復合液體池的制作方法

專利名稱：復合液體池的制作方法
復合液體池
相關申請的交叉引用 本申請要求于2010年7月22日提交的美國臨時申請順序號61/344，434,2011年4月I日提交的61/470，515和2011年4月I日提交的61/470，520的權益，所述申請各自通過引用結合到本文中。
背景 目前對生化樣品的處理有許多關鍵性缺陷。這些包括體積大小一導致高的試劑成本；高的消耗成本；和勞動強度高的方案和過程，這些非常容易交叉污染。因為這些原因，目前無法保證在生化過程中對每個樣品的完全控制和隔離。
對于多個生化過程的應用一序列珠制備、焦磷酸測序、核酸連接和聚合酶鏈式反應一和不限于此，體積大小、化學成本、勞動力成本和反應效率的局限是明顯的。
序列珠制備是在應用-特定的化學中將小珠包被的過程。例如在DNA復制中，珠子先用DNA引物包被，然后是擴增過程。甚至對于今天的現有技術的測序儀而言，需要相對高的局部濃度的靶分子，以準確測序。目前對典型方案的評價估計，僅80%經處理的珠子被充分包被，以確保準確測序。因此為了確保相對高濃度的靶樣品，必須使用大量珠子，以達到統計學準確性。此外，均勻包被的(even coated)珠子從一個孔向另一個轉移,都不可避免地導致珠子和懸浮流體的損失。這是目前移液和液體處理系統中固有的死體積和無效性的結果。該生化過程通常是在96孔或384孔靜態孔板中進行，其通常的體積范圍為10微升至200微升。
另一生化過程，焦磷酸測序，將相當高濃度的核酸與引物-包被的珠混合。核酸附著在珠子上并形成純系群體(clonal colony) 0然后再用基于乳液的PCR將其擴增。測序儀器含有大量皮升-體積的孔，這對于單個珠子連同測序所需的相關酶而言足夠大。焦磷酸測序使用螢光素酶來發光作為讀出(readout)，并且測序儀器對于每個添加的核苷酸都為孔拍照。該過程中的一個關鍵問題是珠子被引物有效包被。使用現有技術，一定百分比的珠子并未被引物化學適當地包被，導致較差的反應效率。使用目前的技術來改進珠子的包被效率，將需要試劑成本的不可持續的增加。
在核酸連接中，也出現類似的生化過程的問題。核酸連接在現代分子生物學研究中已經成為重要工具，用于產生重組核酸序列。例如，將核酸連接酶與限制酶一起使用，將核酸片段，通常是基因，插入到質粒中，用于遺傳工程。核酸連接是分子生物學中相對常用的技術，其中可通過一種稱為連接酶的酶的作用，在特定溫度通常16 - 25。C(取決于所用的方案)下，將短鏈DNA連接在一起。為了將兩條以上的短DNA鏈序列連接在一起，例如在合成遺傳序列的構建中，可以將所有DNA鏈混合，再進行連接。這將會產生隨機序列，其中一條鏈的末端將與錯誤鏈的起始端連接。這種錯誤序列，或方向，在合成構建的基因(其中遺傳密碼的順序至關重要)中是不想要的。為了正確進行該技術，必須先將相鄰序列的配對組合連接起來，以得到正確方向。再將這些配對合成的構建體以正確方向連接，得到甚至更長的合成構建體。該過程涉及大量而復雜的化學過程和操作。這是非常耗費人力的過程，如果用現有的液體處理，并且導致大的消耗成本，還要遭受靜態孔板和移液管吸取的已知的死體積損失。另外，使用現有的液體處理技術，小體積的混合和控制受限于相對小體積的吸取和操作的能力。核酸連接中所用的典型體積是10 - 200微升，且核酸鏈長介于50-200個堿基對。聚合酶鏈式反應(PCR)已廣泛用于擴增目標DNA和cDNA，用于分子生物學的多種應用。PCR技術擴增單一拷貝或少數拷貝的一段DNA，得到數千至數十億拷貝的特定DNA序列。現代PCR儀器進行PCR過程的反應體積范圍為10 - 200微升。在小體積中進行PCR的最大障礙之一是難以用手工移液管來操作小體積的組成試劑。大的體積量是現有技術在分配和混合亞納升體積中性能不佳的直接結果。此外，對于基于流動系統的下一代微流體技術而言，這些依然受限于所分配的起始體積與生化過程所需的實際樣品量。這些微流體系統在生化過程期間也受限于確定的樣品方案控制。這些系統通常依賴于微量規模的流體通道網絡，以轉運和混合亞微升體積。這些技術的一些主要缺陷在于:微流體卡(miciOfluidiccard)的單次使用，為了防止污染；缺乏對各單個樣品的動態控制，在生化過程的任意點轉運和混合任何單個樣品；和系統的密閉結構。具體地講，數字聚合酶鏈式反應(DigitalPolymerase Chain Reaction, dPCR)的現有方法是這樣進行的:通過將起始樣品分為多個更小體積的樣品，直到每個亞體積中只留下一個DNA模板。對含有DNA的陽性亞體積進行計數，就可求出原體積中的起始拷貝數。通常，這包括多個系列稀釋步驟，得到在每份反應體積中具有在統計學上的一個DNA靶的樣品體積。在統計學上，可測試總體積的一個亞組，以測定起始拷貝數，從而允許減少PCR反應總數。然而對于稀有靶標檢測，需要測試更大的體積亞組，以提高統計學準確性。這導致更大數量的空白體積和更大的測試體積，導致使用更多的化學品、時間、儀器、樣品處理和處理步驟。dPCR的另一方法是在油基載體中產生測試體積的乳液。該方法試圖減少為得到結果所需的儀器數量和為得到結果所需要的時間。首先，將靶樣品在載體油中稀釋并乳化成足夠小的體積，其統計學分布是每一滴小于一個拷貝。然后還可將這種較大體積作為單一樣品體積來處理并使用PCR方案進行加工處理。然而該方法通常限制在終點檢測。需要流式細胞儀形式的更多儀器，從而能夠測定流過傳感器的每一液滴中靶的存在情況。