一種吲哚-3-乙酸分子印跡磁性纖維素微球及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】一種吲哚-3-乙酸分子印跡磁性纖維素微球及其制備方法和應用，它涉及納米磁性纖維素分子印跡微球及其制備方法和應用。本發明要解決現有IAA檢測方法步驟復雜、費時、干擾定量及成本高的問題。本發明吲哚-3-乙酸分子印跡磁性纖維素微球由IAA、4-VP、硅烷化的β-CD、DMSO、納米磁性纖維素微球粒子、交聯劑、苯乙烯、引發劑和水制成。方法：一、纖維素的活化；二、纖維素的溶解；三、納米Fe3O4磁性液體的制備；四、納米磁性纖維素微球粒子的制備；五、β-環糊精硅烷化；六、IAA分子印跡磁性纖維素微球的制備。本發明吲哚-3-乙酸分子印跡磁性纖維素微球作為吸附劑用于定量檢測植物組織中吲哚-3-乙酸的含量。
【專利說明】—種吲哚-3-乙酸分子印跡磁性纖維素微球及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及納米磁性纖維素分子印跡微球及其制備方法，以及將其用于定量檢測植物組織中的吲哚-3-乙酸的含量，屬于生物質基功能材料制備【技術領域】。
【背景技術】
[0002]纖維素是一種直鏈多糖，它是通過大量的β -D-吡喃葡萄糖酐上的β -1, 4-糖苷鍵相互銜接最終形成的。纖維素屬于結晶性的原纖結構。這種晶區結構的形成是由于纖維素分子內部數量龐大的氫鍵誘導產生的，是一種超分子結構。纖維素不溶于水并且很難在一般的有機溶劑(如乙醇、丙酮、甲苯等)中進行溶解。但經過研究發現，纖維素非水溶劑體系可以溶解制備纖維素溶液，現有的纖維素非水溶劑體系主要有三種:Ν-甲基氧化嗎啉(DMMO)體系、離子液體體系以及LiCl/DMAc體系。其中LiCl/DMAc非水溶劑體系由于溶解過程不產生中間產物(即纖維素直接被溶解而不會發生降解反應)，所形成的溶液穩定性優良，可以進行均相酯化和成膜等反應而擁有巨大的優勢。
[0003]磁性高分子微球的應用以及研究范圍十分寬廣，在藥物方面，磁性微球可以與催化劑、酶、抗體、蛋白質等結合，作為這些物質的載體，可以顯著的提高酶、蛋白質、催化劑的生物活性，更高效的發揮它們的功能；在分析領域，磁性微球在外磁場存在下高效的選擇性分離富集作用可以實現對物質、離子的回收和再利用，如檢測和去除廢水中的重金屬；在生物工程和醫學技術方向，磁性微球良好的生物相容性可以用于固定化酶等生物工程和細胞分離等醫學領域，同時其優良的靶向性能、體積效應和表面效應使得微球可以應用于靶向藥物、臨床免疫診斷、體外擴增等方面；在磁顯影領域，磁性微球憑借其優良的磁性特征常被應用于核磁共振成像等方面；除此之外，當高分子磁性微球的粒徑達到可以使超順磁性消失的超小尺寸時，磁性微球就有了一定的磁滯消耗以及適量的發熱量，這時的微球可以應用于腫瘤熱療。當磁性微球達到納米`數量級后，微球中的納米尺度的磁性顆粒有了更加廣闊的應用空間，可以進行信息儲存、藥物及生物大分子運輸和磁流體密封的操作。納米級的磁性微球則可以應用于傳感器、非線性光學材料的制作，對電磁材料的屏蔽以及分子電子器件的制作等方面，發展前景十分可觀。當前制備磁性微球方法較多，選用的磁芯和高分子聚合物外殼也不盡相同。
