一種基于直接競爭酶聯免疫法檢測鉻離子試劑盒及其應用的制作方法

本發明屬于環境檢測技術領域，具體涉及一種基于直接競爭酶聯免疫法檢測鉻離子試劑盒及其制備方法和應用。

背景技術：

近年來我國許多地方的飲用水源受到污染，各類重金屬離子的污染事件頻發，人們的身心健康受到嚴重威脅。其中工業三廢(廢水、廢氣、廢渣)對環境造成了極大的破壞，如工礦、電池、電鍍、化工等行業的工業廢水中含有大量的重金屬離子。在各種重金屬離子污染源中，鉻元素是一類廣泛存在的有毒元素，嚴重威脅著家畜及人類的健康。鉻元素經呼吸道侵入時，會損害上呼吸道，引起咽炎、鼻炎、支氣管炎，長期作用還會引起肺氣腫、支氣管擴張，肺硬化及肺癌等。我國《生活飲用水衛生標準》規定飲用水中鉻離子含量不得超過50ng/mL，食品鉻含量(GB14961-94)規定糧食類食品中不得超過1000ng/mL，果蔬類食品中不得超過500ng/mL，動物性食品肉蛋中不得超過1000ng/mL。

目前動物性食品及環境水樣中Cr³⁺污染的主要檢測方法包括傳統的理化檢驗和免疫學檢驗兩種類型的方法。理化檢驗包括紫外分光光度法(UV)、電化學分析法、原子吸收光譜法(AAS)、電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)、電感耦合等離子體原子發射光譜法(ICP-AES)、氫化物發生-原子熒光光譜法(HG-AFS)和中子活化分析法(NAA)等，它們是目前Cr³⁺污染檢測的主要方法，靈敏度高，結果準確，但由于需要昂貴的儀器設備、熟練的專業人員、煩瑣費時、周期長、費用高、不能現場操作、樣品篩檢量小等缺陷，其應用受到了限制。免疫學檢驗方法是以抗原抗體分子的特異性、可逆性反應為基礎的分析技術，包括熒光偏振免疫測定法(FPIA)、酶聯免疫吸附測定法(ELISA)、KinExA免疫測定法(KIA)、膠體金免疫層析試驗測定法(GICA)和微懸臂梁免疫傳感器(MIS)等，由于抗原抗體的結合具有高度的選擇性和敏感性，這一技術具有簡便、快速、敏感、特異、經濟、篩檢量大等優勢，代表著重金屬離子檢測的發展方向。目前，國內外重金屬鉻離子污染免疫檢測技術研究非常活躍，其中公告號為CN103439508B的專利公開了一種用于檢測鉻離子的間接競爭酶聯免疫試劑盒及其組建和檢測方法，其檢測靈敏度為2ng/mL，并且檢測時間較長。

技術實現要素：

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種基于直接競爭酶聯免疫法檢測鉻離子試劑盒及其應用，使所述試劑盒具有檢測時間短的優點，同時具有靈敏度高、特異性強的特點。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了一種基于直接競爭酶聯免疫法鉻離子檢測試劑盒，包括：