流式細胞儀是低速；昂貴的；可需要特定流體介質并且僅允許終點檢測。終點檢測的限制包括需要后續處理步驟；較低靈敏度；更長時間才能得到結果；特異性和更多的儀器。基于乳液的PCR方法的另一個挑戰是所需穩定性和對每一滴的控制。液滴的合并或碎裂給處理過程帶來更多的統計誤差。現今的移液和液體處理系統不能處理100%的給定起始體積。對于移液，液體儲存系統(靜態孔板)和系統內的機械致動都能阻礙對樣品的完全吸取。這種損失或在靜態板中的死體積是由表面潤濕性質和幾何學所致，兩者均是現有技術無法解決的。在流動系統中，在生化過程期間或結束時對單個生物樣品的收集，對于現有技術證明是非常具有挑戰性的。典型的連續流動系統由泵和貯器組成，這通常使得容易的臨界流體的取回(尤其是在微量規模上)，變得技術上困難的。另外，在流動系統內，系統的最初啟動是耗時而昂貴的，并且如果做得不正確，就會導致災難性的測試失敗，需要重新測試生物樣品。現有生化過程的另一個缺陷就是對于納升和亞納升體積不能自動化地進行生化過程。各單個樣品的轉運、混合或取回不能通過現有自動化技術來進行。在更一般的化學處理例如需要操作少量流體的普通微量化學中，可以清楚地看到現有技術在廢流體體積殘留在靜態孔板或系統之中的局限。這是現有技術缺乏分配和控制今后復雜的分子生物學技術所需的更小體積的能力的結果，并且需要改進效率。因此，本發明涉及提供改進的樣品處理，以克服以上問題的至少一些。概述
公開了制造和處理復合液體池(composite liquid cell)的裝置、系統和方法。附圖簡述


圖1A和圖1B示意性地說明使用靜電力的復合液體池的產生。圖2A和圖2B示意性地說明使用疏水作用的復合液體池的產生。圖3A和圖3B示意性地說明使用定向空氣控制的復合液體池的產生。圖4A-4F示意性地說明使用控制管和可變流向的復合液體池的產生；
圖5示意性地說明使用靜電力的復合液體池的控制。圖6A-6C示意性地說明使用疏水作用的復合液體池的控制。圖7示意性地說明使用定向空氣控制的復合液體池的控制。圖8示意性地說明錨定復合液體池的靜態控制突出物(spur)。圖9A和圖9B示意性地說明使用靜電力的沿靜態疏水性控制表面的生化連續流動處理的轉運機制。圖10A-10F示意性地說明使用控制管和可變流向的本發明的多樣品復合液體池的產生。圖11A-11C示意性地說明使用靜電力的多樣品復合液體池的產生。圖12A和圖12B是照片，顯示多樣品復合液體池。圖13A-13C示意性地說明使用表面張力的多樣品復合液體池的產生。圖14A和圖14B示意性地說明使用機械攪拌的多樣品復合液體池的產生。圖15A和圖15B是基于乳液的多樣品復合液體池的照片。圖16是具有多個內部樣品靶的多樣品復合液體池的照片。圖17A和圖17B示意性地說明使用定向空氣控制的多樣品復合池的產生。圖18A-18C示意性地說明使用疏水作用的多樣品復合液體池的控制。圖19A和圖19B示意性地說明使用具有穩定部件(feature)的疏水性控制表面的多樣品復合池轉運。圖20示意性地說明使用靜電力的多樣品復合液體池的控制。圖21示意性地說明使用定向空氣控制的多樣品復合液體池的控制。圖22示意性地說明錨定多樣品復合液體池的靜態控制突出物。圖23是帶有中央控制體積(用于排列復合液體池的原始樣品)的多樣品復合液體池的照片。圖24A-24D示意性地說明復合液體池的單元疏水性穩定部件。圖25A-2 示意性地說明復合液體池的多種不同疏水性穩定部件形狀。圖26示意性地說明單個復合液體池的2個疏水性穩定部件。圖27A-27B示意性地說明使用控制管和可變流向，復合液體池在沿著具有穩定部件的疏水性桿(spar)的離散的位置上的定位。圖28示意性地說明一系列疏水性穩定部件。圖29示意性地說明使用具有穩定部件的疏水性控制表面，復合液體池的轉運機制。圖30A和圖30B示意性地說明使用疏水性穩定部件，一系列復合液體池的轉運機制。圖31是說明單個復合液體池網絡的圖示。圖32A-32F是說明復合流體網絡內的復合液體池的轉運方法的圖示。圖33A-33E是說明復合流體網絡內的復合液體池的混合過程的圖示。圖34A和34B是顯示復合流體網絡內的2個復合液體池的合并的照片。圖35A-35C是顯示復合流體網絡內的2個復合液體池合并以產生多樣品復合液體池的照片。圖36A-36E示意性地說明復合流體網絡內的復合液體池的混合過程，以產生多樣品復合液體池。圖37A-37C示意性地說明以2個階段合并4個復合液體池的復合流體網絡。圖38A-38G示意性地說明以5個階段合并32個復合液體池的復合流體網絡。圖39示意性地說明等溫核酸擴增的復合液體池儀器。圖40示意性地說明盤狀疏水性平臺上的一系列穩定部件。圖40A顯示示例性的使用盤狀平臺的系統。圖41A-41D是說明復合流體網絡產生的圖示。圖42A-42D是說明疏水性控制表面的圖示，用于不混溶的緩沖封裝流體路徑控制(immiscible buffer encapsulating fluid path control)。圖43-47說明可作為控制器編程來執行的多種方法。詳述