[0004]分子印跡的方法十分簡便，并且容易操作。發生反應時需要的原料有:功能單體，模板分子，合適的溶劑以及交聯劑等。聚合反應是在體系中引入模板分子之后進行的。在這些反應過程中，功能單體是以有序的方式(和模板分子)組合起來的，與此同時，其功能基團也被安置在有著期望尺寸腔體內的某些期望位置上。既不需要有復雜的有機合成過程，也不需要有復雜的分子構造。如果希望該接受體能夠識別某種特定的客體化合物分子，可簡單地用選用的模板客體化合物(或其類似物)存在的條件下，將適當的功能單體進行聚合而完成所需操作。對于另一些客體化合物分子的識別，可適當選用另一些功能單體和模板分子進行組合，于是相應的接受體就幾乎是自動地形成了。當今，分子印跡的方法已得到廣泛的應用，它可很方便又經濟地將目標分子放置于期望位置。這一目的并不限于制備人工的接受體，而是有著更為廣闊的應用范圍。迄今還沒有這樣一種方法，可在溶液中(或在氣相中)將分子運動予以凍結，并能按照設計來固定它們。另外，采用生物分子作為模板，在分子生物學和藥物學中是頗有希望的。在許多科學文章中還可以看到，分子印跡的概念已得到有效的利用，毋庸置疑，分子印跡的方法將是21世紀的重大發展之一。
[0005]吲哚-3-乙酸(IAA)是植物體內合成的一系列微量有機物質，在極低濃度下控制著植物生命活動。由于天然植物中IAA的含量一般在ng/g數量級，而且IAA的痕量性、易變性和基質復雜性的特點，給植物生長素的檢測帶來了困難。目前檢測植物生長素含量的常規方法有:高效液相色譜法HPLC ;氣相色譜測定法(GC);酶聯免疫分析；毛細管電泳法(CE)，雖然上述方法已經成功應用到各種植物組織中IAA的檢測中，但是都具有一定的局限性:高效液相色譜法、氣相色譜雖然能以高靈敏度來檢測IAA，但是儀器比較昂貴，樣品處理步驟比較復雜，消耗時間比較長，不能實時、活體、原位地檢測植物激素；酶聯免疫分析法對目標分析物有著極好的特異性，作為一種具有選擇性的方法也已經用于植物激素的檢測，但是采用免疫分析對植物生長素進行定量分析時，由于存在一些其他抗體的交叉反應，可能會存在誤差，干擾定量進行。另外，免疫分析進行檢測植物生長素時需要合成生長素抗體，因此實驗步驟比較復雜、費時。
[0006]利用納米磁性纖維素分子印跡微球，用于定量檢測植物組織中的吲哚-3-乙酸的
含量一項十分有意義的研究。這是因為植物生長素吲哚-3-乙酸的用途相當廣泛，不但可
以用作植物生長刺激素還可以用作分析試劑，它誘導番茄單性結實和坐果，促進插枝生要，
其濃度對植物生長活動的影響是不可忽視的，適量地使用必然會對農業高效增產大有裨.、
Mo
【發明內容】
[0007]本發明的目的是為了解決現有IAA檢測方法步驟比較復雜、費時、干擾定量進行及成本高的問題，提供一種吲哚-3-乙酸分子印跡磁性纖維素微球及其制備方法和應用。
[0008]本發明的一種吲哚-3-乙酸分子印跡磁性纖維素微球由1.0~1.2mmol的IAA、
4.0 ~4.2mmol 的 4_VP、2.0 ~2.1g 硅烷化的 β-CD、10 ~12mL 的 DMS0、0.05g ~0.1Og 的納米磁性纖維素微球粒子、23~24mmol的交聯劑、79~80mmol的苯乙烯、0.6~0.7mmol的引發劑和80~85mL的水制成。
[0009]本發明的一種吲哚-3-乙酸分子印跡磁性纖維素微球的制備方法，按照以下步驟進行:
[0010]一、向微晶纖維素中加入無水DMAc浸泡40~50h，倒出上層清液，再將浸泡后的微晶纖維素于真空干燥器中，在溫度為55°C~60°C條件下干燥30~40h進行活化，得到活化后的干燥纖維素；
[0011]二、將無水LiCl加入到無水DMAc中，攪拌后制得質量百分含量為8%~12%的LiCl/DMAc溶液，再將步驟一得到的活化后的纖維素加入到上述LiCl/DMAc溶液中，進行磁力攪拌，得到質量百分含 量為2.8%~3%的纖維素溶液；
