一種可用于酶聯免疫反應的微流芯片的制作方法

專利名稱：一種可用于酶聯免疫反應的微流芯片的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種微流芯片，特別涉及一種廉價、易于制備、可用于酶聯免疫反應的微流芯片。
背景技術：
酶聯免疫反應(Enzyme-linked immunoassay，簡稱ELISA)是一種利用抗原抗體之間專一性鍵合的特性對抗體進行檢測的方法。自上世紀60年代以來，這種免疫酶技術被廣泛應用于生物學及醫學等領域，用于檢測動物血清中抗體、病毒、激素以及疾病標記物等重要指標。常規的ELISA反應是在96孔板上實現的，分析中每一步需要清洗和混合的過程。 這種技術存在反應時間長、樣品操作不均一和試劑消耗量大等缺陷。基于這些問題，研究者引入了微流芯片這一新技術，原理是通過化學分析設備的微型化與集成化，最大限度的把分析實驗室的功能轉移到便攜的分析設備中，甚至集成到方寸大小的芯片上。常規的微流芯片在免疫檢測領域具有顯著的優越性，但是也存在缺陷和困難。例如，應當如何控制微流芯片免疫技術中普遍偏高的背景值，如何避免因流體失控而造成組內和組間CV值較大的現象。有研究者將共聚焦顯微鏡以及內反射熒光顯微鏡引入微流技術，復雜的設備應用顯然不利于實際的應用和推廣。尤其是目前的研究方向多集中在設備的革新上，雖然可以實現靈敏度高的ELISA，卻無法完全模擬傳統模式臨床血清檢測。由此可見，微流控免疫檢測技術仍然有很大的開發空間。基于以上分析，發明人提出“綜合優化，利用最簡易裝置達到快速高效檢測”的思路。目標在最基本設備如熒光顯微鏡、CCD、閥門等不做改變的情況下，對可變因素如芯片設計，反應條件進行優化，將常規免疫臨床檢測順利轉移到微流芯片的裝置中，達到快捷高效的目的。

發明內容
本發明的目的正是為了解決現有技術中基于微流芯片的ELISA設備復雜、昂貴、 背景值高、組內和組間CV值較大等問題，提供一種廉價、易于制備且適合進行高通量、高效、快捷ELISA試驗的微流芯片。本發明中的“芯片”與通常本領域所定義的芯片概念相同，其外觀為厚度均一的平整片狀物體，最常見的形狀為長方形或正方形。本發明中的“一條微流通道”指的是從入口到出口之間連通的直線型的微流通道。本發明中的“交疊點”指的是微流通道與控制通道在微流芯片上的投影的相交點。 顯而易見，由于微流通道和控制通道屬于不同的層，它們之間不可能是連通的。本發明中的“交匯點”指的是同一個微流層的不同微流通道之間交匯連通的點。因此，與同一個交匯點相連的不同微流通道之間通過交匯點連通。除非特別說明，本發明的“η種以上”、“η種以下”均包括數值η本身。本發明的設計思路是，首先，制備方法采用多層軟光刻技術以降低生產成本、減小制備難度。其次，該芯片部分設計借鑒Mephen R. Quake的研究成果，控制層閥門均為彈性體閥門，除此之外，還在管道交叉處增加圓形下壓閥，即反應閥門，利用其控制反應室的面積；和過去簡單地將抗體固定于十字管道交叉處的研究不同，此結構增強了微環境下免疫反應區域的可控性。雖然最近很多研究展現了磁珠法在微流免疫檢測中的優勢，但是考慮到檢測樣品多來自于病人血清，含有大量雜質，容易與單位表面積大并且反應強度高的磁珠發生非特異性吸附，另外磁珠法自身的缺點如過柱時間很長，洗脫不完全等缺點，因此發明人放棄磁珠，最終采用環氧基團修飾后的玻片固相基底進行檢測。