本發明在一些實施方案中提供用于在不混溶的流體池中和位于互不混溶載體流體的自由表面上產生生物樣品的系統和方法。這包括在這樣的復合液體池(同義詞為“復合流體池”)內和位于不混溶的載體流體上產生、和/或位置控制、和/或運動控制、和/或混合、和/或處理生物樣品。生物樣品密度通常介于載體流體和復合液體池的外部流體的密度之間。載體流體的密度通常高于復合液體池的外部流體的密度。所涉及流體的典型密度值范圍:載體流體為1，300至2，000 kg/m3,不混溶的流體池為700至990 kg/m3,生物樣品為900至1200 kg/m3。這樣一組操作液體和密度的實例在本文中有概述但不限于此；載體流體是Fluorinert FC-40 (氟代烴油(fIuorocarbonatedoil))，密度大約1，900 kg/m3 ;復合液體池的外部流體是苯甲基聚硅氧烷(硅油)，密度大約920 kg/m3 ;生物樣品是PCR試劑的水性基溶液，密度大約1000 kg/m3。在另一個實施方案中，載體流體是全氟化胺油(perfluorinated amine oil)。在另一個實施方案中，所述封裝流體(encapsulating fluid)是基于苯甲基聚娃氧烷的油和聚山梨酯添加劑的溶液。所述添加劑的親水性-親脂性平衡數值范圍為2-8。添加劑的組合總親水性-親脂性平衡數值范圍為2-8。聚山梨酯添加劑的實例是司盤80、司盤65和吐溫20，但不限于此。緩沖封裝流體內的這些添加劑的范圍介于0.001%和10%之間。在另一個實施方案中，靶樣品是在水性介質中的固體顆粒懸液，封裝流體是基于苯甲基聚硅氧烷的油，在為基于氟代烴的油的載體流體上。在另一個實施方案中，靶樣品是基于苯甲基聚硅氧烷的油中的水性介質，封裝流體是基于苯甲基聚硅氧烷的油，在為基于氟代烴的油的載體流體上。在一些實施方案中,控制表面是疏水性材料。用于制造和操作復合液體池的系統通常包括處于控制器(例如可編程的計算機)控制之下的液體處理系統。通常對控制器編程，以使液體處理系統進行各種步驟，其程序步驟儲存在非暫時的計算機可讀的介質中。產牛復合液體池
參考圖1A，使用控制表面4，可混合位于互不混溶的載體流體3的自由表面上的生物樣品I和互不混溶的流體池2。在一個實施方案中，控制表面4使用靜電力來控制不混溶的流體池2的位置。控制表面被充電并使之密切接近不混溶的流體池，就會發生電荷分離。例如將高度正電荷給予控制表面，不混溶的流體池內帶負電荷的離子將向帶電體分離。結果是兩極電荷分離并且引力朝向帶電體。參考圖1B，產生復合液體池5。在另一個實施方案中，參考圖2A，使用控制表面23，可混合位于互不混溶載體流體22的自由表面上的生物樣品21和互不混溶的流體池20。控制表面23利用疏水作用來控制不混溶的流體池20的位置。疏水性表面排斥水性基介質，但硅基油容易潤濕表面，允許使用毛細管張力控制。使控制表面23接觸不混溶的流體池20將會導致主體表面被不混溶的流體池20潤濕。然后，可通過平移控制表面23將流體池轉運到載體流體22上的位置。參考圖2B，產生復合池24。在另一個實施方案中，參考圖3A，使用定向控制管33，可混合位于互不混溶載體流體32的自由表面上的生物樣品31和互不混溶的流體池30。定向控制管33提供空氣噴射，其當定向碰撞不混溶的流體池30時產生大于平移阻力的曳力，因而以受控方式轉運池流體。參考圖3B，產生復合液體池34。在另一個實施方案中，參考圖4A,使用所不的方法和系統,可產生復合液體池。參考圖4A，孔板41在一個或多個位置(B1、B2、B3)含有生物樣品42并覆蓋有不混溶的流體43。控制管44具有跨該管的可控壓力。在這種操作模式中，管內保持持續壓降，因而將不混溶的流體43吸入管內，當將管平移而接觸不混溶的流體43時。不混溶的流體43的體積被吸入管內。參考圖4B，控制管44轉到生物樣品41并吸取一定體積的生物樣品Cl。參考圖4C，控制管回到不混溶的流體層，吸取一定體積的不混溶流體。在此之后，控制管退出流體覆蓋物并取回空氣，然后在同一生物樣品位置或新的生物樣品位置重復該程序。參考圖4D，控制管中裝載生物樣品Cl、C2、C3、不混溶的流體以及分隔不混溶的流體和生物樣品的空氣間隙45。參考圖4E，控制管位于容納在生物相容的容器47中的載體油層46之上。控制管可接觸載體油46的自由表面或位于在其上O - 3mm。在控制管和不混溶的流體中顛倒流動方向，將樣品和不混溶的流體沉積在載體油的自由表面上，產生復合液體池。參考圖4F，一旦沉積完整復合液體池48，控制管平移到新位置，以沉積下一個復合液體池。轉運復合液體池 在另一個實施方案中，參考圖5，使用控制表面53，在不混溶的載體流體52上轉運復合液體池51。控制表面53使用靜電力來控制復合液體池52的位置。控制表面被充電并使之密切接近復合液體池的外部流體，就會發生電荷分離。例如將高度正電荷給予控制表面，不混溶的流體池內帶負電荷的離子將向帶電體分離。結果是兩極電荷分離并且引力朝向帶電體。使用該轉運動作，可合并一個或多個復合液體池或可將額外生物樣品添加到復合液體池。在另一個實施方案中，參考圖6A，使用控制表面63，可轉運位于互不混溶載體流體62的自由表面上的復合液體池61。控制表面63使用疏水作用來控制復合液體池61的位置。疏水性表面排斥水性基介質，但硅基油容易潤濕表面，允許使用毛細管張力控制。使控制表面63接觸復合液體池61將會導致該主體表面被復合液體池61的外部流體潤濕。然后可通過平移控制表面63將復合液體池轉運到載體流體62上的位置。使用該轉運動作，可合并一個或多個復合液體池或可將額外生物樣品添加到復合液體池。在另一個實施方案中，參考圖7，使用定向控制管73，可對位于不混溶的載體流體72上的復合液體池71進行位置控制。定向控制管73提供空氣噴射，其當定向碰撞復合液體池71時產生大于平移阻力的曳力，因而以受控方式轉運池流體。