專利名稱：疊氮基或端炔基修飾的聚苯乙烯樹脂及其制備方法
技術領域：
本發明涉及疊氮基或端炔基修飾的聚苯乙烯樹脂及其制備方法，特別是涉及反應
活性末端為含疊氮基團修飾或端炔的聚苯乙烯樹脂及其制備方法與在生命分析中，尤其是生物分子捕獲及釋放中的應用。 生物分子的富集和分離是生命分析化學中的一個重要問題。在組分復雜的細胞裂解液或蛋白裂解液中，往往需要捕獲或提取其中的某些確定組分，進而對其進行分析和進一步處理。 多年以來，用于生物分子的捕獲和釋放的技術主要涉及利用抗體-抗原技術以及
巰基與二硫鍵的可逆樹脂捕獲。第一種方法中，一般將目標生物分子上修飾加入生物素基
團，而后利用相關的蛋白進行分子捕獲和釋放。該方法中，新基團的引入比較困難。后續利
用蛋白進行分子捕獲和釋放的過程中會導致一定的樣品損失。第二種方法中，巰基和二硫
鍵的轉化過程中容易受到氧氣的干擾，樹脂性質不穩定，容易氧化失去功能。 因此，利用性質穩定的基團以及樹脂上的高效、快速反應，可捕獲生物分子，進而
達到分離富集生物分子的目的。
發明內容
本發明的目的是提供疊氮基或端炔基修飾的聚苯乙烯樹脂及其制備方法。
本發明提供的疊氮基或端炔基修飾的聚苯乙烯樹脂，其結構通式如式I所示，
式I結構通式中，X為1-3個天然氨基酸殘基組成的肽段或主鏈碳原子數為1 6、總碳原子數為2 10的含有羰基的烷基，優選為-C0CH2CH2- ;R為疊氮基或乙炔基；Y的可選基團分為如下種類 A、芐醇羧酸酯，原酸酯等容易被弱酸切割的連接基團；
B、硝基苯胺等可以光照切割的基團；
C、原酸酰胺等容易被弱堿切割的連接基團。 Y優選為式n或式ni所示的基團。
背景技術：
(式I)<formula>formula see original document page 6</formula>
(式n) (式m) 當R為疊氮基，Y為式II結構式所示的基團時，疊氮基修飾的聚苯乙烯樹脂的結構
通式如式IV所示。
<formula>formula see original document page 6</formula>
當R為乙炔基，Y為式II結構式所示的基團時，端炔基修飾的聚苯乙烯樹脂的結構通式如式V所示。
<formula>formula see original document page 6</formula>
(式v) 當R為乙炔基，Y為式III結構式所示的基團時，疊氮基修飾的聚苯乙烯樹脂的結構
通式如式VI所示。
<formula>formula see original document page 6</formula>(式VI)
當R為疊氮基，Y為式III結構式所示的基團時，端炔基修飾的聚苯乙烯樹脂的結構通式如式vn所示。
(式VII) 本發明提供的制備式IV結構通式所示的疊氮基修飾的聚苯乙烯樹脂的方法，是在1-羥基苯并三氮唑(H0BT)、苯并三氮唑-N， N， N' ， N' _四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)存在的條件下，采用標準樹脂接枝方法，將羥基末端樹脂或氨基末端的感光樹脂與疊氮基修飾的羧酸進行反應，得到疊氮基修飾的聚苯乙烯樹脂。
該方法中，l-羥基苯并三氮唑為N-羥基類多肽縮合劑，苯并三氮唑-N， N， N'，N'-四甲基脲六氟磷酸鹽為脲正離子型多肽縮合劑，4-二甲氨基吡啶為堿性催化劑。所用的端羥基樹脂為林克_酸樹脂或4-(4-羥甲基-3-苯甲氧基)丁酰基聚苯乙烯樹脂，端氨基感光樹脂為a -甲基-6-硝基-藜蘆基胺聚苯乙烯樹脂或a -甲基-6-硝基-藜蘆基醇聚苯乙烯樹脂。疊氮基修飾的羧酸為疊氮丙酸或疊氮丁酸，端炔基修飾的羧酸為丙炔酸或丁炔酸，端羥基樹脂和端氨基感光樹脂的粒徑為50-100目。端羥基樹脂或端氨基感光樹脂與疊氮基修飾的羧酸的摩爾比為1 : 2-1 : 4。