本發明采用的技術方案如下。一種可用于酶聯免疫反應的微流芯片，所述微流芯片包括微流層、控制層以及將微流層和控制層連接起來的連接層，微流層具有至少一條微流通道，控制層具有至少一條控制通道，所述至少一條微流通道與所述至少一條控制通道具有至少一個交疊點，所述交疊點位置的連接層由彈性體材料構成，當控制通道中的壓力增加到一定值時，上述至少一個交疊點位置的彈性體連接層將向微流層方向膨脹并與微流通道內表面接觸而形成一定大小的接觸面，其中至少一部分交疊點處形成的接觸面的寬度小于交疊點處微流通道的寬度，從而保持微流通道處于連通的狀態，當控制通道中的壓力恢復時，交疊點位置的彈性體連接層恢復原態，上述交疊點處的結構在酶聯免疫反應中生成反應區域，稱為“反應閥門”; 其余交疊點處的彈性體連接層將向微流層方向膨脹并與微流通道內表面接觸至完全阻斷微流通道，使其處于斷開的狀態，當控制通道中的壓力恢復時，交疊點位置的彈性體連接層恢復原態，微流通道重新連通，上述交疊點處的結構用于控制微流通道的連通狀態，稱為 “控制閥門”。采用上述技術方案便可以簡單而方便地進行ELISA實驗。利用上述芯片進行 ELISA實驗時，先施加一定的壓力到反應閥門所在的控制通道上，閥門將膨脹并與微流通道內壁接觸從而保護一定面積的微流通道，此時往微流通道中通入封閉液體，將沒有被保護的微流通道表面(即非ELISA反應區域)封閉起來；然后，通入包被抗原并撤銷施加到反應閥門所在的控制通道的壓力，這使得包被抗原流經微流通道的時候，只會在被反應閥門保護的區域大量吸附，區別于周圍的非ELISA反應區域；之后再依次通入各種相應的抗原抗體溶液進行反應，最后對圓形閥區域的熒光進行圖片采集，便完成了一個ELISA實驗。優選的，微流層具有兩條以上的微流通道，所述兩條以上的微流通道具有至少一個交匯點，“反應閥門”位于上述交匯點處。多條微流通道形成十字交匯點，便可以通過不同走向的微流通道輸入不同的液體，方便操作。將“反應閥門”設于上述交匯點處，不同的液體便都可以流經反應位點了。優選地，微流通道分為橫向和縱向兩組，組內的微流通道之間沒有交匯點，每一條微流通道均與另一組所有的微流通道交匯。由此，微流通道之間就形成縱橫交錯的網絡，每一個交匯點都具有反應位點，一塊微流芯片就可以同時進行多個ELISA實驗。例如，橫向微流通道數目為m，縱向微流通道數目為n，m、n皆為大于或等于2的整數，則交匯點的數目為 mXn，反應位點的數目也有mXn個。優選地，任意兩個相鄰的反應閥門之間均設置一個控制閥門。這樣，當把反應閥門左右兩側的控制閥門關閉，同時將反應閥門上下兩側的控制閥門打開，則液體只能沿著縱向的微流通道流動；相反，當把反應閥門上下兩側的控制閥門關閉，同時將反應閥門左右兩側的控制閥門打開，則液體只能沿著橫向的微流通道流動。這樣做的好處是，通過縱向的微流通道輸送一種液體，通過橫向的微流通道輸送另一種液體，兩種液體彼此不會混合，而只在反應位點交替流過。另外，當需要對反應位點進行孵育的時候，關閉反應位點周圍(也即反應閥門周圍)所有的4個控制閥門，則可以在反應應點處封閉一定的液體，進行充分的孵育。優選地，微流層、控制層和連接層均由彈性體材料構成，控制通道在與微流通道的交疊點處擴大形成空腔。由于許多彈性體材料具有良好的加工成型的性能，例如熱塑性、熱固性、輻射誘導交聯等，無需昂貴的設備以及復雜的方法，采用實驗室簡單的常用設備便可以方便地制備出各種結構的微流芯片。