使用該轉運動作，可合并一個或多個復合液體池或可將額外生物樣品添加到復合液體池。在另一個實施方案中，參考圖8A，使用連接到基底84上的疏水性突出物83，可臨時錨定位于不混溶的載體流體82上的復合液體池81。使用該轉運動作，可合并一個或多個復合液體池或可將額外生物樣品添加到復合液體池。在另一個實施方案中，使用靜電力和疏水作用的組合，可移動復合液體池。參考圖9A和9B，將復合液體池91定位在不混溶的載體流體92上，并接觸疏水性軌道(hydrophobic track) 93而放置。動態控制表面94使用流體靜力將復合液體池沿限定的疏水性軌道移動。控制表面94也可用于將復合液體池與疏水性桿分開并獨立移動復合液體池或移至另一疏水性位置。使用該轉運動作，可合并一個或多個復合液體池或可將額外生物樣品添加到復合液體池。在另一個實施方案中，疏水性桿部分淹沒在載體流體中。在另一個實施方案中，有多個控制表面，允許離散的復合液體池的獨立動作。在另一個實施方案中，轉運動作是使用疏水作用的動態控制的組合。將復合液體池定位在不混溶的載體流體上并接觸疏水性軌道放置。使用疏水作用的動態控制表面將復合液體池沿限定的疏水性軌道移動。控制表面也可用于將復合液體池與疏水性桿分開并獨立移動復合液體池或移至另一疏水性位置。使用該轉運動作，可合并一個或多個復合液體池或可將額外生物樣品添加到復合液體池。在另一個實施方案中，載體流體是連續流動流體并隨其所得動量將復合液體池沿其流線轉運。在另一個實施方案中，靜態疏水性表面有助于載體流體動量，其中復合液體池可沿該表面前進。在另一個實施方案中，動態疏水性表面有助于載體流體動量，復合液體池可藉此而被轉運。除非另有說明，否則本文所公開的任何內容一般而言涉及復合液體池，特別也可適用于多樣品復合液體池。產生具有多樣品的復合液體池 在一個實施方案中，參考圖10A-10F,可用所不方法和系統產生復合液體池。參考圖10A，孔板41在一個或多個位置(B101、B102、B103)含有生物樣品42并覆蓋有不混溶的流體43。控制管44具有跨該管的可控壓力。在這種操作模式中，管內保持持續壓降，因而將不混溶的流體43吸入控制管44內，當控制管44轉而接觸不混溶的流體43時。不混溶的流體43的體積被吸入管內。參考圖10B，控制管44轉到生物樣品41并吸取一定體積的生物樣品C101。參考圖10C，控制管回到不混溶的流體層，吸取一定體積的不混溶的流體。在此之后，控制管在同一生物樣品上重復該程序或平移但仍在流體覆蓋物內，然后在新生物樣品位置上重復該程序。對于多樣品復合液體池，在吸取不混溶的流體和生物樣品之后，控制管然后從不混溶的油退出并取回空氣，然后對新復合液體池重復該程序。參考圖10D，控制管中裝載生物樣品C101、C102、C103和不混溶的流體，用于多樣品復合液體池。參考圖10E，控制管位于容納在生物相容的容器47中的載體油層46之上。控制管可接觸載體油46的自由表面或位于其上O - 3_。在控制管和不混溶的流體中顛倒流動方向，將樣品和不混溶的流體沉積在載體油的自由表面上，產生多樣品復合液體池。參考圖10F，一旦沉積完整復合液體池48，控制管平移到新位置，以沉積下一個多樣品復合液體池。參考圖1IA-11C，可使用控制表面204，混合位于互不混溶載體流體203的自由表面上的一個或多個位置(S1、S2)的生物樣品201和一個或多個位置(01、02)的互不混溶的流體池202。控制表面204使用靜電力來控制不混溶的流體池202的位置。控制表面被充電并使之密切接近不混溶的流體池202，就會發生電荷分離。例如將高度正電荷給予控制表面204，不混溶的流體池202內帶負電荷的離子將向帶電體而分離。結果是兩極電荷分離并且引力朝向帶電體。參考圖11B，在一個或多個位置(D1、D2)產生復合液體池205。控制表面204使用靜電力來控制復合液體池205的位置。參考圖11C，通過合并兩個或更多個復合液體池產生多樣品復合液體池206。圖12A和12B是顯示由此法而得到的多樣品復合液體池的圖。在該實例中，產生了復合液體池，其包含含2%綠色染料的2.5微升體積的蒸餾水和含5%聚山梨酯添加劑-司盤80(v/v)的15微升的不混溶流體苯甲基聚硅氧烷-PD5油。用同樣試劑，但蒸餾水中用2%紅色染料替代綠色染料，產生第二復合液體池。圖中顏色可辨別為不同灰色陰影。使用疏水性表面(在這些圖像中可見的倒V形)合并2個復合液體池，并位于疏水性桿上的穩定部件內。在另一個實施方案中，參考圖13A-13C，使用管狀控制表面223的疏水作用，可合并控制管223內的生物樣品220和位于互不混溶載體流體222的自由表面上的互不混溶的流體池221。控制管223使用疏水作用來控制不混溶的流體池221的位置。疏水性表面排斥水性基介質，但硅基油容易潤濕表面，允許使用毛細管張力控制。參考圖13B，通過使控制管223接觸不混溶的流體池221將會導致該主體表面被不混溶的流體池221潤濕。然后可釋放生物樣品220，以接觸載體流體222上的不混溶的流體池221。如圖13B所示，產生復合液體池224。參考圖13C，通過用另一生物樣品體積來重復該程序，產生多樣品復合液體池 225。在另一個實施方案中，參考圖14A和14B,使用超聲表面235,可細分位于互不混溶載體流體232的自由表面上的互不混溶的流體池231內的生物樣品230。參考圖14B，產生多樣品復合液體池236。