[0012]三、采用加熱至沸騰3~5min后再冷卻至室溫的蒸餾水配制0.5mol/L FeSO4溶液和1.0moI/L FeCl3溶液，將0.5mol/L FeSO4溶液和1.0moI/L FeCl3溶液按摩爾比I:1.5~2混合，在氮氣條件下攪拌至均質化，得混合溶液，然后加入質量百分含量為25%~28%的NH3 -H2O溶液，調節混合溶液的pH值至11~13，在氮氣條件下以800~1000rpm攪拌1.5~2h，得生成物，將生成物放入微波加熱器內，于80°C~90°C、氮氣條件下加熱I~1.5h，用磁石收集沉淀物，然后用體積百分含量為8%~10%的醋酸和蒸餾水交替洗滌3~4次，得到Fe3O4粒子；
[0013]四、取步驟三得到的Fe3O4粒子3.5~3.9g，加入質量百分含量為25%~28%的PEG600025~30mL溶液，用快速混勻器混勻10~15min，再超聲處理I~2h，然后再加入油酸2~3mL和聚乙烯醇0.3~0.4g,混勻5~8min,混勻后超聲30~40min,得到懸浮液，向上述懸浮液中加入步驟二得到的纖維素溶液98~IOOmL,邊加入邊進行超聲，超聲時間為30~40min，得到納米磁性纖維素微球粒子；
[0014]五、取β_⑶加入到無水DMF中，制備成質量百分含量為20%~22%的β-⑶的DMF溶液，再向30~35mL上述溶液中加入NaH至NaH達到飽和，然后于800~1000rpm下進行磁力攪拌I~1.5h，攪拌過程中加入GPTMS2~3mL，然后于75°C~80°C反應10~12h，將得到的沉淀物依次用DMF、甲醇和丙酮洗滌，得到硅烷化β -⑶，再將硅烷化β -⑶于100°C~110°C下真空干燥12~14h，然后置于干燥器中備用；
[0015]六、將1.0 ~1.2mmol 的 ΙΑΑ、4.0 ~4.2mmol 的 4-VP 和 2.0 ~2.1g 步驟五得到的硅烷化的β -CD溶解到10~12mL DMSO中，混合后于暗處存放12~14h，將10~12mL上述混合物、0.05g~0.1Og步驟四得到的納米磁性纖維素微球粒子、23~24mmol交聯劑、79~80mmol苯乙稀、0.6~0.7mmo1引發劑和80~85mL水混合后攬祥30~40min,得到均勻的懸浮液，向上述裝有懸浮液的容器中充滿氮氣后密封，然后于微波儀中，在600~700w、65~70°C的條件下聚合反應60~70min，再用20~30mL體積百分含量為10%~15%的乙酸甲醇溶液超聲洗滌6~8次，然后于110~130°C下真空干燥10~12h，研磨后用超強磁鐵收集，即得到吲哚-3-乙酸分子印跡磁性纖維素微球。
[0016]本發明所述的吲哚-3-乙酸分子印跡磁性纖維素微球作為吸附劑用于定量檢測植物組織中吲哚-3-乙酸的含量。
[0017]本發明包含以下有益效果:
[0018]1、本發明所用主要原料為可降解、無污染的纖維素材料，納米磁性纖維素微球具有超順磁性，在外磁場的存在下可以進行定位、分離等操作；
[0019]本發明選用Fe3O4納米磁性粒子作為磁性內核，纖維素溶液作為外殼，不僅具有安全無毒、可生物降解的優點而且使用這種無機的納米材料所制備形成的微球仍然保留磁效應這一特性,在外加磁場時顯示磁性,撤去磁場磁性變為零,不會在磁場中被永久磁化；并且Fe3O4納米磁性粒子的粒徑屬于納米的數量級，在室溫環境下顯示超順磁性而在低溫環境中顯示鐵磁性，保證了微球不會在磁場中被永久性磁化，即室溫、外加磁場存在下，高分子微球磁性很強，撤掉外加磁場后磁性在很短時間內變為零；并且，在外磁場的作用下，高分子微球的順磁性使得固液分離更簡便可行，一些像過濾，萃取等復雜的傳統操作便可以省略，提高了分離效率；