控制通道在與微流通道的交疊點處擴大形成空腔， 由于空腔位置的連接層較薄，因此當控制通道中的壓力增加時，空腔位置處的連接層將最先膨脹，控制合適的壓力便可以保證只有空腔范圍內的連接層膨脹，從而只在與空腔范圍對應的微流通道內壁區域形成空白區。優選地，反應閥門處的空腔在微流通道寬度方向上的尺寸小于微流通道的寬度， 控制閥門處的空腔在微流通道寬度方向上的尺寸大于微流通道的寬度，以保證反應閥門下壓的時候微流通道還處于連通狀態，而控制閥門下壓的時候微流通道處于斷開狀態。優選地，所述空腔的形狀為圓形、長方形或正方形。空腔的形狀實際上并不受限制，但為了方便觀察比較實驗結果的考慮，反應閥門空腔一般都設置成規則的相同形狀，例如圓形、長方形或正方形等。控制閥門空腔一般設置為長方形或正方形，保證其在微流通道寬度上的尺寸大于微流通道的寬度即可。優選地，彈性體材料選自聚二甲基硅氧烷(PDMS)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、聚碳酸酯(PC)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚氨酯、聚乙烯、聚丙烯、聚甲基戊烯、聚四氟乙烯(PTFE)、聚氯乙烯(PVC)、環狀聚烯烴共聚合物(Cyclic Olefin Copolymers ；COC)、 聚偏二氟乙烯、聚苯乙烯、聚砜、尼龍、苯乙烯-丙烯酸共聚物、天然橡膠、聚異戊二烯、丁基橡膠、商化丁基橡膠、聚丁二烯、丁苯橡膠、丁腈橡膠、氯丁二烯橡膠、乙丙橡膠、表氯醇橡膠、聚丙烯酸酯橡膠、硅酮橡膠、氟硅橡膠、含氟彈性體(FKM)、全氟彈性體(FFKM)、乙烯-乙酸乙烯酯、節肢彈性蛋白(resilin)、彈性蛋白(elastin)、聚酰亞胺、酚醛樹脂中的一種或者任意兩種以上的混合物。實施例中使用聚二甲基硅氧烷制備微流芯片，這是由于PDMS具有許多有利于微澆筑、微模塑和微圖案化的材料特性。本領域技術人員能夠了解，所有本領域現有的彈性體材料都能應用于本發明的微流芯片中，而并不限于上述優選的實例。本發明還提供一種使用上述微流芯片進行酶聯免疫反應(ELISA)的方法先施加一定的壓力到反應閥門所在的控制通道上，閥門將膨脹并與微流通道內壁接觸從而保護一定面積的微流通道，此時往微流通道中通入封閉液體，將沒有被保護的微流通道表面-即非ELISA反應區域-封閉起來；然后，通入包被抗原并撤銷施加到反應閥門所在的控制通道的壓力，包被抗原流經微流通道的時候，只會在被反應閥門保護的區域大量吸附反應，區別于周圍的非ELISA反應區域；之后再依次通入各種相應的抗原抗體溶液進行反應，最后對圓形閥區域的熒光進行圖片采集，便完成了一個ELISA實驗。使用本發明的微流芯片進行ELISA實驗的優點是顯而易見的，首先，微流芯片可以通過很簡單、廉價的方法制得，而不需要昂貴的大型儀器；其次，不需要共聚焦顯微鏡以及內反射熒光顯微鏡等復雜的非常規設備，使用最基本設備如熒光顯微鏡、CCD、閥門等便可以進行常規免疫臨床檢測，達到快捷高效的目的。低消耗、高通量等微流控芯片特有的優勢使得本微流控芯片使用極少量的樣品就可以多個并行檢測結果，適用于工業上的應用。