反應溫度為20-6(TC，反應時間為0.5-8小時。 該方法中所用疊氮基修飾的羧酸可使用鹵化物和疊氮化鈉的反應制備，具體制備方法如下述文獻所述Alvanez S. G. ， Alvarez M. T. A Practicalprocedure for thesynthesis of alkyl azides at ambient temperature in dimethylsulforide in highpurity and yield[J]. Synthesis, 1997 :413-414 ;Varma R. S. ，Naicker K. P. ，A new routeto alkyl azides from alkyl bromides and sodiumazide[J]. Tetrahedron Lett. ，1998，39(19) ;2915-2918。所用4-(4-羥甲基-3-苯甲氧基)丁酰基聚苯乙烯樹脂可按照下述文獻的方法進行制備Florsheimer，A. and Riniker，B. (1991). P印tides 1990-Proceedingsof the 21stEuropean Peptide Symposium(ed. E. Giralt and D. Andreu) ， p. 131. ESCOM，Lieden。所用a _甲基_6_硝基-藜戸基胺聚苯乙烯樹脂和a -甲基_6_硝基-藜戸基醇聚苯乙烯樹脂均可按照下述文獻的方法進行制備Holmes， C. P. andjones， D. G. (1995).J. Org. Chem. ，60,2318。 另外，羥基末端樹脂和氨基末端的感光樹脂可用各種能溶解該樹脂的有機溶劑進行溶脹，如二氯乙烷；羥基末端樹脂和氨基末端的感光樹脂與疊氮基修飾的羧酸進行反應的介質為各種常用的有機溶劑，如N， N-二甲基甲酰胺。 本發明提供的制備式V結構通式所示的端炔基修飾的聚苯乙烯樹脂的方法，是在
71-羥基苯并三氮唑(H0BT)、苯并三氮唑-N， N， N' ， N' _四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)存在的條件下，將羥基末端樹脂或氨基末端的感光樹脂與端炔基羧酸進行反應，得到端炔基修飾的聚苯乙烯樹脂。 該方法中，l-羥基苯并三氮唑為N-羥基類多肽縮合劑，苯并三氮唑-N， N， N'，N'-四甲基脲六氟磷酸鹽為脲正離子型多肽縮合劑，4-二甲氨基吡啶為堿性催化劑。羥基末端樹脂為林克_酸樹脂或4-(4-羥甲基-3-苯甲氧基)丁酰基聚苯乙烯樹脂，氨基末端的感光樹脂為a-甲基-6-硝基-藜蘆基胺聚苯乙烯樹脂，或a-甲基-6-硝基-藜蘆基醇聚苯乙烯樹脂，疊氮基修飾的羧酸為疊氮丙酸或疊氮丁酸。羥基末端樹脂或氨基末端的感光樹脂與端炔基羧酸的摩爾比為1 : 2-1 : 6。該反應溫度為反應溫度為20-6(TC，反應時間為0. 5-8小時。 另外，羥基末端樹脂和氨基末端的感光樹脂可用各種能溶解該樹脂的有機溶劑進行溶脹，如二氯乙烷；羥基末端樹脂和氨基末端的感光樹脂與疊氮基修飾的羧酸進行反應的介質為各種常用的有機溶劑，如N， N- 二甲基甲酰胺。 本發明提供的疊氮基或端炔基修飾的聚苯乙烯樹脂，不僅能捕獲體系中指定的分子，還能在溫和的條件下將捕獲的分子釋放出來，在所捕獲的分子末端加上一個分子片斷，該分子片斷具有質譜質量標簽及質譜信號增益標簽的作用。該樹脂化合物在生命分析領域，尤其是蛋白質翻譯后修飾位點測定領域內具有廣闊的應用前景。
具體實施例方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。
實施例1、合成疊氮基修飾的聚苯乙烯樹脂CR-01 1)取3-溴-丙酸70mg，碳酸鈉106mg放于三口瓶中，注入DMF(N， N-二甲基甲酰胺)10mL后，加入NaN3 (疊氮化鈉)330mg，于60度下回流6小時，出現白色渾濁。