[0020]2、本發明纖維素磁性微球是一種高分子惰性材料微球，這種微球不僅制備成本低而且球的化學性質穩定，表面均勻度好，便于長時間貯存而不降低使用性質，有很廣的應用空間；[0021]3、纖維素磁性微球還具有生物相容性好的特點，可用于吸附或解吸生物活性物質；
[0022]4、本發明結合磁性分離技術和分子印跡技術成功制得分子印跡微球，用于定量檢測植物組織中的吲哚-3-乙酸(IAA)，其技術既簡便易行又經濟實用、省時、成本低，并且制得的分子印跡微球的印記效果通過高效液相色譜進行檢測，由實驗數據分析得到良好的準確性和精密度，說明本方法的可行性，在科研及實際應用等多方面一定會有廣闊的發展前景，同時也說明了納米磁性纖維素分子印跡微球是一種具有良好檢測植物組織中IAA含量的生物質基功能微球材料。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023]圖1為本發明的磁性分子印跡微球的制備實驗過程示意圖；
[0024]圖2為實施例一制備的微球的粒徑分布表征圖(激光粒度儀報告);
[0025]圖3為實施例一制備的纖維素微球粒子粒徑分布圖；
[0026]圖4為實施例一制備的納米磁性纖維素微球25倍的掃描電鏡圖；
[0027]圖5為實施例一制備的納米磁性纖維素微球30倍的掃描電鏡圖；
[0028]圖6為實施例一制備的納米磁性纖維素微球250倍的掃描電鏡圖；
[0029]圖7為實施例一制備的納米磁性纖維素微球1200倍的掃描電鏡圖；
[0030]圖8為實施例一制備的納米磁性分子印記微球的外觀形貌圖；
[0031]圖9為實施例一制備的納米磁性分子印記微球的外觀形貌圖；
[0032]圖1O為實施例二中得到的不同IAA濃度-峰面積圖。
【具體實施方式】
[0033]本發明技術方案不局限于以下所列舉【具體實施方式】，還包括各【具體實施方式】間的任意組合。
[0034]【具體實施方式】一:本實施方式一種11引哚-3-乙酸分子印跡磁性纖維素微球由1.0 ~1.2mmol 的 ΙΑΑ、4.0 ~4.2mmol 的 4_VP(4_ 乙烯基吡啶)、2.0 ~2.1g硅烷化的 β -CD(β -環糊精)、10~12mL的DMS0、0.05g~0.1Og的納米磁性纖維素微球粒子、23~24mmol的交聯劑、79~8OmmoI的苯乙烯(ST)、0.6~0.7mmol的引發劑和80~85mL的水制成。
[0035]本實施方式的有益效果:
[0036]1、本實施方式所用主要原料為可降解、無污染的纖維素材料，納米磁性纖維素微球具有超順磁性，在外磁場的存在下可以進行定位、分離等操作；
[0037]本實施方式選用Fe3O4納米磁性粒子作為磁性內核，纖維素溶液作為外殼，不僅具有安全無毒、可生物降解的優點而且使用這種無機的納米材料所制備形成的微球仍然保留磁效應這一特性,在外加磁場時顯示磁性,撤去磁場磁性變為零,不會在磁場中被永久磁化；并且Fe3O4納米磁性粒子的粒徑屬于納米的數量級，在室溫環境下顯示超順磁性而在低溫環境中顯示鐵磁性，保證了微球不會在磁場中被永久性磁化，即室溫、外加磁場存在下，高分子微球磁性很強，撤掉外加磁場后磁性在很短時間內變為零；并且，在外磁場的作用下，高分子微球的順磁性使得固液分離更簡便可行，一些像過濾，萃取等復雜的傳統操作便可以省略，提高了分離效率；[0038]2、本實施方式纖維素磁性微球是一種高分子惰性材料微球，這種微球不僅制備成本低而且球的化學性質穩定，表面均勻度好，便于長時間貯存而不降低使用性質，有很廣的應用空間；