圖1 (a) —種優選結構的ELISA集成微流芯片全圖；(b)ELISA集成微流芯片局部放大圖，藍色圓形閥門用來生成反應區域，紅色及黃色閥門用來隔離出反應小室；(C)施加壓力到反應閥門上，連接層薄膜下壓保護住流體層的局部區域；(d)撤銷施加到反應閥門上的壓力，連接層薄膜恢復原始狀態，不再保護流體層的局部區域；(e)用黃色染料來表現封閉液流入流體層管道的過程，圓形閥門下壓，保護反應區域；(f)用藍色染料來表現包被抗原流入流體層管道的過程，圓形閥門釋放壓力，反應液物理吸附在反應區域；(g)用帶 FITC綠色熒光標記的BSA溶液驗證閥工作的原理，圓形熒光陣列表明反應區域；(h)用直接 ELISA反應來驗證ELISA集成微流控芯片工作原理，其中，包被抗原的濃度及檢測一抗的濃度均為1. 5mg/ml。圖2芯片設計平面圖(使用AutoCAD2010繪制，LinkCad填充，分辨率為1 μ m)，綠色表示流體層，黑色表示控制層，中央密布圓形反應室的區域稱為反應區。C1，C2，C3，C4閥門分別控制洗滌液體(PBS)，封閉緩沖液(Blocking Buffer)，包被抗體(CapAb)，檢測抗體 (DetAb)的進樣；C5閥門控制八梯度平行通道(待測樣本)進樣；C6閥門保護整個芯片；C7 閥門控制液體沿縱向平行管道流動；C8閥門控制液體沿橫向平行管道流動；C9閥門控制廢液出口(Layout) ；ClO閥門(Quake閥)控制反應閥門的形成；Cll控制四梯度樣本(其他試劑通道)進樣。圖3Epoxy玻片吸附能力檢測試驗。(a)-(h)ELISA反應區域原始結果圖；(i)_(p) ELISA反應區域結果經matlab處理后的偽彩圖，顏色對應color bar表明熒光的亮度，對應的包被抗原的濃度梯度依次為 lmg/ml，200 μ g/ml，40 μ g/ml，8 μ g/ml，1· 6 μ g/ml，0. 3 μ g/ ml，0. 06 μ g/ml, control ； (q)熒光強度曲線，用Image-J得到不同濃度包被抗原下的反應區域的熒光強度對數值。圖4不同濃度一抗的檢測試驗。(a)_(h)ELISA反應區域原始結果圖；⑴_(p) ELISA反應區域結果經matlab處理后的偽彩圖，顏色對應color bar表明熒光的亮度，對應的一抗的濃度梯度依次為 1 μ g/ml, 100ng/ml, 10ng/ml, lng/ml，lOOpg/ml, lOpg/ml, lpg/ ml,0pg/ml (control) ； (q)熒光強度曲線，用Image-J得到不同濃度一抗下的反應區域的熒
光強度對數值。
具體實施例方式以下舉例說明微流芯片的制備方法，下面的實例中使用較簡便的光刻膠SU_8、AZP 4620以及PDMS (Sylgard 184)制備，但并不表示微流芯片只能由這樣的方法制備，本領域技術人員可以了解，任何本領域現有的技術都可以用來制備具有本發明結構的微流芯片。我們首先使用光刻蝕的方法分別制作流體層管道(即微流通道)和控制層管道 (即控制通道)的模板。控制層管道用負膠SU8-2010制作。傾倒負膠SU8-2010到干凈的硅片上，IOOOrpm的轉速旋轉1分鐘，65度加熱板烘烤5分鐘，95度加熱板烘烤10分鐘，曝光，重復65度加熱板烘烤5分鐘，95度加熱板烘烤10分鐘，顯影，150度加熱板加熱3個小時加固圖形。從而得到高度為20微米的方形管道。流體層正膠管道用正膠AZP 4620制作。