圖15A和圖15B是顯示像圖14B的池236的多樣品復合液體池的圖。在該實例中，將100微升體積的蒸餾水在500微升不混溶的流體池中渦旋，所述流體池由基于苯甲基聚硅氧烷的油-PD5和5%聚山梨酯添加劑-司盤80 (v/v)組成。圖15B使用含2%綠色染料的蒸餾水，用于生物樣品。圖15A和圖15B是20微升代表性的樣品。在另一個實施方案中，產生具有多個不同樣品靶的多個樣品的復合液體池。參考圖16，將4個不同樣品靶乳化并一起穩定混合為具有多個內部樣品靶的單個多樣品復合液體池。用含綠色染料2%、藍色染料2%、黃色染料5%和無染料的10微升蒸餾水在由基于苯甲基聚硅氧烷的油-PD5和5%聚山梨酯添加劑-司盤80 (v/v)組成的500微升不混溶的流體池中，產生4個單獨的復合液體池。乳化之后，合并復合液體池，參見圖16。根據圖16，明顯的是，無染料的水樣品未被染色水樣品污染，表明多樣品復合液體池內的樣品之間沒有轉移。不同顏色可辨別為不同灰色陰影。在另一個實施方案中，參考圖17A和17B，使用定向控制管243，合并位于互不混溶載體流體242的自由表面上的互不混溶的流體池240和兩種或更多種生物樣品241。定向控制管243提供空氣噴射，其當定向碰撞樣品241時產生大于平移阻力的曳力，因而以受控方式轉運緩沖流體240和樣品241。參考圖17B，產生所得的多樣品復合液體池244。轉運具有多個樣品的復合液體池
轉運復合液體池的所有通用方法，例如以上討論的那些，也都適用于多樣品復合液體池。參考圖18A-18C，以及關于6A-6C所解釋的，使用具有疏水性控制表面263的裝置，可轉運位于互不混溶載體流體262的自由表面上的多樣品復合液體池261。在另一個實施方案中，控制表面部分淹沒在載體流體中。參考圖19A和19B，位于不混溶的載體293的自由表面上的多樣品復合液體池290被限制在2個疏水性桿291之間。疏水性桿291在其內部具有穩定部件292。如圖19A所示，這些部件用于控制復合液體池內的樣品，如圖19B所示，疏水性桿可沿載體流體293移動，穩定轉運多樣品復合液體池290。在另一個實施方案中，參考圖20并且關于圖5所解釋的，通過裝置控制表面253，使用靜電力，將多樣品復合液體池251在不混溶的載體流體252上轉運。在另一個實施方案中，參考圖21并且關于圖7所解釋的，使用提供空氣噴射的定向控制管273，可對位于不混溶的載體流體272上的復合液體池271進行位置控制。在另一個實施方案中，參考圖22并且關于圖8所解釋的，使用連接到基底284上的疏水性突出物283，可臨時錨定位于不混溶的載體流體282上的多樣品復合液體池281。對于復合液體池的多個樣品體積的內部控制
在一個實施方案中，可排列多樣品復合液體池的內部樣品體積，用于2D分析。參考圖23，可將大樣品體積加入復合液體池并位于中間，導致原始復合液體池樣品排列成環形，用于分析。將含2%綠色染料的100微升體積的蒸餾水在500微升不混溶的流體池中渦旋，所述流體池由基于苯甲基聚硅氧烷的油-PD5和5%聚山梨酯添加劑-司盤80(v/v)組成。分割20微升代表性的樣品，將大的未染色水樣品，約10微升移液至復合液體池中心。所得結構見圖23。在一個實施方案中，使用山梨酸酯添加劑，重組多樣品復合液體池的內部樣品。聚山梨酯添加劑的實例是司盤80和吐溫20但不限于此。緩沖封裝流體內的這些添加劑范圍介于0.001%和10%之間。用于穩定的機械部件
參考圖24A-24D，包含封裝在位于互不混溶載體流體313的自由表面上的不混溶的緩沖流體312中的靶樣品311的復合液體池穩定位于疏水性表面314。疏水性表面314位于互不混溶的載體流體313之上或之中。具有局部穩定部件315的疏水性表面314控制復合液體池的位置。穩定部件允許在復合液體池內和位于不混溶的載體流體上產生、和/或位置控制、和/或移動控制、和/或混合、和/或拆分、和/或處理生物樣品。參考圖24B，在一個實施方案中，包含封裝在位于互不混溶載體流體303的自由表面上的大約12微升的不混溶的緩沖液302中的大約1.7微升靶樣品301的復合液體池，穩定位于具有倒V形表面304的疏水性部件404。疏水性表面位于互不混溶的載體流體303之上或之中。具有局部穩定部件的疏水性裝置或部件304控制復合液體池的位置。在一個實施方案中，穩定部件是45度的V型切口(notch)，且面深度(face depth)為2.5mm，厚度為1.5_。這用于控制微升大小的復合液體池。參考圖24C，顯示了該實施方案的底部示意圖。參考圖24D，顯示了前述實施方案，其具有保留載體流體的環繞壁的外殼305。參考圖25A-25D，穩定部件具有為了給定應用而調整的若干參數。這些參數中有2個是部件形狀和部件厚度。部件形狀對內部樣品321的總體大小和位置控制有影響。參考圖25A，倒’V’形穩定部件324用所圖示的切點A & B控制內部樣品321位置。參考圖25B，曲線形穩定部件325對樣品內部位置的控制更少。形狀變化允許定制復合液體池內部樣品321與封裝緩沖流體322的比率。通常，圓形可達到更大的樣品體積與封裝流體比率并維持無污染樣品。參考圖25C，穩定部件的厚度C影響復合液體池的穩定，允許定制應用。對于更大厚度，通常大于50%的復合液體池直徑，穩定性不提高。對于靜態控制或處理復合液體池，5 - 50%的厚度范圍足夠穩定自由載體表面323上的復合液體池。穩定部件位于載體流體之上或之中。參考圖25D，穩定部件可以是錐形，用于在復合液體池內和位于不混溶的載體流體上的復合液體池產生、和/或位置控制、和/或移動控制、和/或混合、和/或拆分、和/或處理生物樣品。參考圖26，位于不混溶的載體流體332上的復合液體池331位于具有位置部件334的2個疏水性表面之間。穩定部件允許在復合液體池內和位于不混溶的載體流體上產生、和/或位置控制、和/或移動控制、和/或混合、和/或拆分、和/或處理生物樣品。參考圖28，可產生離散的復合液體池網絡。產生具有機械部件的復合液體池
