專利名稱：一種解鳥氨酸克雷伯菌的反硝化篩選純化方法
技術領域：
本發明屬反硝化菌的篩選純化領域，特別是涉及一種解鳥氨酸克雷伯菌的反硝化 篩選純化方法。
背景技術：
隨著工業廢水和生活污水的大量排放，水體富營養化日益嚴重，高效去除水中氮 素污染成為當今的一個熱點問題。氮污染主要來源為城市污水、工業廢水、畜禽養殖廢水、 垃圾填埋滲濾液等，污染物持續進入水體，造成水生植物和藻類過度生長，同時藻類產生的 毒素引起引起魚和其他水生需氧動物死亡。傳統理論認為反硝化是一個嚴格的厭氧過程， 而自20世紀80年代首次發現好氧反硝化菌后，好氧反硝化菌的分離及其性能研究迅速發 展，國內外最近報道的有戴爾福特菌屬(Delftia)，沙門氏菌屬(Salmonella)和假單胞菌 屬(Pseudomonas)等。C. W. Lindau和M. Robert Hamersley等則分別證實了河流和湖泊等 地表水中，都存在著大量的反硝化菌和厭氧氨氧化細菌，而蘇州河是上海市內重要的水體 功能地表水，但由于其接納的污水量大，污染負荷遠遠超過自凈能力，水質受到嚴重污染， 各種水體功能也因此受到損害，因此在污染較嚴重的地段能篩選出高性能的反硝化菌種。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種解鳥氨酸克雷伯菌的反硝化篩選純化 方法，該方法簡單，成本低，材料來源廣泛，適合于共業化生產；所得解鳥氨酸克雷伯菌 (Klebsiellaornithinolytica)反硝化效率可達87. 6 %，且易于滅活，保證了使用的生態 安全性。本發明的一種解鳥氨酸克雷伯菌的反硝化篩選純化方法，包括(1)將污水按1 100的體積比接入富集培養基，于30°C，110r/min搖床中富集培 養 24h ；(2)將步驟(1)富集培養后的菌株用稀釋平板涂布法轉接至固體分離培養基，置 于30°C恒溫培養箱培養24 48h，經過3次劃線分離得到純化菌種；(3)將純化菌種富集后，按18 23%的接種量接種到液體分離培養基，測試菌株 在30°C、好氧條件下培養24h時的反硝化率，篩選出反硝化率達75%以上的單一菌株，轉接 斜面培養基，4°C下保存。所述的污水取自蘇州河。所述步驟(1)中的富集培養基為蛋白胨10g，牛肉浸出粉4g，酵母浸出粉3g， NaC15g，蒸餾水1000ml，pH 7. 4-7. 6 ；固體培養基中加入18g/L的瓊脂粉。所述步驟(2)和(3)中的分離培養基為碳源3 5g，KN032g, K2HPO4O. 5g， MgSO4 · 7H20 0. 2g, FeSO4 · 7H20 0. 05g, CaCl2O. 02g，定容到 1000ml，調節 pH 7. 4-7. 6 ；固體 培養基另外加1.8% W/V瓊脂。所述的碳源為乙酸鈉、丙酸鈉、乙醇、谷氨酸鈉、檸檬酸鈉、酒石酸鉀鈉、甲醇、硫代硫酸鈉、葡萄糖或碳酸氫鈉。所述的碳源為葡萄糖，在分離培養基中的用量為5g，培養基初始pH值為7. 5。所述步驟(3)中的菌株為較短粗的桿菌，單獨排列，無芽胞，無鞭毛，長度約 0. 8-1. 5微米，直徑約0. 3-0. 6微米；菌落呈灰白色，圓形；革蘭氏染色呈陰性。所述菌株經16S rDNA序列測定和分析比較，鑒定為解鳥氨酸克雷伯菌，命名為 Klebsiella ornithinolytica N-4，同源性達到 97%。本發明為污染治理提供了新的方法。有益效果(1)本發明的方法簡單，成本低，材料來源廣泛，適合于工業化生產；(1)本發明所得的解鳥氨酸克雷伯菌(Klebsiella ornithinolytica)N_4具 有較高的反硝化作用，反硝化效率可達87. 6% ；菌株在好氧的條件下具有良好效果，能 適應復雜的實際條件，在培養基上能存活數周至數月；解鳥氨酸克雷伯菌(Klebsiella ornithinolytica)N-4的種源為蘇州河污染嚴重的路段，解鳥氨酸克雷伯菌(Klebsiella ornithinolytica) N-4對一般抗生素均無抗性，且易于滅活，55°C 30分鐘即可殺死，保證了 使用的生態安全性。
