得到的菌體，重復步驟2后，利用目視比色法，選取脫色效果最佳的一株菌株。如前所述，所用的 篩選培養基組成成分為葡萄糖l.Og，甲基橙0.5g，K2HPO4
1.1 lg，KH2PO4 2. 09g，NaHCO3 O. 5g，NH4Cl 0. 28g，MgSO4 · 7Η200· lg，酵母膏 0. lg，加水至 1L，pH7。LB培養基平板組成成分為蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化鈉10g，瓊脂15g，加水至1L,pH 7。實施例2菌體的培養用接種環挑取活化平板培養基上的細菌菌株Klebsiella oxytocaM0W-02_05接到裝有菌種活化培養基的三角瓶中，在設置溫度為35°C、轉速為180rpm的搖床里震蕩8小時，所得菌體離心(8，OOOg) 20分鐘，菌體用磷酸鹽緩沖液洗滌，再離心，反復3次，即可獲得乳白色無污染的菌株細胞。如前所述，培養該菌株的培養基組成成分為蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化鈉10g，加水至lL，pH7。實施例3菌體形態學觀察細菌的光學顯微鏡觀察按照實施例2的方法收集菌體，采用常規的火焰固定法固定細菌，后放入光學顯微鏡下進行染色實驗觀察。細菌的掃描電子顯微鏡(SEM)觀察按照實施例2的方法收集菌體，用50mM磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌三次，然后用
2.5%戊二醛固定過夜，再用PBS洗滌三次，最后用乙醇依次脫水、真空干燥制成樣本，噴金后用SEM進行觀察。實施例4菌株的鑒定按照實施例2的步驟收集菌體，根據細菌DNA提取試劑盒的方法步驟提取出菌株的總DNA，并通過瓊脂糖凝膠電泳驗證。取50ml的DNA樣品進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增，用于擴增的PCR反應弓丨物為通用引物正向引物27F 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ；反向引物 1492R5-GGTTACCTTGGTTACGACTT-3 ;擴增條件95。C 5min ;60。C 30S ;72。Clmin,30個循環；72° C 9min。得到的PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳驗證后進行16S rRNA基因測序,將序列輸入到GenBank核酸數據庫中利用BLAST軟件進行序列比對，得到菌株的序列與M0W-02-05的相似性達到99%。實施例5菌株對偶氮染料的脫色和生物產氫效果1、在250ml的厭氧脫色和生物產氫培養基中接種實施例2得到的純菌株，調整溶液中細菌濃度為O. 3g細胞干重/I ;以不加菌株的培養基作為對照組。將裝置放入35°C恒溫搖床中，以180rpm轉速震蕩脫色、產氫。如前所述，厭氧脫色和生物產氫培養基組成成分為蔗糖6. 84g,染料O.1mol,K2HPO41. 0g, KH2PO4 O. 5g，(NH4)2SO4 2. 0g, MgSO4 · 7H20 O.1g,微量元素溶液 Iml ;微量元素溶液(IL) =FeSO4 · 7H20 5g, ZnSO4 · 7H20 O. Ollg, MnCl2 · 4Η200· lg, CuSO4 · 5Η20 O. 392g,Co (NO3) 2 · 6Η20 O. 248g, NaB4O7 · IOH2O O. 177g, NiCl2 · 6Η200· 025g，加水至 1L, ρΗ7· O。2、每隔10分鐘取氣體樣一次，用注射器排出血清瓶的氣體體積，并用氣體取樣針抽取Iml排出的氣體，供氣相色譜GC-TCD測定氫氣量；色譜條件為sA分子篩為單體，高純氬氣作為載氣，流速30ml/min，進樣口、柱溫、檢測器溫度分別為100°C、5(TC和100°C。每隔30分鐘取液體樣一次，樣品經過離心，取上清液利用紫外-可見分光光度計測定培養基在染料的最大吸收峰處的吸收值。脫色率(％)= (A-B)/AX 100%，其中A為脫色前培養基的OD值，B為脫色后的培養基OD值。在該培養條件下，菌株Klebsiella oxytoca M0W-02-05對327mg/L甲基橙染料脫色率24小時內達99%以上，產氧量可達1. 6mol/mol glucose。上述實例只為說明本發明的技術構思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術的人是能夠了解本發明的內容并據以實施，并不能以此限制本發明的保護范圍。凡根據本發明精神實質所做的等效變換或修飾 ，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。