可如前所述，例如圖4A-D，產生復合液體池。參考圖27A，控制管位于容納在生物相容的容器47中的載體油層46之上。控制管可接觸載體油46的自由表面或位于在其上O -3mm。在控制管和不混溶的流體中顛倒流動方向，將樣品和不混溶的流體沉積在載體油的自由表面上，在疏水性桿349上的穩定部件，產生復合液體池。參考圖27B，一旦沉積完整復合液體池48，控制管沿著疏水性桿349平移到新位置，以在穩定部件上沉積下一個復合液體池。在另一個實施方案中，具有穩定部件的兩個或更多個疏水性表面用于控制復合液體池位置。疏水性桿上的穩定部件的使用，允許在受控的和離散的位置上產生復合液體池，因此改善樣品跟蹤和/或自動化和/或過程控制。
轉運具有機械部件的復合液體池
在一些實施方案中，參考圖29，使用控制表面363，可轉運位于互不混溶載體流體362的自由表面上的復合液體池361。控制表面363使用疏水作用來控制復合液體池361的位置。疏水性表面排斥水性基介質，但硅基油容易潤濕表面，允許使用毛細管張力控制。使控制表面363接觸復合液體池361將會導致該主體表面被復合液體池361的外部流體潤濕。然后可通過平移控制表面363將復合液體池轉運到載體流體362上的位置。使用該轉運動作，可合并一個或多個復合液體池或可將額外生物樣品添加到復合液體池。在一些實施方案中，參考圖30A和圖30B，使用控制表面373，可轉運位于互不混溶載體流體372的自由表面上的一排復合液體池371。控制表面373使用疏水作用來控制復合液體池371的位置。疏水性表面排斥水性基介質，但硅基油容易潤濕表面，允許使用毛細管張力控制。控制表面373被不超過0.5倍樣品直徑分隔，以確保樣品位置受限。通過平移控制表面373，復合液體池排列371被轉運到載體流體372上的位置。對穩定部件使用該轉運動作，可單獨處理復合液體池，確保所有離散位置的樣品的準確度和/或參考穩定部件位置。該實施方案防止不受控的樣品合并和/或損失。復合液體池網絡
參考圖31，復合液體池網絡由至少2個穩定區381和連接區382組成。每個穩定區允許在復合液體池384內和位于不混溶的載體流體385上產生、和/或位置控制、和/或移動控制、和/或混合、和/或拆分、和/或處理生物樣品383。在一些實施方案中，參考圖32A-32F，復合液體池網絡用于轉運復合液體池。參考圖32A，載體油392上的復合液體池391位于具有穩定部件393的一組疏水性桿。參考圖32B，控制管394位于這樣的位置區或在這樣的位置區中，所述位置是復合液體池391被移向的位置。控制管394位于載體流體392的自由表面上并開始輸注不混溶的封裝緩沖流體395。參考圖32C，封裝流體395穿過網絡并與復合液體池391合并。控制管394被終止并顛倒其流動方向。參考圖32D，復合液體池從原始穩定部件位置移至新的指定位置。參考圖32E，當復合液體池在新位置時，控制管394中的流動被終止并移出。參考圖32F，復合液體池已轉運到新位置，用于處理。在另一個實施方案中，使用封裝緩沖流體的受控注射和取回，兩個或更多個復合液體池可同時轉運。在另一個實施方案中，參考圖33A-33E，復合流體網絡用于轉運和合并2個復合液體池。參考圖33A，載體流體402上的復合液體池401位于疏水性結構403內。參考圖33B，將不混溶的封裝緩沖流體404在控制位置405注射到載體流體402。參考圖33C，不混溶的封裝緩沖流體404穿過網絡并與復合液體池401合并。不混溶的封裝緩沖流體404的輸注被終止。參考圖33D，不混溶的封裝緩沖流體404從控制位置405取回，內部樣品從其原始位置移至新位置。參考圖33E，當樣品在新位置上時，在控制位置405的不混溶的封裝緩沖流體404流動被終止。樣品合并產生單個樣品復合液體池。復雜封裝油界面的形成(其周圍界限是控制表面、載體油和空氣界面)由自由表面能控制，所述自由表面能與封裝油/空氣界面的表面積成比例。封裝油的受控取出將致使系統將表面積減到最小，導致封裝油從網絡末端等量移出。這種界面從網絡末端的收縮也轉運其中所含有的水性液滴。圖34A是具有2個復合液體池的復合流體網絡圖。該圖中的復合液體池含有2.5微升樣品體積的蒸餾水，一份染紅的樣品和另一份染藍的樣品。封裝緩沖流體是在不混溶的氟代烴載體-FC40上的不混溶的流體苯甲基聚硅氧烷-PD5油。疏水性桿是基于PTFE的材料，其位于載體流體和空氣的界面上。穩定部件具有這樣的維度:最寬為大約2_，大約45度角。圖34B顯示具有單個內部樣品的單個復合液體池，這是先前2個復合液體池樣品體積經上述方法合并而來的結果。參考圖35A-35C和36A-36E，封裝流體具有添加劑，并且復合液體池的合并產生多樣品復合液體池。復合液體池網絡的實例在本文中概述，但不限于此；參考圖37A-37C，復合液體池網絡用于以2個階段將4個復合液體池合并。參考圖37B，在鄰近穩定部件的復合液體池首先合并。參考圖37C，合并其余復合液體池樣品，產生單個復合液體池。參考圖38A-38G，另一實例是以5個階段將32個復合液體池合并的網絡。