(1)包被有羊抗鼠IgG二抗的檢測板，所述檢測板真空密封包裝；所述羊抗鼠IgG二抗的包被濃度為50～200μg/mL；

(2)質量濃度為20～50μg/mL的酶標Cr-ITCBE鰲合物半抗原溶液；

(3)質量濃度為10～20μg/mL的抗鉻離子單克隆抗體溶液；所述抗鉻離子單克隆抗體溶液由Cr-ITCBE-cBSA免疫原免疫Balb/C小鼠制備而來；

(4)1.0～3.0mol/L的終止液；

(5)樣品稀釋液；

(6)底物顯色液；

(7)洗滌液；

(8)鉻離子標準品溶液；

(9)質量濃度為10～20mg/mL的EDTA處理液。

優選的，所述羊抗鼠IgG二抗的包被濃度為80～150μg/mL。

優選的，所述酶標Cr-ITCBE鰲合物半抗原的質量濃度為30～40μg/mL。

優選的，所述抗鉻離子單克隆抗體溶液的質量濃度為13～18μg/mL。

優選的，所述樣品稀釋液為質量濃度為2～10g/L的HEPES緩沖液。

優選的，所述洗滌液為包含質量濃度0.05～0.1％Tween 20的PBS溶液。

本發明還提供了所述鉻離子檢測試劑盒在檢測環境中鉻離子的應用，包括以下步驟：

a、將抗鉻離子單克隆抗體溶液、稀釋的待測樣品溶液和酶標Cr-ITCBE鰲合物半抗原溶液，加入到包被有羊抗鼠IgG二抗的檢測板孔內，混合，孵育后用洗滌液洗滌；

b、向檢測板中加入底物顯色液，孵育，加入終止液混合，測定OD值；

c、根據所述步驟b得到的OD值與預定的標準曲線，得到待測樣品中鉻離子的濃度，所述標準曲線是鉻離子濃度與OD值之間的線性關系曲線。

優選的，所述檢測板孔內抗鉻離子單克隆抗體溶液、稀釋的待測樣品溶液和酶標Cr-ITCBE鰲合物半抗原溶液的體積比為1～2：1～2：1～2。

優選的，所述步驟a和b中孵育的溫度獨立地為30～40℃。

優選的，所述步驟a和b中孵育的時間獨立地為5～30min。

本發明提供了一種基于直接競爭酶聯免疫法鉻離子檢測試劑盒，包括：(1)包被有羊抗鼠IgG二抗的檢測板，所述檢測板真空密封包裝；所述羊抗鼠IgG二抗的包被濃度為50～200μg/mL；(2)質量濃度為20～50μg/mL的酶標Cr-ITCBE鰲合物半抗原；(3)質量濃度為10～20μg/mL的抗鉻離子單克隆抗體溶液；所述抗鉻離子單克隆抗體溶液由Cr-ITCBE-cBSA免疫原免疫Balb/C小鼠制備而來；(4)1.0～3.0mol/L的終止液；(5)樣品稀釋液；(6)底物顯色液；(7)洗滌液；(8)鉻離子標準品溶液；(9)質量濃度為10～20mg/mL的EDTA處理液。本發明根據抗原抗體直接競爭性免疫層析原理設計，通過在檢測板上預包被羊抗鼠IgG二抗，使抗鉻離子單克隆抗體、待檢樣品或鉻離子標準品溶液和酶標半抗原(Cr-ITCBE-HRP)三種物質能夠同時加入，抗鉻離子單克隆抗體與預包被羊抗鼠IgG二抗結合形成復合物，樣品或標準品中的鉻離子和酶標半抗原競爭性地與抗鉻離子單克隆抗體結合，當加入底物顯色液時，樣品吸光度值與其殘留的鉻離子含量呈負相關，與標準曲線比較再乘以其對應的稀釋倍數，即可得出樣品中鉻離子的含量。本發明提供的試劑盒，減少了傳統競爭法中兩次孵育和洗滌次數，縮短了孵育和洗滌的時間30min，使試劑盒快速簡便地得到檢測結果，大大縮短了檢測周期。本發明提供的鉻離子檢測試劑盒最低檢測限(LOD)可達0.09μg/L，檢測范圍為0.14～35μg/L。

附圖說明

圖1為實施例1中免疫原合成路線圖；

圖2為實施例8中建立的dELISA和ciELISA標準曲線。

具體實施方式

本發明提供了一種基于直接競爭酶聯免疫法鉻離子檢測試劑盒，包括：

(1)包被有羊抗鼠IgG二抗的檢測板，所述檢測板真空密封包裝；所述羊抗鼠IgG二抗的包被濃度為50～200μg/mL；

(2)質量濃度為20～50μg/mL的酶標Cr-ITCBE鰲合物半抗原溶液；

(3)質量濃度為10～20μg/mL的抗鉻離子單克隆抗體溶液；所述抗鉻離子單克隆抗體溶液由Cr-ITCBE-cBSA免疫原免疫Balb/C小鼠制備而來；

(4)1.0～3.0mol/L的終止液；

(5)樣品稀釋液；

(6)底物顯色液；

(7)洗滌液；

(8)鉻離子標準品溶液；

(9)質量濃度為10～20mg/mL的EDTA處理液。

本發明提供的鉻離子檢測試劑盒包括包被有羊抗鼠IgG二抗的檢測板，所述檢測板真空密封包裝；所述羊抗鼠IgG二抗的包被濃度為50～200μg/mL，優選為80～150μg/mL，更優選為100～120μg/mL。本發明中，所述羊抗鼠IgG二抗的來源沒有特殊限制，采用本領域技術人員所熟知的羊抗鼠IgG二抗即可。