2)過濾后，將剩余液體于燒瓶中懸蒸，之后用油泵繼續懸蒸。 3)懸蒸到瓶中沒有液體，加15mL水溶解，并轉移到分液漏斗中，加入15mL乙酸乙酯，萃取并棄去水相，反復加入水萃取三次，得到3_疊氮基丙酸。 4)將32mg HOBT(l-羥基苯并三氮唑)，82mg HBTU(苯并三氮唑-N，N，N' ，N'-四甲基脲六氟磷酸鹽)，49mg DMAP (4- 二甲氨基吡啶)3-疊氮基丙酸28mg溶于5mL DMF (N，N-二甲基甲酰胺)中，加入二氯甲烷溶脹的100mg林克-酸樹脂(RinkAcid Resin) (50-100目，負載0. 6mmol/g)，室溫下震蕩2小時后，以DCM( 二氯甲烷)和DMF交替洗滌所得的樹脂，得到本發明提供的疊氮基修飾的聚苯乙烯樹脂CR-01，該樹脂的結構式如式WI所示。
其中，林克-酸樹脂(Rink Acid Resin)購自南開和成公司，產品編號為HCRA01-1。
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(式VIII) 利用疊氮基修飾的聚苯乙烯樹脂進行端炔化合物的捕獲和釋放將lmL DMF(N，N-二甲基甲酰胺)、lmL飽和NaCl溶液、1. 3mg CuCl^P 17. 6mgVC(維
生素C)混勻，配制成樹脂捕獲反應液。稱取3mg上述疊氮基修飾的聚苯乙烯樹脂CR-01，加入DCM( 二氯甲烷5mL震蕩4小時，抽至半干。在樹脂中加入lmL樹脂捕獲反應液，20微升3-炔基-l-醇，震蕩過夜。
將0. lmL乙酸和0. 9mL乙腈混勻，配制成樹脂切割液。 將樹脂用DMF洗滌三次，利用DCM洗滌一次后，抽至干燥。在樹脂中加入樹脂切割液lmL，室溫下震蕩2小時。切割后取溶液部分抽至干燥，再溶于甲醇之后進行質譜檢測，正離子模式下觀察。可以觀測到預計產物僅的質譜峰m/z = 186(+H+) ， m/z = 208 (+Na+)。
<formula>formula see original document page 9</formula>
(式IX) 實施例2、合成端炔基修飾的聚苯乙烯樹脂CR-02 將32mgH0BT(1-羥基苯并三氮唑)，82mgHBTU (苯并三氮唑-N， N， N' ， N'-四甲基脲六氟磷酸鹽)，49mgDMAP (4- 二甲氨基吡啶)3- 丁炔1-酸20mg溶于5mLDMF (N， N- 二甲基甲酰胺)中，加入二氯甲烷溶脹的100mg林克-酸樹脂(Rink Acid Resin) (50-100目，負載0. 6mmol/g)，室溫下震蕩2小時后，以DCM( 二氯甲烷)和DMF交替洗滌所得的樹脂，得到本發明提供的疊氮基修飾的聚苯乙烯樹脂CR-02，該樹脂的結構式如式X所示。 稱取3mg上述疊氮基修飾的聚苯乙烯樹脂CR-02，加入DCM( 二氯甲烷5mL震蕩4小時，抽至半干。在樹脂中加入lmL樹脂捕獲反應液，20微升疊氮丙酸，震蕩過夜。
將0. lmL乙酸和0. 9mL乙腈混勻，配制成樹脂切割液。 將樹脂用DMF洗滌三次，利用DCM洗滌一次后，抽至干燥。在樹脂中加入樹脂切割液lmL，室溫下震蕩2小時。切割后取溶液部分抽至干燥，再溶于甲醇之后進行質譜檢測，正離子模式下觀察。可以觀測到預計產物XI的質譜峰m/z = 186(+H+) ， m/z = 208 (+Na+)。<formula>formula see original document page 9</formula>
(式X)
(式XI) 實施例3、合成端炔基修飾的感光樹脂CR-03 取a -甲基-6-硝基-藜蘆基胺聚苯乙烯樹脂lOOmg，其結構式如式XH所示，負載