將硅片用六甲基二硅烷(HMDS)熏5分鐘，然后傾倒正膠AZP 4620到熏好的干凈硅片上，IOOOrpm的轉速旋轉1分鐘，65度預熱1分鐘，95度加熱1分鐘，然后在現有光刻膠上再甩一層光刻膠后，65度預熱1分鐘，95度加熱3分鐘，115度加熱5分鐘，進一步固化各層， 曝光，顯影，然后在加熱板上以每小時增加10度的方法從40度逐步升溫到210度以圓化正膠管道，從而得到高度為25微米的半圓形管道。我們使用軟刻蝕的方法制作芯片，所用的材料為聚二甲基硅氧烷(PDMS)。在被用來制作微流控芯片之前，所有的模板都要被三甲基氯硅烷(TMCS)熏10分鐘以利于聚合的 PDMS和硅片的脫離。我們先將Sylgard 184的A組分和B組分(粘連劑)以5比1的比例混合，傾倒到控制層管道的硅片上，真空抽氣除泡，80度烘箱加熱30分鐘，從硅片上撕下帶有控制層管道的PDMS塊，切割，打孔。同時將Sylgard 184的A組分和B組分(粘連劑) 以23比1的比例混合，傾倒到流體層管道的硅片上，以1300rpm的速度將混合液體均勻甩到硅片上，80度烘箱加熱30分鐘，然后將已打好孔的控制層管道的PDMS塊對準貼合到烘好的流體層硅片上，在80度烘箱中聚合60分鐘，撕下后，打孔。另外，我們將Sylgard 184 的A組分和B組分(粘連劑)以20比1的比例混合，傾倒到載玻片上，以1300rpm的速度將混合液體均勻甩到載玻片上，80度烘箱加熱30分鐘，將打好孔的兩層聚合PDMS塊貼到載玻片上，80度烘箱加熱過夜。實施例1微流芯片的結構。本實施例詳細說明本發明的微流芯片的一個優選結構，該結構如圖1所示。該芯片的微流層具有4條橫向的微流通道、8條縱向的微流通道，彼此互相交匯形成一個4X8的棋盤矩陣，32個交匯點處的32個反應閥門對應著32個ELISA反應位點，每一個反應閥門周圍都有4個控制閥門，控制著與該反應位點相通的四個方向的微流通道，在橫向微流通道上，相鄰的兩個反應閥門之間設置了 2個控制閥門，以便在圍繞反應位點周邊形成較小的封閉反應空間，因此一共有80個這樣的控制閥門。微流通道通過若干條管道與外接相通，一部分管道用于往微流通道中注入液體，其余的管道用于從微流通道中排出液體。反應區域局部放大圖如圖1(b)所示，黃色閥門及紅色閥門用來隔離出各個反應小室，而藍色圓形閥門(即反應閥門)用來生成反應區域。當施加一定的壓力到這個反應閥門上時，反應閥門會下壓從而保護住微流通道的部分區域面積。在將包被抗原通入微流通道之前，我們會通入封閉液封閉非ELISA反應區域，此時我們施加壓力下壓反應閥門保護住流體層位于圓形閥下的面積(圖1(c)、(e))，這樣封閉液體就不會侵入反應區域。 當通入包被抗原的時候，我們釋放掉圓形保護閥的壓力(圖1(d)、(f))，這樣，包被抗原就會流經反應區域，從而只會在反應區域被大量吸附，區別于周圍的封閉區域，之后再依次通入各種相應的抗原抗體溶液進行反應，最后對圓形閥區域的熒光進行圖片采集，通過使用 Image-J程序分析熒光強度來定量標定待測抗體的濃度。我們用帶綠色熒光的BSA-FITC溶液來驗證整個芯片的功能。首先我們壓下反應閥門，通入lmg/ml的BSA溶液封閉整個芯片 10分鐘，然后通入1. 5mg/ml的BSA-FITC溶液孵育30分鐘，待PBS沖洗整個管道后，我們發現BSA-FITC溶液只會吸附在反應閥門下的區域，從而在整個芯片上會產生圓形的熒光陣列(圖1(g))。然后我們用該芯片進行了簡單的直接ELISA反應，在反應區域物理吸附1. 5mg/ml 的 Hunan IgG 孵育 10 分鐘，然后通入 1. 