本發明中，所述包被有羊抗鼠IgG二抗的檢測板的制備方法，優選包括以下步驟：

Ⅰ.向檢測板的檢測孔中加入包被濃度為50～200μg/mL羊抗鼠IgG二抗包被液100～150μL/孔，35～40℃條件下第一次孵育1.5～3h，孵育后去除包被液，用洗滌液第一次洗板2～5次；

Ⅱ.向所述步驟Ⅰ中得到的檢測板中加入質量濃度為3～6％豬陰性血清200～300μL/孔，35～40℃條件下第二次孵育1.5～3h，孵育后去除包被液，用洗滌液第二次洗板2～5次，將檢測板在23～27℃條件下自然晾干，得到包被有羊抗鼠IgG二抗的檢測板。

本發明中，所述檢測板的種類沒有特殊限制，采用本領域技術人員技術人員所熟知的ELISA檢測板即可。所述檢測板的孔數沒有特殊限制，采用本領域技術人員所熟知的檢測板即可，例如24孔、48孔或96孔。

本發明中，所述洗滌液為PBST溶液。PBS溶液的摩爾濃度優選為0.01～0.02mol/L，更優選為0.015mol/L。所述PBS溶液的pH優選為7.4。所述Tween 20在PBS溶液中的質量濃度優選0.05～0.1％，更優選為0.08％。

本發明中，所述包被液的體積優選為120μL/孔。所述第一次孵育和第二次孵育的溫度優選獨立為37℃。所述第一次孵育和第二次孵育的時間優選獨立為2h。

本發明中，所述去除包被液的方法沒有特殊限制，采用本領域技術人員所熟知的方法即可。本發明實施例中，所述去除包被液的方法是用力甩檢測板。

本發明中，所述第一次洗板和第二次洗板的次數優選為3～4次。第一次洗滌和第二次洗板期間每次洗板的間隔時間優選為1.5～3min，更優選為2min。

本發明中，所述豬陰性血清的來源沒有特殊限制，采用本領域技術人員所熟知的豬陰性血清即可。豬陰性血清的質量濃度優選為5％。豬陰性血清的加入體積優選為220～280μL/孔，更優選260μL/孔。

本發明中，將所述包被有羊抗鼠IgG二抗的檢測板進行真空包裝，得到真空包裝的包被有羊抗鼠IgG二抗的檢測板。所述真空包裝的壓力為600～1000Pa。

本發明提供的鉻離子檢測試劑盒包括酶標Cr-ITCBE鰲合物半抗原溶液。所述酶標Cr-ITCBE鰲合物半抗原溶液的質量濃度為20～50μg/mL，優選為30～40μg/mL，最優選為35μg/mL。

本發明中，所述酶的種類沒有特殊限制采用本領域技術人員所熟知的酶種類即可。本發明實施例中，所述酶的種類為辣根過氧化物酶。

本發明中，所述酶標Cr-ITCBE鰲合物半抗原的制備方法，優選包括以下步驟：

A.將異硫氰酸芐基乙二胺四乙酸(ITCBE)與二甲基亞砜(DMSO)混合形成金屬鰲合劑溶液；

B.將氯化鉻與HEPES緩沖液混合，形成Cr³⁺溶液；

C.將所述步驟A中得到的金屬鰲合劑溶液和所述步驟B中得到的Cr³⁺溶液混合，調節混合液的pH值至7.0～7.2，得到的混合液振蕩反應10～14h，形成Cr-ITCBE鰲合物半抗原；

D.將標記用酶與HEPES緩沖液混合，得到酶溶液；

E.將所述步驟C得到的Cr-ITCBE鰲合物半抗原溶液與所述步驟D中得到的酶溶液混合，調節混合物的pH值至8.8～9.2，再將混合液振蕩反應22～26h，得到酶標Cr-ITCBE螯合物半抗原；

所述步驟A與B之間沒有時間順序的限制；C和D之間，D與A和B之間同樣沒有時間順序的限制。

本發明中，所述ITCBE的質量與二甲基亞砜體積比優選為(5～15)mg：1mL，更優選為10mg：1mL。

本發明中，制備酶標Cr-ITCBE鰲合物半抗原用HEPES緩沖液的摩爾濃度優選為8～12mmol/L，更優選為10mmol/L。所述HEPES緩沖液的pH值優選為7.8～8.5，更優選為8.0。