參考圖38A，在復合液體池裝載之前的疏水性桿網絡和載體油。參考圖38B，復合液體池在復合流體網絡外部位置裝載。參考圖38C，使用不混溶的緩沖封裝流體的輸注/取回過程，合并在鄰近穩定部件的復合液體池。參考圖38D，復合液體池處理的第二階段，使用不混溶的緩沖封裝流體的輸注/取回過程，合并在鄰近穩定部件的復合液體池。復合液體池現在含有4個原先沉積的復合液體池。參考圖38E，復合液體池處理的第三階段，使用不混溶的緩沖封裝流體的輸注/取回過程，合并在鄰近穩定部件的復合液體池。復合液體池現在含有8個原先沉積的復合液體池。參考圖38F，復合液體池處理的第四階段，使用不混溶的緩沖封裝流體的輸注/取回過程，合并在鄰近穩定部件的復合液體池。復合液體池現在含有16個原先沉積的復合液體池。參考圖38G，復合液體池處理的第五階段，使用不混溶的緩沖封裝流體的輸注/取回過程，合并在鄰近穩定部件的復合液體池。復合液體池現在含有全部32個原先沉積的復合液體池。在每一階段，都可進行復合液體池的生物處理過程。這些過程可包括但不限于:聚合酶鏈式反應、和/或熱循環、和/或等溫擴增、和/或光學分析、和/或另外試劑的添加。在另一個實施方案中，參考圖41A-41D，使用輸注不混溶的封裝緩沖流體的方法，產生復合流體網絡。參考圖41A，靶樣品分配在載體流體上的疏水性桿網絡內。參考圖41B，不混溶的封裝緩沖流體輸注在載體流體上。參考圖41C，不混溶的封裝緩沖流體將樣品體積封裝在疏水性桿的穩定部件內。參考圖41D，顯示了復合流體網絡的一個實施方案。在另一個實施方案中，參考圖42A-42D，復合流體網絡具有疏水性控制表面，以控制載體流體上的不混溶的封裝緩沖流體網絡路徑。參考圖42A，復合流體網絡在不混溶的封裝緩沖流體內在離散的穩定部件中具有2個樣品。參考圖42B，疏水性控制表面用于剪切不混溶的封裝緩沖流體，同時維持載體流體路徑。參考圖42C，不混溶的封裝緩沖流體可被取回。參考圖42D，產生2個離散的復合液體池。該方法也用于通過復合流體網絡發展復合液體池和/或從其它過程中分離復合流體網絡內的復合液體池。處理復合液體池
在某些實施方案中，系統可包括在方法結束時實現靶樣品組合的以任何順序的一個或多個以下步驟:提取樣品用于靶；處理樣品，用于上樣到分配系統；分配靶樣品；分配不混溶的封裝流體池；分配載體流體；混合生物樣品和不混溶的封裝流體池；混合生物樣品和復合液體池；混合生物樣品和多樣品復合液體池；控制不混溶的封裝流體池的運動；控制載體流體的運動；轉運一個或多個不混溶的流體池；轉運一個或多個不混溶的流體池，以合并一種或多種生物樣品；轉運一個或多個復合液體池，以合并一種或多種生物樣品-M運一個或多個多樣品復合液體池，以合并一種或多種生物樣品；轉運一個或多個復合液體池，以合并一個或多個復合液體池；轉運一個或多個多樣品復合液體池，以合并一個或多個復合液體池；轉運一個或多個多樣品復合液體池，以合并一個或多個多樣品復合液體池；檢測復合液體池內的生物樣品的效應；檢測多樣品復合液體池內的生物樣品的效應；檢測多樣品復合液體池內的生物樣品的效應；將輸出信息提供給檢測使用者；分析輸出的檢測數據。生物方案的實例在緊接著的部分給出。PCR
聚合酶鏈式反應(PCR)已廣泛用于擴增目標DNA和cDNA，用于分子生物學的多種應用。PCR技術擴增單一拷貝或少數拷貝的一段DNA，產生數千至數十億拷貝的特定DNA序列。現代PCR儀器進行PCR過程的反應體積范圍為10 - 200微升。在小體積中進行PCR的最大障礙之一是難以用手動移液器來操作小體積的組成試劑。PCR的另一個障礙是允許生產量增加的多重反應的困難。本發明的方法通常包括合并必要流體以形成所得多樣品復合液體池。在一個實施方案中，靶樣品是水性生物樣品，其包含核酸擴增所需試劑，而外部流體池是含聚山梨酯添加劑(司盤80)的硅油(苯甲基聚硅氧烷，PD5)，在氟代烴基油(Fluorinert FC-40)的載體流體上。排列單個試劑，使得PCR的所有必要組分都位于單個復合液體池。這阻止了生物試劑的交叉污染。以正確順序將單個復合液體池組分合并在一起。再將單個復合液體池合并在一起，形成多樣品復合液體池。再將多樣品復合液體池轉運到不同熱區或光學檢測區(optical interrogation zone),在此通過突光測量而進行產物的定量測量。復合液體池內的PCR靶體積的配置防止在熱循環期間蒸發。通常熱循環溫度范圍介于55 - 95° C之間。在又一實施方案中，復合液體池可具有作為離散樣品添加的相關檢測標記。在又一實施方案中，可能需要PCR后的反應物的合并，用于進一步處理，其可包括基因測序。對于這些相對小的靶體積而言，多樣品復合液體池的使用極大地簡化了收集和測序程序。可將單獨處理之后的多樣品復合液體池選擇性地合并,從最終收集體積中除去任何非特異性擴增反應物或無效反應物。將由許多不同靶分子組成的合并的最終靶體積轉移至測序儀，進行詳細分析。當生物樣品被處理時，復合液體池促進了 100%的體積回收，并且無需接觸任何固體表面并且還具有抗潤濕特征的額外益處。另外，極大地減少了熱循環所需的流體體積一移除了靜態孔板全部物質和熱阻一靶向加熱策略有利于降低儀器功率和加快反應處理時間。
權利要求