5mg/ml 的 Goat-anti-HumanlgG-FITC 孵育10分鐘，通過抗原抗體的相互反應使一抗連接到抗原上，PBS沖洗后可在圓形閥區域看到明顯的熒光陣列表達(圖1(h))。實施例2具體的試驗操作過程。圖2顯示了微流芯片的設計圖。下面將結合該芯片設計圖詳細說明ELISA試驗的操作過程。芯片結構如圖2所示。在實際微流芯片免疫檢測中，利用11個閥門(對應圖2的 C1-C11)控制不同試劑的進樣，以及液體的流動方向。圓形的黑色閥門是反應閥門，長方形的黑色閥門是控制閥門。Cl-Cll閥門的功能如下:C1, C2，C3，C4閥門分別控制洗滌液體 (PBS)，封閉緩沖液(Blocking Buffer)，包被抗體(CapAb)，檢測抗體(DetAb)的進樣；C5 閥門控制八梯度平行通道(待測樣本)進樣；C6閥門保護整個芯片；C7閥門控制液體沿縱向平行管道流動；C8閥門控制液體沿橫向平行管道流動；C9閥門控制廢液出口(Layout)； ClO閥門(Quake閥)控制反應閥門的形成；Cll控制四梯度樣本(其他試劑通道)進樣。以直接夾心ELISA (Direct Sandwich ELISA)為例,具體操作如下(1)進樣前排氣控制層施加壓力為0. 15MI^左右，流體層壓力為控制層1/10。進樣前將控制層所有閥門關閉，按照圖1中的排序，依次往流體層通入試劑，排去氣泡。(2)封閉反應區封閉Button(ClO)被施加壓力保護其正下方的區域(即反應區域)，依次打開閥門C2、C6、C7、C8、C9，封閉液進入微流管道。當封閉液占據絕大部分區域后關閉C9，用封閉液將管道中的氣泡排走。之后，關閉以上所有閥門；孵育。(3)洗滌孵育完畢后，打開閥門C1、C6、C7、C8、C9，洗滌液進入，洗去殘留封閉液， 洗滌后關閉所有控制層閥門。(4)抗體包被依次打開閥門C3、C6、C7、C8、C9，通入包被抗體；待排去殘留洗滌液后，打開閥門C10，保證反應區域的基底第一時間被包被抗體包被(未與封閉液和洗滌液接觸)，依次關閉除ClO外的以上閥門；孵育時長15分鐘。注C10在此步包被完成后不再關閉。(5)洗滌孵育完畢后，打開閥門Cl、C6、C7、C8、C9，通入洗滌液，洗去殘留包被抗
體，洗滌后關閉所有控制層閥門。(6)再次封閉依次打開閥門C2、C6、C7、C8、C9，封閉液再次進入微流管道，進一步封閉Button內基底未與包被抗體結合的空白位點；孵育時長10分鐘，完畢后充分洗滌。(7)通入樣品依次打開C5、C8、C9，待測樣品以及標準樣品從S1-S8入口進入，沿縱向平行管道流過反應區，關閉所有控制閥；孵育時長15分鐘，此時抗原與包被抗體結合， 完畢后充分洗滌。(8)通入檢測抗體依次打開C4、C6、C7、C8、C9，通入檢測抗體，后關閉以上閥門，
孵育時長5分鐘，完畢后充分洗滌。(9)提前10分鐘打開汞燈，使用藍光激發，在熒光顯微鏡下觀察Button內殘留信號，并用CXD拍照。實施例3用本發明的芯片進行ELISA實驗的結果。