[0039]3、纖維素磁性微球還具有生物相容性好的特點，可用于吸附或解吸生物活性物質。
[0040]【具體實施方式】二:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:所述的納米磁性纖維素微球粒子是按以下步驟制備的:
[0041]—、采用加熱至沸騰3~5min后再冷卻至室溫的蒸懼水配制0.5mol/L FeSO4溶液和1.0moI/L FeCl3溶液，將0.5mol/L FeSO4溶液和1.0moI/L FeCl3溶液按摩爾比I:1.5~2混合，在氮氣條件下攪拌至均質化，得混合溶液，然后加入質量百分含量為25%~28%的NH3 -H2O溶液，調節混合溶液的pH值至11~13，在氮氣條件下以800~1000rpm攪拌1.5~2h，得生成物，將生成物放入微波加熱器內，于80°C~90°C、氮氣條件下加熱I~1.5h，用磁石收集沉淀物，然后用體積百分含量為8%~10%的醋酸和蒸餾水交替洗滌3~4次，得到Fe3O4粒子；
[0042]二、取步驟三得到的Fe3O4粒子3.5~3.9g，加入質量百分含量為25%~28%的PEG600025~30mL溶液，用快速混勻器混勻10~15min，再超聲處理I~2h，然后再加入油酸2~3mL和聚乙烯醇0.3~0.4g,混勻5~8min,混勻后超聲30~40min,得到懸浮液，向上述懸浮液中加入步驟二得到的纖維素溶液98~IOOmL,邊加入邊進行超聲，超聲時間為30~40min，得到納米磁性纖維素微球粒子。
[0043]其它與【具體實施方式】一相同。
[0044]【具體實施方式】三:本實施方式與【具體實施方式】一或二不同的是:其特征在于所述的硅烷化的β -⑶是按以下步驟制備的:取β -⑶加入到無水DMF中，制備成質量百分含量為20%~22%的β -⑶的DMF溶液，再向30~35mL上述溶液中加入NaH至NaH達到飽和，然后于800~1000rpm下進行磁力攪拌I~1.5h,攪拌過程中加入GPTMS2~3mL,然后于75°C~80°C反應10~12h，將得到的沉淀物依次用DMF、甲醇和丙酮洗滌，得到硅烷化β-⑶，再將硅烷化β-⑶于100°C~110°C下真空干燥12~14h，然后置于干燥器中，干燥后即得硅烷化的β-CD。其它與【具體實施方式】一或二相同。
[0045]【具體實施方式】四:本實施方式一種11引哚-3-乙酸分子印跡磁性纖維素微球的制備方法，按以下步驟進行:
[0046]—、向微晶纖維素中加入無水DMAc浸泡40~50h，倒出上層清液，再將浸泡后的微晶纖維素于真空干燥器中，在溫度為55°C~60°C條件下干燥30~40h進行活化，得到活化后的干燥纖維素；
[0047]二、將無水LiCl加入到無水DMAc中，攪拌后制得質量百分含量為8%~12%的LiCl/DMAc溶液，再將步驟一得到的活化后的纖維素加入到上述LiCl/DMAc溶液中，進行磁力攪拌，得到質量百分含量為2.8%~3%的纖維素溶液；
[0048]三、采用加熱至沸騰3~5min后再冷卻至室溫的蒸餾水配制0.5mol/L FeSO4溶液和1.0moI/L FeCl3溶液，將0.5mol/L FeSO4溶液和1.0moI/L FeCl3溶液按摩爾比I:1.5~2混合，在氮氣條件下攪拌至均質化，得混合溶液，然后加入質量百分含量為25%~28%的NH3 -H2O溶液，調節混合溶液的pH值至11~13，在氮氣條件下以800~1000rpm攪拌1.5~2h，得生成物，將生成物放入微波加熱器內，于80°C~90°C、氮氣條件下加熱I~