< 110>中國科學技術大學蘇州研究院
<120>產酸克雷伯氏菌MOW-02-05及其篩選方法和應用< 30>
<160>I
<170>PAT E NTIN V E RSION 3.5
<210> I<211> 1404
<212> RNA
<213> Klebsiella oxytoca<400> I
gcagtcgacg qftaqrcacaqfa qfaqrcttgctctcggqftgacg agtgqfcgqfac ggqftqragtaa60 tgtctgggaa actgcctgat ggagggggataactact.gga aaccfgtagct aataccgcat120
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tcccggqcct tgtacacacc gcccgtcacaccatggcragt gcrgttgcaaa agaagtagqt1330agcttaacct tc^fgagggfc qfcta 丄4U權利要求
1.一種產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)M0W-02_05,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為CGMCCNo. 5237。
2.根據權利要求1所述的產酸克雷伯氏菌M0W-02-05，其特征在于所述細菌菌落圓點狀，淡黃色，表面光滑。
3.根據權利要求1所述的產酸克雷伯氏菌M0W-02-05，其特征在于所述細菌的16S rRNA 序列為 SEQ No.1。
4.一種權利要求1所述的產酸克雷伯氏菌M0W-02-05的培養篩選方法，其特征在于所述方法包括將間歇式厭氧污泥反應器中污泥樣品進行稀釋后按照常規培養形成菌落，然后挑單菌落分離純化得到純化的產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)M0W-02-05的步驟。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述方法中還包括將所述純化的產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)M0W-02-05菌株按照3 5%的接種量接入液體培養基，液體培養基的PH值控制在6. 8 7. 2范圍內，培養溫度為33 38°C，培養時間為24h 48h， 得到擴大培養的產酸克雷伯氏菌M0W-02-05菌株。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述方法中所述的液體培養基以其組分的配比計包括蛋白胨10重量份數，酵母膏5重量份數，氯化鈉10重量份數，水1000重量份數，且液體培養基的pH值控制在6. 8 7. 2。
7.—種權利要求1所述的產酸克雷伯氏菌M0W-02-05在染料廢水凈化處理以及生物產氫中的應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于所述應用中以權利要求1所述的產酸克雷伯氏菌M0W-02-05菌株為菌種，碳源為電子供體，偶氮染料為電子受體，同時進行脫色和產氫作用。
9.根據權利要求7所述的應用，其特征在于所述應用中權利要求1所述的產酸克雷伯氏菌M0W-02-05菌株進行培養的培養基組分為蔗糖6. 84重量份數，染料O. 327重量份數，K2HPO41. O 重量份數，KH2PO4 O. 5 重量份數，(NH4)2SO4 2. O 重量份數，MgSO4 · 7H20 O.1 重量份數，微量元素溶液I重量份數。
10.一種染料廢水凈化處理方法，其特征在于所述方法中以權利要求1所述的產酸克雷伯氏菌M0W-02-05菌株為菌種，碳源為電子供體，偶氮染料為電子受體，進行脫色凈化處理。
全文摘要
本發明公開了一種產酸克雷伯氏菌MOW-02-05及其篩選方法和應用，該菌分離自間歇式厭氧污泥反應器，能夠高效降解染料和生物產氫，利用該菌株對偶氮染料進行脫色和對有機碳源進行生物產氫。經鑒定這株菌為Klebsiella oxytoca MOW-02-05，并將其保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物保藏中心，保藏編號為CGMCC No.5237。本發明得到的菌株可解決傳統厭氧反應器處理偶氮染料廢水時存在的反應器酸化的問題，適合應用于印染染料廢水的生物處理。
文檔編號C02F3/34GK103045499SQ201210427588
公開日2013年4月17日 申請日期2012年10月31日 優先權日2012年10月31日
發明者虞磊, 俞漢青, 李文衛 申請人:中國科學技術大學蘇州研究院