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經過資料的檢索，為了更好的吸附包被抗原，我們使用印oxy玻片來取代簡單的 PDMS吸附，首先我們檢測印oxy玻片的吸附能力。我們將lmg/ml的Human IgG按照5X的梯度稀釋，通入以印oxy為基底的芯片中，孵育20分鐘，然后通入Goat-anti-Human IgG-FITC 的帶熒光標記的一抗孵育3分鐘，洗滌后采集熒光信號，如圖2(a-h)所示，將原始圖片用 matlab偽彩處理后通過顏色表明熒光強度的強弱，如圖2(i-p)所示。圖片所示區域的 Human IgG 的強度依次為 lmg/ml，200 μ g/ml，40 μ g/ml，8 μ g/ml，1· 6 μ g/ml，0· 3 μ g/ml， 0. 06yg/ml,0yg/ml (control)。用Image-J處理圖片得到熒光的實際對數數值，描繪成曲線，如圖2(q)所示。由圖片及曲線結果，我們發現，隨著包被濃度的提高，熒光強度隨之提高，但當包被濃度過高后，由于非特異性吸附導致除反應區域外的封閉區域也會產生較強的熒光信號。若包被濃度過低，則導致之后的抗原抗體反應信號過低，影響準確性。
經過多次摸索及濃度梯度試驗，我們選取500μ g/ml作為包被抗原的濃度， 125 μ g/ml作為檢測抗體的濃度。在此條件下，我們對lpg/ml至1 μ g/ml區間以10X的濃度梯度對檢測抗體進行檢測。我們將500 μ g/ml的Mouse-anti-Human IgG通入以印oxy 為基底的芯片中，孵育15分鐘，然后通入不同濃度的Human IgG的一抗孵育10分鐘，最后通入125 μ g/ml的Goat-anti-Human IgG-FITC的帶熒光標記的檢測二抗，孵育5分鐘，洗滌后采集熒光信號，如圖3 (a-h)所示，將原始圖片用matlab偽彩處理后通過顏色表明熒光強度的強弱，如圖3 (i-p)所示。圖片所示區域的Human IgG的強度依次為1 μ g/ml，IOOng/ ml, 10ng/ml, lng/ml, lOOpg/ml, lOpg/ml, lpg/ml, Opg/ml (control)。用 Image-J 處理圖片得到熒光的實際對數數值，描繪成曲線，如圖32(q)所示。由圖片及曲線結果，我們發現，隨著一抗濃度的提高，熒光強度隨之提高，熒光強度可以表明待測一抗的濃度。
權利要求
1.一種可用于酶聯免疫反應的微流芯片，其特征在于所述微流芯片包括微流層、控制層以及將微流層和控制層連接起來的連接層，微流層具有至少一條微流通道，控制層具有至少一條控制通道，所述至少一條微流通道與所述至少一條控制通道具有至少一個交疊點，所述交疊點位置的連接層由彈性體材料構成，當控制通道中的壓力增加到一定值時，上述至少一個交疊點位置的彈性體連接層將向微流層方向膨脹并與微流通道內表面接觸而形成一定大小的接觸面，其中至少一部分交疊點處形成的接觸面的寬度小于交疊點處微流通道的寬度，從而保持微流通道處于連通的狀態，當控制通道中的壓力恢復時，交疊點位置的彈性體連接層恢復原態，上述交疊點處的結構在酶聯免疫反應中生成反應區域，稱為“反應閥門”；其余交疊點處的彈性體連接層將向微流層方向膨脹并與微流通道內表面接觸至完全阻斷微流通道，使其處于斷開的狀態，當控制通道中的壓力恢復時，交疊點位置的彈性體連接層恢復原態，微流通道重新連通，上述交疊點處的結構用于控制微流通道的連通狀態，稱為“控制閥門”。
2.根據權利要求1所述的微流芯片，其特征在于微流層具有兩條以上的微流通道，所述兩條以上的微流通道具有至少一個交匯點，“反應閥門”位于上述交匯點處。
3.根據權利要求2所述的微流芯片，其特征在于微流通道分為橫向和縱向兩組，組內的微流通道之間沒有交匯點，每一條微流通道均與另一組所有的微流通道交匯。