1.5h，用磁石收集沉淀物，然后用體積百分含量為8%~10%的醋酸和蒸餾水交替洗滌3~4次，得到Fe3O4粒子；
[0049]四、取步驟三得到的Fe3O4粒子3.5~3.9g，加入質量百分含量為25%~28%的PEG600025~30mL溶液，用快速混勻器混勻10~15min，再超聲處理I~2h，然后再加入油酸2~3mL和聚乙烯醇0.3~0.4g,混勻5~8min,混勻后超聲30~40min,得到懸浮液，向上述懸浮液中加入步驟二得到的纖維素溶液98~1OOmL,邊加入邊進行超聲，超聲時間為30~40min，得到納米磁性纖維素微球粒子；
[0050]五、取β -cd(β -環糊精)加入到無水DMF中，制備成質量百分含量為20%~22%的β -⑶的DMF溶液，再向30~35mL上述溶液中加入NaH至NaH達到飽和，然后于800~1000rpm下進行磁力攪拌1~L 5h，攪拌過程中加入GPTMS2~3mL，然后于75°C~80°C反應10~12h，將得到的沉淀物依次用DMF、甲醇和丙酮洗滌，得到硅烷化β-⑶，再將硅烷化β-⑶于100°C~110°C下真空干燥12~14h，然后置于干燥器中備用；
[0051]六、將1.0 ~1.2mmol 的 ΙΑΑ、4.0 ~4.2mmol 的 4-VP (4-乙烯基批P定)和 2.0 ~
2.1g步驟五得到的硅烷化的β-⑶溶解到10~12mL DMSO中，混合后于暗處存放12~14h，將10~12mL上述混合物、0.05g~0.1Og步驟四得到的納米磁性纖維素微球粒子、23~24mmo1交聯劑、79~80mmol苯乙稀(ST)、0.6~0.7mmo1引發劑和80~85mL水混合后攬拌30~40min，得到均勻的懸浮液，向上述裝有懸浮液的容器中充滿氮氣后密封，然后于微波儀中，在600~700w、65~70°C的條件下聚合反應60~70min，再用20~30mL體積百分含量為10%~15%的乙酸甲醇溶液超聲洗滌6~8次，然后于110~130°C下真空干燥10~12h，研磨后用超強磁鐵收集，即得到吲哚-3-乙酸分子印跡磁性纖維素微球。
[0052]【具體實施方式】五:本實施方式與【具體實施方式】四不同的是:步驟二中所述的將無水LiCl加入到無水DMAc中，攪拌后制得質量百分含量為8%的LiCl/DMAc溶液，再將步驟一得到的活化后的纖維素加入到上述LiCl/DMAc溶液中，進行磁力攪拌，得到質量百分含量為3%的纖維素溶液。其它與【具體實施方式】四相同。
[0053]【具體實施方式】六:本實施方式與【具體實施方式】四或五不同的是:步驟三中所述的將0.5mol/L FeSO4溶液和1.0moI/L FeCl3溶液按摩爾比I:1.5混合。其它與【具體實施方式】四或五相同。
[0054]【具體實施方式】七:本實施方式與【具體實施方式】四至六之一不同的是:步驟四中所述的取步驟三得到的Fe3O4粒子3.9g，加入質量百分含量為27%的PEG6000 30mL溶液，用快速混勻器混勻lOmin。其它與【具體實施方式】四至六之一相同。
[0055]【具體實施方式】八:本實施方式與【具體實施方式】四至七之一不同的是:步驟六中所述的將1.0mmol的IAA、4.0mmol的4-VP和2.0g步驟五得到的硅烷化的β -CD溶解到IOmLDMSO中，混合后于暗處存放12h，將IOmL上述混合物、0.09g步驟四得到的納米磁性纖維素微球粒子、23.7mmol交聯劑、79.6mmol苯乙烯、0.6mmol引發劑和80mL水混合后攪拌30min。其它與【具體實施方式】四至七之一相同。