本發明中，所述氯化鉻的質量和HEPES緩沖液的體積比優選為10.5～18.5mg：1mL，更優選為16.1mg：1mL。

本發明中，所述金屬鰲合劑溶液和所述Cr³⁺溶液的體積比優選為0.8～1.2：0.8～1.2，更優選為1:1。

本發明中，對含有金屬螯合劑和Cr³⁺混合液的pH值調整方法沒有特殊限制，采用本領域技術人員所熟知的含有金屬螯合劑和Cr³⁺混合液的pH值調整方案即可。本發明實施例中，混合液的pH值調整方法用質量濃度為1％的氫氧化鈉溶液進行。

本發明中，所述步驟C中混合液振蕩反應的時間優選為12h。所述混合液振蕩反應的溫度優選為23～27℃，更優選為25℃。

本發明中，所述標記用酶的質量與HEPES緩沖液的體積比為(80～120)mg：1mL，更優選為100mg：1mL。

本發明中，所述Cr-ITCBE鰲合物半抗原溶液體積與所述酶溶液體積比優選為0.8～1.2：0.8～1.2，更優選為1：1。

本發明中，所述步驟D中含有酶的混合物的pH值優選為9.0。所述含有酶的混合液的pH值調整方法用質量濃度為1％的氫氧化鈉溶液進行。所述步驟D中振蕩反應的時間優選為24h。所述振蕩反應的溫度優選為23～27℃，更優選為25℃。

本發明中，所述步驟E中混合液振蕩反應后優選將Cr-ITCBE-酶半抗原溶液置于透析袋依次在蒸餾水中透析和在PBS溶液中透析，得到純化的酶標Cr-ITCBE螯合物半抗原。在本發明中，所述蒸餾水中透析的時間優選為2d；所述PBS溶液中透析的時間優選為3d。

本發明提供的鉻離子檢測試劑盒包括抗鉻離子單克隆抗體溶液。所述抗鉻離子單克隆抗體溶液的質量濃度為10～20μg/mL，優選為13～18μg/mL，更優選為15μg/mL。

本發明中，所述抗鉻離子單克隆抗體溶液由Cr-ITCBE-cBSA免疫原免疫Balb/C小鼠制備而來，本發明對抗鉻離子單克隆抗體的制備方法沒有特殊限制，采用本領域技術人員所熟知的抗鉻離子單克隆抗體的制備方案即可。

本發明中，所述Cr-ITCBE-cBSA免疫原的制備方法包括以下步驟：

(1)將ITCBE和二甲基亞砜(DMSO)按照ITCBE的質量和二甲基亞砜的體積比為(8～12)mg：1mL混合，形成金屬鰲合劑溶液；

(2)將氯化鉻與HEPES緩沖液按照16.1mg：1mL的比例混合，形成Cr³⁺溶液；

(3)將所述步驟(1)中得到的金屬鰲合劑溶液和所述步驟(2)中得到的Cr³⁺溶液按照體積比為1:1混合，調節混合液pH值至7.0，然后在23～27℃條件下振蕩反應10～14h，形成Cr-ITCBE鰲合物半抗原；

(4)將BSA、EDC與PBS緩沖液混合攪拌得到混合液，BSA質量、EDC質量與PBS緩沖液的體積比為66mg：11.6mg：5mL，將所述混合液與乙二胺按照混合液體積和乙二胺質量比為5mL：7mg的比例混合，37℃振蕩反應2h得反應液；反應液用PBS透析4d，得到活化的載體蛋白BSA；

(5)將所述活化的載體蛋白BSA和pH值為8.0的HEPES緩沖液混合，形成濃度為30mg/mL的載體蛋白溶液；

(6)將所述步驟(3)中得到的Cr-ITCBE鰲合物半抗原溶液和所述步驟(5)得到的載體蛋白溶液按照體積比為1：1的比例混合，調節pH值至9.0，23～27℃條件下振蕩反應22～26h，將得到的反應液裝入透析袋，先用蒸餾水透析2d，再用PBS透析3d，即形成Cr-ITCBE-cBSA免疫原。

所述Cr-ITCBE-cBSA免疫原的合成路線見圖1。

本發明提供的鉻離子檢測試劑盒包括終止液。所述終止液的摩爾濃度為1.0～3.0mol/L，更優選為1.5～2.5mol/L，最優選為2.0mol/L。所述終止液優選為H₂SO₄溶液。