1.一種樣品處理系統,其包括: 樣品液體輸入； 封裝液體輸入； 包括穩定部件的載體液體導管； 液體處理系統；和 與所述液體處理系統操作性連接的控制器； 其中對所述控制器編程，使所述液體處理系統: (1)從所述封裝液體輸入中吸取封裝液體； (2)將所吸封裝液體排出到(a)所述載體液體導管中的載體液體的自由表面上和(b)靠近所述穩定部件，所述封裝液體與所述載體液體不混溶，使得所排出封裝液體不與所述載體液體混合，漂浮在所述載體液體上面，并被所述穩定部件固定； (3)從所述樣品液體輸入中吸取樣品液體；和 (4)排出所吸樣品液體，所述樣品液體與所述封裝液體和與所述載體液體不混溶，使得所述樣品液體與所述封裝液體或與所述載體液體不混合。
2.權利要求1的系統，其中所述液體處理系統包括控制管和驅動器，并且對所述控制器編程，以開動所述驅動器以使所述控制管進行步驟(I)和(3)，然后進行步驟(2)和(4)。
3.權利要求2的系統，其中對所述控制器編程，以開動所述驅動器以使所述控制管進行步驟(I)，然后步驟(3)，然后(5)吸取額外封裝液體，然后￠)排出所述封裝液體，然后進行步驟(4)，然后步驟(2)，使得所述封裝液體、所述樣品液體和額外封裝液體作為一個單元從所述控制管中排出到所述載體液體導管中的載體液體的自由表面上，所述封裝液體和額外封裝液體從而合并并且包圍所述樣品液體，形成復合液體池。
4.權利要求3的系統，其中對所述控制器進一步編程，以開動所述驅動器以使所述控制管在步驟(5)之后和在步驟(6)之前(7)吸取分離器。
5.權利要求4的系統，其中所述分離器包括空氣。
6.權利要求4或權利要求5的系統，其中對所述控制器進一步編程，以開動所述驅動器以使所述控制管在步驟(7)之后和在步驟(6)之前(Ia)從封裝液體輸入吸取封裝液體，然后(3a)從樣品液體輸入吸取樣品液體，然后(5a)吸取額外封裝液體，然后^a)將步驟(Ia)和(5a)的封裝液體與步驟(3a)的樣品液體作為第二單元從控制管中排出到載體液體導管中的載體液體的自由表面上，所述第二單元從而形成第二復合液體池。
7.權利要求3的系統，其中對所`述控制器進一步編程，以開動所述驅動器以使所述控制管在步驟(5)之后和步驟(6)之前(8)從第二樣品液體輸入中吸取第二樣品液體，所述第二樣品液體與所述載體液體和所述封裝液體不混溶，然后(9)吸取額外封裝液體，然后(10)將步驟(9)的額外封裝液體和第二樣品液體排出到所述單元內，使得由此產生的復合液體池包含一滴所述樣品液體和一滴所述第二樣品液體。
8.權利要求1的系統，其中所述液體處理系統包括控制管和驅動器，并對所述控制器編程，以開動所述驅動器以使所述控制管按照所列出的順序進行步驟(I)至(4)。
9.權利要求8的系統，其中對所述控制器編程，以進行步驟(I)，然后對多個穩定部件重復步驟(2)，然后進行步驟(3)，然后對所述多個穩定部件重復步驟(4)，從而形成多個分布在所述穩定部件中的復合液體池。
10.權利要求8或權利要求9的系統，其中對所述控制器進一步編程，以開動所述驅動器以使所述控制管(11)吸取與所述樣品液體可混溶的試劑，和(12)緊鄰所排出樣品液體排出所述試劑。
11.前述權利要求中任一項的系統，其中(a)所述載體液體導管包括浴器，將其制成一定大小以容納載體液體浴器上的可在其中旋轉的圓盤；(b)在所述圓盤中形成穩定部件；(C)所述系統還包括(I)與圓盤操作性偶聯并使其在浴器中旋轉的旋轉驅動器，和(2)運動系統，其相對于載體液體導管垂直平移至少液體處理系統的排出部分；和(d)控制器與旋轉驅動器和運動系統操作性連接并經過編程以使所述旋轉系統旋轉所述圓盤并使運動系統相對于所述圓盤垂直平移液體處理系統的排出部分。
12.權利要求11的系統，其中對所述控制器進一步編程，以開動所述運動系統以使所述控制管相對于所述載體液體導管，移動在載體液體的自由表面上形成的復合液體池。
13.前述權利要求中任一項的系統，其中對所述控制器進一步編程，以使所述液體處理系統在所述載體液體的自由表面上形成的并被縫隙隔開的2個復合液體池之間排出足夠的封裝液體，液體填補該縫隙，從而使所述2個復合液體池彼此合并。
14.前述權利要求中任一項的系統，其中對所述控制器編程，以使所述液體處理系統緊鄰所排出封裝液體排出步驟(4)的樣品液體。
15.一種樣品處理方法，其包括: 從封裝液體輸入中吸取封裝液體； 將所吸封裝液體排出到(a)包括穩定部件的載體液體導管中的載體液體的自由表面上和(b)靠近所述穩定部件，所述封裝液體與所述載體液體不混溶，使得所排出封裝液體不與所述載體液體混合，漂浮在所述載體液體上面，并被所述穩定部件固定； 從樣品液體輸入中吸取樣品液體；和 排出所吸樣品液體，所述樣品液體與所述封裝液體和與所述載體液體不混溶，使得所述樣品液體與所述封 裝液體或與所述載體液體不混合。
全文摘要
樣品處理方法可包括從封裝液體輸入中吸取封裝液體；將所吸封裝液體排出到(a)包括穩定部件的載體液體導管中的載體液體的自由表面上和(b)靠近所述穩定部件，所述封裝液體與所述載體液體不混溶，使得所排出封裝液體不與所述載體液體混合，漂浮在所述載體液體上面，并被所述穩定部件固定；從樣品液體輸入中吸取樣品液體；和排出所吸樣品液體，所述樣品液體與所述封裝液體和與所述載體液體不混溶，使得所述樣品液體與所述封裝液體或與所述載體液體不混合。
文檔編號B01L3/00GK103153466SQ201180044805
公開日2013年6月12日 申請日期2011年7月22日 優先權日2010年7月22日
發明者K.卡蘭, P.托希, I.羅斯卡, P.弗勒明, S.吉爾霍利, M.基恩 申請人:基因細胞生物系統有限公司