為0.6mmol/g，粒度為50-100目，以DCM(二氯甲烷)溶脹。 將32mg HOBT(l-羥基苯并三氮唑)，82mg HBTU(苯并三氮唑-N，N，N' ，N'-四甲基脲六氟磷酸鹽)，49mg DMAP(4-二甲氨基吡啶)3-疊氮基丙酸28mg溶于5mL匿F(N，N-二甲基甲酰胺，商業可購得)中。將樹脂與此溶液混合，在室溫下震蕩2小時后，以DCM(二氯甲烷)和DMF交替洗滌所得的樹脂，得到本發明提供的疊氮基修飾的聚苯乙烯樹脂CR-03，該樹脂的結構式如式XIII所示。
(式xni) 稱取3mg上述疊氮基修飾的聚苯乙烯樹脂CR-03，加入DCM( 二氯甲烷5mL震蕩4小時，抽至半干。在樹脂中加入lmL樹脂捕獲反應液，20微升3-炔基-l-醇，震蕩過夜。
(式xn)
10
將0. lmL乙酸和0. 9mL乙腈混勻，配制成樹脂切割液。 將樹脂用DMF洗滌三次，利用DCM洗滌一次后，抽至干燥。將樹脂置于氙燈下照射震蕩2小時。切割后取溶液部分抽至干燥，再溶于甲醇之后進行質譜檢測，正離子模式下觀察。可以觀測到預計產物(結構式如式XIV所示)的質譜峰m/z = 186 (+H+) ， m/z =208 (+Na+)。
(式XIV) 實施例4、合成端炔基修飾的感光樹脂CR-04 取a -甲基-6-硝基-藜蘆基胺聚苯乙烯樹脂lOOmg，其結構式如式XH所示，負載為0.6mmol/g，粒度為50-100目，以DCM(二氯甲烷)溶脹。 將32mg HOBT(l-羥基苯并三氮唑)，82mg HBTU(苯并三氮唑_N， N， N' ， N'-四甲基脲六氟磷酸鹽)，49mg DMAP(4-二甲氨基吡啶)，3-丁炔l-酸20mg溶于5mL DMF(N，N-二甲基甲酰胺)中。將樹脂與此溶液混合，在室溫下震蕩2小時后，以DCM(二氯甲烷)和DMF交替洗滌所得的樹脂，得到本發明提供的疊氮基修飾的聚苯乙烯樹脂CR-02，該樹脂的結構式如式XVI所示。 稱取3mg上述疊氮基修飾的聚苯乙烯樹脂CR-04，加入DCM( 二氯甲烷5mL震蕩4小時，抽至半干。在樹脂中加入lmL樹脂捕獲反應液，20微升疊氮丙酸，震蕩過夜。
將0. lmL乙酸和0. 9mL乙腈混勻，配制成樹脂切割液。 將樹脂用DMF洗滌三次，利用DCM洗滌一次后，抽至干燥。將樹脂置于氙燈下照射震蕩2小時。切割后取溶液部分抽至干燥，再溶于甲醇之后進行質譜檢測，正離子模式下觀察。可以觀測到預計產物(結構式如式XVII所示)的質譜峰m/z = 186(+H+) ， m/z =208 (+Na+)。
(式XVI)<formula>formula see original document page 12</formula>
權利要求
一種疊氮基或端炔基修飾的聚苯乙烯樹脂，其結構通式如式I所示，(式I)所述式I結構通式中，n為500-4000，X為1-3個天然氨基酸殘基組成的肽段或主鏈碳原子數為1～6、總碳原子數為2～10的含羰基的烷基；R為疊氮基或乙炔基；Y為芐醇羧酸酯、原酸酯、硝基苯胺或原酸酰胺。F2009100761834C0000011.tif
2.根據權利要求1所述的疊氮基或端炔基修飾的聚苯乙烯樹脂，其特征在于所述X為-0)(^2(^2-，所述Y為式II或式III結構式所示的基團。<formula>formula see original document page 2</formula>
3.根據權利要求2所述的疊氮基或端炔基修飾的聚苯乙烯樹脂，其特征在于所述R;氮基，所述Y為式II結構式所示的基團時，所述疊氮基修飾的聚苯乙烯樹脂的結構通為式如式IV所示。<formula>formula see original document page 2</formula>(式IV)
4.根據權利要求2所述的疊氮基或端炔基修飾的聚苯乙烯樹脂，其特征在于所述R為乙炔基，所述Y為式II結構式所示的基團時，所述端炔基修飾的聚苯乙烯樹脂的結構通式如式V所示。<formula>formula see original document page 2</formula>(式v)