本發明提供的鉻離子檢測試劑盒包括樣品稀釋液。所述樣品稀釋液為HEPES緩沖液。HEPES緩沖液的質量濃度優選為2～10g/L，更優選為4～8g/L，最優選為5g/L。所述HEPES緩沖液的pH值優選為7.8～8.5，更優選為8.0。

本發明提供的鉻離子檢測試劑盒包括底物顯色液。所述底物顯色液的濃度為1～2mg/mL，更優選為1.27mg/mL。所述底物顯色液的種類根據標記用酶的種類確定。本發明實施例中，酶的種類為HRP時，所述底物顯色液為四甲基聯苯胺(TMB)。

本發明提供的鉻離子檢測試劑盒包括洗滌液。所述洗滌液為包含Tween20的摩爾濃度為0.01～0.02mol/L的PBS溶液。所述PBS溶液的pH值優選為為7.0～8.0，更優選為7.4。Tween 20在PBS溶液中的質量濃度優選為0.05～0.1％，更優選為0.08％。

本發明提供的鉻離子檢測試劑盒包括EDTA處理液。EDTA處理液的質量濃度為10～20mg/mL，更優選為15mg/mL。在EDTA處理液使用時優選將樣品溶液、樣品稀釋液和EDTA處理液的體積比為5：5：1。EDTA處理液的作用是用于樣品前處理，使EDTA和鉻離子結合，形成鉻離子-EDTA鰲合物溶液，便于抗體對鉻離子的識別。

本發明提供的鉻離子檢測試劑盒包括鉻離子標準品溶液。所述鉻離子標準品溶液為Cr³⁺-EDTA溶液。所述Cr³⁺-EDTA溶液的來源沒有特殊限制，采用本領域技術人員所熟知的Cr³⁺-EDTA溶液即可。本發明實施例中，Cr³⁺-EDTA溶液為實驗室自制。所述Cr³⁺-EDTA溶液制備方法沒有特殊限制，采用本領域技術人員所熟知的Cr³⁺-EDTA溶液制備方法即可。

本發明還提供了所述鉻離子檢測試劑盒在檢測環境中鉻離子的應用，包括以下步驟：

a、將抗鉻離子單克隆抗體溶液、稀釋的待測樣品溶液和酶標Cr-ITCBE鰲合物半抗原加入到包被有羊抗鼠IgG二抗的檢測板孔內，混合，孵育后用洗滌液洗滌；

b、向檢測板中加入底物顯色液，孵育，加入終止液混合，測定OD值；

c、根據所述步驟b得到的OD值與預定的標準曲線，得到待測樣品中鉻離子的濃度，所述標準曲線是用鉻離子標準品溶液進行檢測，得到的OD值與鉻離子標準品濃度構建具有線性關系的曲線。

本發明將抗鉻離子單克隆抗體溶液、稀釋的待測樣品溶液和酶標Cr-ITCBE鰲合物半抗原加入到包被有羊抗鼠IgG二抗的檢測板孔內，混合，孵育后用洗滌液洗滌。

本發明中，所述樣品溶液檢查前優選進行稀釋。所述稀釋的倍數優選為100～1000倍，更優選為200～800倍，最優選為500倍。所述稀釋采用樣品稀釋液進行處理。所述樣品稀釋液稀釋樣品后優選加入EDTA處理液。將樣品溶液、樣品稀釋液和EDTA處理液的體積比為5：5：1。

本發明中，所述檢測板孔內抗鉻離子單克隆抗體溶液、稀釋的待測樣品溶液和酶標半抗原溶液的體積比優選為1～2：1～2：1～2，更優選為1：1：1。

本發明中，所述混合的方法優選采用移液器槍頭吹吸的方法混合。

本發明中，所述孵育的溫度優選為30～40℃，更優選為35℃。孵育的時間優選為5～30min，更優選為20min。

本發明中，所述洗滌的方法沒有特殊限制，采用本領域技術人員所熟知的洗滌方法即可。

所述步驟a中的洗滌后，本發明向得到的檢測板中加入底物顯色液，孵育，再加入終止液混合，測定OD值。

本發明中，所述底物顯色液的體積優選為60～120μL/孔，更優選為80～100μL。在本發明中，加入顯色液后孵育的時間優選為4～8min，更優選為5min。所述孵育的溫度優選為23～28℃，更優選為25℃。