4.根據權利要求3所述的微流芯片，其特征在于橫向微流通道數目為m，縱向微流通道數目為n，m、η皆為大于或等于2的整數，交匯點的數目為mXη。
5.根據權利要求1-4的任一項所述的微流芯片，其特征在于任意兩個相鄰的反應閥門之間均設置一個控制閥門。
6.根據權利要求1-5的任一項所述的微流芯片，其特征在于微流層、控制層和連接層均由彈性體材料構成，控制通道在與微流通道的交疊點處擴大形成空腔。
7.根據權利要求6所述的微流芯片，其特征在于反應閥門處的空腔在微流通道寬度方向上的尺寸小于微流通道的寬度，控制閥門處的空腔在微流通道寬度方向上的尺寸大于微流通道的寬度。
8.根據權利要求6或7所述的微流芯片，其特征在于所述空腔的形狀為圓形、長方形或正方形。
9.根據權利要求1-8的任一項所述的微流芯片，其特征在于所述彈性體材料選自聚二甲基硅氧烷(PDMS)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、聚碳酸酯(PC)、聚甲基丙烯酸甲酯 (PMMA)、聚氨酯、聚乙烯、聚丙烯、聚甲基戊烯、聚四氟乙烯(PTFE)、聚氯乙烯(PVC)、環狀聚烯烴共聚合物(Cyclic Olefin Copolymers ;C0C)、聚偏二氟乙烯、聚苯乙烯、聚砜、尼龍、 苯乙烯-丙烯酸共聚物、天然橡膠、聚異戊二烯、丁基橡膠、商化丁基橡膠、聚丁二烯、丁苯橡膠、丁腈橡膠、氯丁二烯橡膠、乙丙橡膠、表氯醇橡膠、聚丙烯酸酯橡膠、硅酮橡膠、氟硅橡膠、含氟彈性體(FKM)、全氟彈性體(FFKM)、乙烯-乙酸乙烯酯、節肢彈性蛋白(resilin)、彈性蛋白(elastin)、聚酰亞胺、酚醛樹脂中的一種或者任意兩種以上的混合物。
10.使用權利要求1-9的任一項微流芯片進行酶聯免疫反應(ELISA)的方法，其特征在于先施加一定的壓力到反應閥門所在的控制通道上，閥門將膨脹并與微流通道內壁接觸從而保護一定面積的微流通道，此時往微流通道中通入封閉液體，將沒有被保護的微流通道表面-即非ELISA反應區域-封閉起來；然后，通入包被抗原并撤銷施加到反應閥門所在的控制通道的壓力，包被抗原流經微流通道的時候，只會在被反應閥門保護的區域大量吸附， 區別于周圍的非ELISA反應區域；之后再依次通入各種相應的抗原抗體溶液進行反應，最后對圓形閥區域的熒光進行圖片采集，便完成了一個ELISA實驗。
全文摘要
本發明涉及一種廉價、易于制備、可用于酶聯免疫反應的微流芯片，包括微流層、控制層以及將微流層和控制層連接起來的連接層，微流層中的微流通道與控制層中的控制通道具有至少一個交疊點，交疊點位置的連接層由彈性體材料構成，當控制通道中的壓力增加到一定值時，上述至少一個交疊點位置的彈性體連接層將向微流層方向膨脹并與微流通道內表面接觸而形成一定大小的接觸面，其中至少一部分交疊點處形成的接觸面的寬度小于交疊點處微流通道的寬度，從而保持微流通道處于連通的狀態，當控制通道中的壓力恢復時，交疊點位置的彈性體連接層恢復原態。通過上述結構可以方便地在芯片中形成ELISA反應區，從而快捷地進行ELISA試驗。
文檔編號B01L3/00GK102500435SQ201110287708
公開日2012年6月20日 申請日期2011年9月26日 優先權日2011年9月26日
發明者龐玉宏, 王建斌, 王靜雯, 鄭春紅, 黃巖誼 申請人:北京大學