圖1為解鳥氨酸克雷伯菌(Klebsiella ornithinolytica)N-4的系統進化樹；圖2為解鳥氨酸克雷伯菌(Klebsiella ornithinolytica)N-4的掃描電鏡；圖3為解鳥氨酸克雷伯菌(Klebsiella ornithinolytica)N-4的革蘭氏染色效果 圖；圖4為解鳥氨酸克雷伯菌(Klebsiella ornithinolytica)N_4的生長曲線及其反 硝化效果；圖5為解鳥氨酸克雷伯菌(Klebsiella ornithinolytica)N_4在不同接種量下所 需的反硝化時間；圖6為解鳥氨酸克雷伯菌(Klebsiella ornithinolytica)N_4在不同溫度下的反 硝化效果；圖7為解鳥氨酸克雷伯菌(Klebsiella ornithinolytica)N-4在不同pH下的反 硝化效果；圖8為解鳥氨酸克雷伯菌(Klebsiella ornithinolytica)N-4降解速率的測定。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人 員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定 的范圍。實施例1高效脫反硝化菌的分離篩選與鑒定(1)將蘇州河不同地段取回來的水樣，分別吸取Iml至裝有100ml富集培養基的250ml錐形瓶中，30°C，110r/min搖床中培養24h ；富集培養基蛋白胨10g，牛肉浸出粉4g，酵母浸出粉3g，NaCl 5g，蒸餾水1000ml， pH 7. 4-7. 6。(2)然后用稀釋平板涂布法接種至固體分離培養基，置于30°C恒溫培養箱培養 24 48h，經過3次劃線分離得到純化菌種；分離培養基葡萄糖5g，KN032g，K2HPO4O. 5g，MgSO4 ·7Η20 0. 2g，FeSO4 ·7Η20 0. 05g, CaCl2O. 02g，瓊月旨 18g，定容至Ij 1000ml，調節 pH 7· 4 7· 6。(3)將純化得到的菌株富集后，按20%接種量接種到反硝化試驗培養基中(即液 體分離培養基)，測試各菌株在不同碳源(乙酸鈉、丙酸鈉、乙醇、木糖、乳糖、酒石酸鉀鈉、 甲醇、硫代硫酸鈉、葡萄糖或碳酸氫鈉)中，于30°C、好氧條件下培養24h時后的反硝化率， 篩選出反硝化率在75%以上性能良好的菌株；反硝化試驗培養基葡萄糖5g (或等量替代上述碳源)，KN032g, K2HPO4O. 5g， MgSO4 · 7H20 0. 2g, FeSO4 · 7H20 0. 05g, CaCl2O. 02g，蒸餾水 1000ml, pH 7. 4 7. 6。(4)然后對菌體進行革蘭氏染色(圖3)和電鏡掃描(圖2)，觀察菌株的外部形態 特征，并將分離出的菌種接種到斜面培養基上(酵母膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂18g， 蒸餾水1000ml，pH 7. 0-7. 2)，4°C下保存于冰箱中待后續進行降解試驗，同時將單一菌落送 至上海基康生物技術公司測定全序列，確定菌種類型。實施例2高效反硝化菌的最佳條件將實施例1篩選出的性能最好的反硝化菌命名為N-4。將N-4菌種以接種量，分別接種于實施例1富集培養基和分離培養基，在30°C 好氧條件下，檢測30h內菌種生物量及其硝態氮含量的變化(圖4)，由圖可知，生物量在 15h前后達到峰值，而硝態氮含量在24h達到最低，并且在接種量較小情況下，菌種延遲期 時間較長，不能短時間內發揮反硝化作用。然后分別測定N-4菌在-30%接種量情況下 (其余培養條件相同)，反硝化所需的時間(圖5)，由圖可知，在接種量由增加到20% 時，反硝化時間大大縮短，但當接種量大于20%后，反硝化時間都沒有太大變化，而且隨菌 體濃度增加，營養物質消耗加快，菌體進入衰亡期時間提前，不利于長期觀察。因此菌株N-4 的最佳接種量為20%左右。(1)將菌株N-4接種于不同初始pH值的試驗培養基中(培養基成分相同)，接種 量為20%，30°C培養24h，測定反硝化率知反硝化適宜在偏堿條件下(pH為6. 5 8. 5)進 行，PH低于7. 0和高于8. 0反硝化速率下降幅度很大見(圖6)，最適生長pH值為7. 5。(2)不同溫度下，在pH值7. 5的反硝化試驗培養基中接入20%的含菌株N_4的培 養液，培養測定菌株N-4的反硝化速率和反硝化率(圖7)。