本發明中，加入終止液前優選棄去檢測板中溶液。所述棄去檢測板中溶液的方法優選甩干的方式進行。

本發明中，所述終止液的加入體積優選為80～120μL/孔，更優選為100μL。混合的時間優選為2～4min，更優選為3min。

本發明中，所述OD值測定的波長優選為450nm。

得到OD值后，本發明根據預定的標準曲線和所述OD值，得到待測樣品中鉻離子的濃度。本發明中，所述標準液的檢查方法與樣品溶液檢測方法相同。以抑制率B/B₀(％)為縱坐標(B₀為Cr³⁺-EDTA為0濃度時的吸光度值，B為Cr³⁺-EDTA不同濃度時的吸光度值)，以Cr³⁺-EDTA標準品的濃度為橫坐標，繪制標準曲線，根據曲線趨勢推導回歸方程。根據稀釋后的待測樣品溶液中OD值代入回歸方程中，得到樣品中鉻離子的濃度。

下面結合實施例對本發明提供的一種基于直接競爭酶聯免疫法檢測鉻離子試劑盒及其應用進行詳細的說明，但是不能把它們理解為對本發明保護范圍的限定。

實施例1

Cr-ITCBE-cBSA免疫原的合成(圖1)

(1)稱取10mg ITCBE溶于1mL二甲基亞砜(DMSO)中形成金屬鰲合劑溶液；稱取16.1mg氯化鉻(CrCl₃.6H₂O)溶于1mL pH 8.0的HEPES緩沖液(對細胞無毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長時間控制恒定的pH范圍)(10mmol/L)中形成Cr³⁺溶液；將金屬鰲合劑溶液和Cr³⁺溶液混合，并用NaOH調節pH值至7.0，然后在室溫條件下放在搖床上反應12小時，即形成Cr-ITCBE鰲合物半抗原。

(2)稱取66mg BSA、11.6mg EDC溶于5mL PBS緩沖液中，攪拌條件下，緩慢加入7mg乙二胺(提前溶于3mL PBS+DMF溶液中)，37℃振蕩反應2h。反應液用PBS透析4d，活化的載體蛋白BSA凍干保存，即為cBSA。

(3)稱取30mg cBSA溶于1mL pH 8.0的HEPES緩沖液(10mmol/L)中形成30mg/mL的載體蛋白溶液；取1mL Cr-ITCBE鰲合物半抗原溶液加入到1mL載體蛋白溶液中并用NaOH調節pH值至9.0，室溫搖床反應24小時，反應結束后將反應液裝入透析袋，先用蒸餾水透析2d，再用PBS透析3d，即形成Cr-ITCBE-cBSA免疫原，其合成路線見圖1。

實施例2

抗鉻離子單克隆抗體的制備

所述的抗鉻離子特異性單克隆抗體由Cr-ITCBE-cBSA免疫原免疫Balb/C小鼠制備而來，由以下步驟實現：

(1)小鼠免疫：用Cr-ITCBE-cBSA免疫6-8周齡雌性Balb/C小鼠5只，劑量為60μg/只，體積為0.2mL。首免用PBS稀釋的免疫原與等體積FCA完全乳化，以后每隔4w加強免疫一次，換用FIA乳化。免疫5次后7d斷尾采血分離血清，用間接ELISA和間接競爭ELISA(ciELISA)篩選效價高，阻斷效果好的小鼠作為融合備用鼠。融合前3d超免小鼠，尾靜脈和腹腔各注射50μg免疫原，體積均為100μL。

(2)細胞融合：融合前4-5d用含有8-氮鳥嘌呤的完全培養基(含15％FBS的RPMI-1640)傳代培養NS0細胞；前1d用HAT培養滋養細胞；融合時眶下竇采血，脫頸致死小鼠。無菌取脾臟制備脾細胞，在PEG-1500作用下與NS0細胞融合(細胞數量比約為10：1)，將融合后的細胞懸液加入到已鋪有滋養細胞的96孔細胞板中，HAT培養。

(3)單克隆細胞株的篩選：融合后10-14d用間接ELISA和ciELISA篩選強陽性、抑制率高、生長狀態好的雜交瘤細胞株，用有限稀釋法進行3次亞克隆。然后用鉻離子準品溶液篩選靈敏度高、特異性強的單克隆源細胞株，共取得得4株。其中，C7D3細胞株細胞株靈敏度最高，特異性最強，