5.根據權利要求2所述的疊氮基或端炔基修飾的聚苯乙烯樹脂，其特征在于所述R為乙炔基，所述Y為式III結構式所示的基團時，所述端炔基修飾的聚苯乙烯樹脂的結構通式如式VI所示。<formula>formula see original document page 3</formula>
6.根據權利要求2所述的疊氮基或端炔基修飾的聚苯乙烯樹脂，其特征在于所述R為疊氮基，所述Y為式III結構式所示的基團時，所述疊氮基修飾的聚苯乙烯樹脂的結構通式如式VII所示。
7. —種制備權利要求3和6所述疊氮基修飾的聚苯乙烯樹脂的方法，是在1-羥基苯并三氮唑、苯并三氮唑-N，N，N' ，N' _四甲基脲六氟磷酸鹽和4-二甲氨基吡啶存在的條件下，將端羥基樹脂或端氨基感光樹脂與疊氮基修飾的羧酸進行反應，得到所述疊氮基修飾的聚苯乙烯樹脂。
8. 根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述端羥基樹脂為林克_酸樹脂或4-(4-羥甲基-3-苯甲氧基)丁酰基聚苯乙烯樹脂；所述端氨基感光樹脂為a -甲基-6-硝基-藜蘆基胺聚苯乙烯樹脂或a -甲基-6-硝基-藜蘆基醇聚苯乙烯樹脂；所述疊氮基修飾的羧酸為疊氮丙酸或疊氮丁酸；所述端羥基樹脂和端氨基感光樹脂的粒徑為50-100目。
9. 根據權利要求7或8所述的方法，其特征在于所述端羥基樹脂或端氨基感光樹脂與疊氮基修飾的羧酸的摩爾比為l : 2-1 : 6 ;所述反應溫度為20-6(TC，反應時間為0.5-8小時；所述端羥基樹脂和端氨基感光樹脂均是用二氯乙烷溶脹的；所述端羥基樹脂和端氨基感光樹脂與疊氮基修飾的羧酸進行反應的介質為N， N- 二甲基甲酰胺。
10. —種制備權利要求4和5所述端炔基修飾的聚苯乙烯樹脂的方法，是在1-羥基苯(式VII)并三氮唑、苯并三氮唑-N，N，N' ，N' _四甲基脲六氟磷酸鹽和4-二甲氨基吡啶存在的條件下，將端羥基樹脂或端氨基感光樹脂與端炔基羧酸進行反應，得到所述端炔基修飾的聚苯乙烯樹脂。
11. 根據權利要求10所述的方法，其特征在于所述端羥基樹脂為林克_酸樹脂或4-(4-羥甲基-3-苯甲氧基)丁酰基聚苯乙烯樹脂；所述端氨基感光樹脂為a -甲基-6-硝基-藜蘆基胺聚苯乙烯樹脂a -甲基-6-硝基-藜蘆基醇聚苯乙烯樹脂；所述端炔基修飾的羧酸為丙炔酸或丁炔酸；所述端羥基樹脂和端氨基感光樹脂的粒徑為50-100目。
12. 根據權利要求10或11所述的方法，其特征在于所述端羥基樹脂或端氨基感光樹脂與端炔基羧酸的摩爾比為1 : 2-1 : 6;所述反應溫度為20-6(TC，反應時間為0.5-8小時；所述將端羥基樹脂和端氨基感光樹脂均是用二氯乙烷溶脹的；所述端羥基樹脂或端氨基感光樹脂與端炔基羧酸進行反應的介質為N， N- 二甲基甲酰胺。
全文摘要
本發明公開了疊氮基或端炔基修飾的聚苯乙烯樹脂及其制備方法。該疊氮基或端炔基修飾的聚苯乙烯樹脂，其結構通式如式I所示。本發明提供的疊氮基或端炔基修飾的聚苯乙烯樹脂，不僅能捕獲體系中指定的分子，還能在溫和的條件下將捕獲的分子釋放出來，在所捕獲的分子末端加上一個分子片斷，該分子片斷具有質譜質量標簽及質譜信號增益標簽的作用。該樹脂化合物在生命分析領域，尤其是蛋白質翻譯后修飾位點測定領域內具有廣闊的應用前景。
文檔編號B01J20/285GK101775088SQ20091007618
公開日2010年7月14日 申請日期2009年1月13日 優先權日2009年1月13日
發明者馮玉萍, 劉沖, 盧小利, 張凌峰, 李艷梅, 林天舒, 王芹珠, 程智慧, 胡笳, 蔡輝, 趙鐳, 魏瑋, 黃志華 申請人:清華大學