由圖7可知30°C時菌株N-4的 反硝化效率最大，從應用角度考慮，生物反硝化宜選用在30°C左右條件下進行。通過生長條件優化得出N-4的最適生長條件為在葡萄糖為唯一碳源下，最適接種 量為20%，最適培養基初始pH值為7. 5，最佳溫度為30°C。實施例3高效反硝化菌的降解效率分析在反硝化試驗培養基中，培養基初始PH值調為7.5，NO3-N質量濃度為280mg · 此處的濃度是否根據培養基中KN032g的量換算得到)接種量為20%，在30°C 下培養，間隔2h取樣測定培養基中硝態氮的降解速率(圖8)。由圖可知，N-4對NO3-N的 降解效果良好，在培養基中延遲期很短。在0 8h營養液中的NO3-N濃度迅速下降，8h后 NO3-N濃度繼續呈下降趨勢，但趨于平緩，16h內降解率達87.6%。反硝化試驗培養基葡萄糖5g，KN032g，K2HPO4O. 5g，MgSO4 · 7H20 0. 2g， FeSO4 · 7H200. 05g, CaCl2O. 02g，蒸餾水 1000ml, pH 7. 5。表1反硝化菌株篩選的碳源試驗
權利要求
一種解鳥氨酸克雷伯菌的反硝化篩選純化方法，包括(1)將污水按1∶100的體積比接入富集培養基，于30℃，110r/min搖床中富集培養24h；(2)將步驟(1)富集培養后的菌株用稀釋平板涂布法轉接至固體分離培養基，置于30℃恒溫培養箱培養24～48h，經過3次劃線分離得到純化菌株；(3)將純化菌株富集后，按18～23％的接種量接種到液體分離培養基，測試菌株在30℃、好氧條件下培養24h時的反硝化率，篩選出反硝化率為75％-100％的單一菌株，轉接斜面培養基，4℃下保存。
2.根據權利要求1所述的一種解鳥氨酸克雷伯菌的反硝化篩選純化方法，其特征在 于所述步驟⑴中的富集培養基為蛋白胨10g，牛肉浸出粉4g，酵母浸出粉3g，NaCl 5g， 蒸餾水1000ml，pH 7. 4-7. 6 ；固體培養基中加入18g/L的瓊脂粉。
3.根據權利要求1所述的一種解鳥氨酸克雷伯菌的反硝化篩選純化方法，其特 征在于所述步驟⑵和(3)中的分離培養基為碳源3 5g，KN032g, K2HPO4O. 5g, MgSO4 · 7Η200· 2g, FeSO4 · 7Η20 0. 05g, CaCl2O. 02g，定容到 1000ml，調節 pH 7. 4-7. 6 ；固體 培養基另外加1.8% W/V瓊脂。
4.根據權利要求3所述的一種解鳥氨酸克雷伯菌的反硝化篩選純化方法，其特征在 于所述的碳源為乙酸鈉、丙酸鈉、乙醇、谷氨酸鈉、檸檬酸鈉、酒石酸鉀鈉、甲醇、硫代硫酸 鈉、葡萄糖或碳酸氫鈉。
5.根據權利要求3或4所述的一種解鳥氨酸克雷伯菌的反硝化篩選純化方法，其特征 在于所述的碳源為葡萄糖，在分離培養基中的用量為5g，培養基初始pH值為7. 5。
6.根據權利要求1所述的一種解鳥氨酸克雷伯菌的反硝化篩選純化方法，其特征在 于所述步驟(3)中的菌株經16S rDNA序列測定和分析比較，鑒定為解鳥氨酸克雷伯菌，命 名為Klebsiella ornithinolytica N_4，同源性達到97% ；菌株為短粗的桿菌，單獨排列， 無芽胞，無鞭毛，長度0. 8-1. 5微米，直徑0. 3-0. 6微米；菌落呈灰白色，圓形；革蘭氏染色 呈陰性。
全文摘要
本發明涉及一種解鳥氨酸克雷伯菌的反硝化篩選純化方法，包括將污水按1∶100的體積比接入富集培養基，于30℃，110r/min搖床中富集培養24h；將富集培養后的菌株轉接至固體分離培養基，經過3次劃線分離得到純化菌株；將純化菌株按18～23％的接種量接種到液體分離培養基，測試菌株在30℃、好氧條件下培養24h時的反硝化率，篩選出反硝化良好的單一菌株。本發明的方法簡單，成本低，材料來源廣泛，適合于共業化生產；所得解鳥氨酸克雷伯菌(Klebsiella ornithinolytica)反硝化效率可達87.6％，且易于滅活，保證了使用的生態安全性。
文檔編號C12N1/20GK101886053SQ20101019550
公開日2010年11月17日 申請日期2010年6月8日 優先權日2010年6月8日
發明者孫超, 王苑, 趙曉祥, 魏俊虎 申請人:東華大學