(4)單克隆抗體的制備：將C7D3細胞株轉移到24孔細胞板及50mL細胞瓶中擴大培養。篩選的雜交瘤細胞濃度達到約10⁷/mL時，向10d前經液體石蠟處理過的經產母鼠腹腔內注射單克隆細胞10⁸/只。10-12d后抽取腹水，飽和硫酸胺法純化抗鉻離子特異性單克隆抗體。

實施例3

間接ELISA測定鉻離子抗體效價

第一步，用pH 9.6的0.05mol/L碳酸鹽緩沖液稀釋的Cr-ITCBE-cOVA包被原包板，包被濃度2μg/mL，包被量每孔100μL，37℃溫育2h，PBST洗板4次，每次間隔3min；第二步，用5％豬陰性血清封閉，每孔280μL，37℃溫育1h，PBST洗板4次，每次間隔3min；第三步，加鉻離子多克隆或單克隆抗體，每孔50μL，用封閉液倍比稀釋，設陰性對照(negative control，NC)和空白對照(blank control，BC)，37℃溫育15min，PBST洗板4次，每次間隔3min；第四步，加GaMIgG-HRP，1:1000倍稀釋，每孔50μL，37℃溫育25min，PBST洗板4次，每次間隔3min；第五步，加酶底物TMB顯色液，每孔60μL，室溫反應5-10min；第六步，終止顯色反應，每孔加入終止液2mol/L H₂SO₄100μL，用酶標儀讀A_450nm值；第七步，結果判斷，以待測孔A_450nm≥NCA_450nm的2.1倍(P/N≥2.1)時，判為陽性，以最大稀釋倍數計算抗體效價。

實施例4

抗體特異性結果鑒定

用C7D3細胞株制備的抗鉻離子單克隆抗體建立dELISA標準曲線，采用交叉反應試驗鑒定其特異性。交叉反應試驗選擇鎘、鉛、汞、鋅、鈷、鉬、銅與EDTA的鰲合物溶液作為抑制劑，其標準鰲合物溶液配制方法如下：用10mmol/LHEPES緩沖液配制成EDTA溶液，將上述重金屬離子標準儲備液稀釋成0、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28、2.56、5.12、10.24、20.48、40.96、81.92、163.84μg/L，兩者混勻后用NaHCO₃調節pH值為6.0，室溫搖床反應24小時，即形成重金屬離子-EDTA鰲合物溶液。抗體特異性以交叉反應率(CR)表示，計算公式是：CR％＝Cr³⁺-EDTA的IC₅₀/其他競爭物IC₅₀×100，CR越低，抗體特異性越強，其實驗結果見表一。表一可知，Cr³⁺-EDTA與其mAb的結合反應有很強的特異性，與EDTA及其它重金屬離子鰲合物基本無交叉反應。

表1 Cr³⁺-EDTAmAb與其它重金屬離子鰲合劑的交叉反應

實施例5

Cr-ITCBE-HRP酶標半抗原的合成

(1)稱取10mg ITCBE溶于1mL二甲基亞砜(DMSO)中形成金屬鰲合劑溶液；稱取16.1mg氯化鉻(CrCl₃.6H₂O)溶于1mL pH 8.0的HEPES緩沖液(10mmol/L)中形成Cr³⁺溶液；將金屬鰲合劑溶液和Cr³⁺溶液混合，并用NaOH調節pH值至7.0，然后在室溫條件下放在搖床上反應12小時，即形成Cr-ITCBE鰲合物半抗原。

(2)稱取100mg HRP溶于1mLpH 8.0的HEPES緩沖液(10mmol/L)中形成100mg/mL的HRP辣根過氧化物酶溶液；取1mL Cr-ITCBE鰲合物半抗原溶液加入到1mL辣根過氧化物酶溶液中并用NaOH調節pH值至9.0，室溫搖床反應24小時，反應結束后將反應液裝入透析袋，先用蒸餾水透析2d，再用PBS透析3d，即形成Cr-ITCBE-HRP酶標半抗原。

實施例6

直接競爭ELISA(dELISA)檢測步驟

第一步，采用棋盤法優化羊抗鼠二抗(GaMIgG)包被濃度為10μg/孔，包被量每孔100μL，37℃溫育2h，PBST洗板3次，每次間隔2min；第二步，用5％豬陰性血清封閉，每孔280μL，37℃溫育1h，PBST洗板3次，每次間隔2min；第三步，依據效價添加稀釋后的抗鉻離子單克隆抗體、樣品或倍比稀釋的標準品、酶標半抗原，三者混勻后，37℃溫育25min，PBST洗板3次，每次間隔2min，反應設NC和BC；第四步，加酶底物TMB顯色液，每孔60μL，室溫反應5min；第五步，終止顯色反應，每孔加入終止液2mol/L H₂SO₄100μL，用酶標儀讀A_450nm值。

實施例7

間接競爭ELISA(ciELISA)檢測步驟

第一步，用pH 9.6的0.05mol/L碳酸鹽緩沖液稀釋的Cr-ITCBE-cOVA包被原包板，包被濃度2μg/mL，包被量每孔100μL，37℃溫育2h，PBST洗板4次，每次間隔3min；第二步，用5％豬陰性血清封閉，每孔280μL，37℃溫育1h，PBST洗板4次，每次間隔3min；第三步，添加標準品：酶標板先以50uL封閉液鋪底，然后第1孔加入500μg/L的Cr³⁺-EDTA鰲合物標準品溶液，并向后進行倍比稀釋，反應設NC和BC；第四步，依據間接ELISA抗體效價，添加封閉液稀釋后的抗鉻離子pAb，或mAb，每孔50μL，37℃溫育15min，PBST洗板4次，每次間隔3min；第五步，加GaMIgG-HRP，用封閉液1:1000倍稀釋，每孔50μL，37℃溫育25min，PBST洗板4次，每次間隔3min；第六步，加酶底物TMB顯色液，每孔60μL，室溫反應5-10min；第七步，終止顯色反應，每孔加入終止液2mol/LH₂SO₄100μL，用酶標儀讀A_450nm值。

實施例8

實施例6中dELISA和實施例7中ciELISA檢測性能的比較

用C7D3細胞株制備的抗鉻離子單克隆抗體建立ELISA檢測方法，并進行dELISA和ciELISA檢測性能的比較。以抑制率B/B₀(％)為縱坐標(B₀為Cr³⁺-EDTA為0濃度時的吸光度值，B為Cr³⁺-EDTA不同濃度時的吸光度值)，以不同濃度的Cr³⁺-EDTA標準品為橫坐標，繪制標準曲線，根據曲線趨勢推導回歸方程，進行相關分析。靈敏度以半數抑制濃度(IC₅₀值)表示；定量檢測限(IC₂₀–IC₈₀)代表標準品對最大信號強度(B₀)的抑制范圍；檢測限以IC₁₅表示，其結果見圖2。

dELISA標準曲線的回歸方程式為y＝－7.457Ln(x)+58.389(R²＝0.9309)，IC₅₀值為0.96μg/L；ciELISA標準曲線的回歸方程式為y＝－5.922Ln(x)+55.371(R²＝0.9612)，IC₅₀值為1.14μg/L。根據公式計算出dELISA標準曲線在PBS中對Cr³⁺-EDTA的線性檢測范圍為0.14～35μg/L，檢測限(LOD)為0.09μg/L；ciELISA標準曲線在PBS中對Cr³⁺-EDTA的線性檢測范圍為0.18～41μg/L，LOD為0.11μg/L。

實施例9

環境水樣中鉻離子污染檢測dELISA試劑盒的操作步驟

第一步，將所需試劑從冷藏環境中取出，置于室溫(20～25℃)平衡30min，注意每種液體試劑使用前均須搖勻；第二步，用吸管采集水樣0.5mL于離心管中，再加入0.4mL樣品稀釋液，混勻后加入EDTA處理液0.1mL；第三步，將樣品處理液50μL加入酶標板微孔條中，同時加入稀釋后的抗鉻離子單克隆抗體50μL、稀釋后的酶標半抗原50μL，混勻靜置25min后洗板，注意檢測設三個重復，并設置NC和BC對照；第四步，加底物顯色液A液和B液各30μL，靜置5min后洗板；第五步，加入H₂SO₄終止液100μL，靜置5min后酶標儀讀取吸光度值；第六步，將吸光度值代入dELISA標準曲線的回歸方程公式，計算得到水樣中鉻離子含量。

以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。