[0056]【具體實施方式】九:本實施方式與【具體實施方式】四至八之一不同的是:步驟一中所述的將浸泡后的微晶纖維素于真空干燥器中，在溫度為60°C條件下干燥40h進行活化，得到活化后的干燥纖維素。其它與【具體實施方式】四至八之一相同。[0057]【具體實施方式】十:本實施方式與【具體實施方式】四至九之一不同的是:步驟五中所述的取β -⑶加入到無水DMF中，制備成質量百分含量為21%的β -⑶的DMF溶液。其它與【具體實施方式】四至九之一相同。
[0058]【具體實施方式】十一:本實施方式與【具體實施方式】四至十之一不同的是:步驟六中所述的交聯劑為三羥甲基丙烷三丙烯酸甲酯(TRM)、二乙烯基苯(DVB)或二甲基丙烯酸乙二醇酯(RGDMA)，所述的引發劑為偶氮二異丁腈(AIBN)或2，2’-偶氮雙(2，4-二甲基戊腈)(ABVN)0其它與【具體實施方式】四至十之一相同。
[0059]【具體實施方式】十二:本實施方式一種11引哚-3-乙酸分子印跡磁性纖維素微球的應用，其特征在于吲哚-3-乙酸分子印跡磁性纖維素微球作為吸附劑用于定量檢測植物組織中吲哚-3-乙酸的含量。
[0060]本實施方式的有益效果:
[0061]本實施方式結合磁性分離技術和分子印跡技術成功制得分子印跡微球，用于定量檢測植物組織中的吲哚-3-乙酸(ΙΑΑ)，其技術既簡便易行又經濟實用、省時、成本低，并且制得的分子印跡微球的印記效果通過高效液相色譜進行檢測，由實驗數據分析得到良好的準確性和精密度，說明本方法的可行性，在科研及實際應用等多方面一定會有廣闊的發展前景，同時也說明了納米磁性纖維素分子印跡微球是一種具有良好檢測植物組織中IAA含量的生物質基功能微球材料。
[0062]【具體實施方式】十三:本實施方式與【具體實施方式】十二不同的是:所述的吲哚-3-乙酸分子印跡磁性纖維素微球作為吸附劑用于定量檢測植物組織中吲哚-3-乙酸的含量，按照以下步驟進行:
[0063]一、用液相色譜繪制吲哚-3-乙酸的標準校正曲線:液相色譜檢測條件為:固定相為Hypersil ODS C-18，流動相為體積百分含量為0.45%的乙酸甲醇溶液，流動相流速為1.0mL/min,檢測波長為280nm,采用agilentllOO液相色譜儀,校正吲哚-3-乙酸標準溶液的線性范圍為2~IOOppm;`
[0064]其中，用吲哚-3-乙酸分子印跡磁性纖維素微球處理標準溶液的方法為:稱取
0.05g吲哚-3-乙酸分子印跡磁性纖維素微球浸入到3mL吲哚-3-乙酸標準溶液中，于室溫下恒溫振蕩30min，用超強磁鐵進行固液分離，收集微球后先加入3mL正己烷于室溫下恒溫振蕩30min，再收集微球加入ImL體積百分含量為1%的乙酸甲醇溶液于50°C恒溫條件下振蕩30min，進行洗脫，將洗脫液在上述液相色譜條件下進行檢測，得回歸方程A=8457.4C+26639 (相關系數R2=0.9963)，其中A表示液相色譜檢測出的峰面積，C表示進樣IAA標液的濃度(ppm)；
[0065]二、采集3~4cm長的植物新生幼嫩葉片20~25g，將葉片碾碎后加入50~60mL甲醇溶液中，將上述樣品于_15°C~_20°C下暗處放置12~14h，過濾后將殘渣用50~60mL甲醇洗滌3~4次，將洗滌液于45°C~50°C減壓蒸餾濃縮至5~10mL，移取上述濃縮液3~4mL，按照步驟一中用吲哚-3-乙酸分子印跡磁性纖維素微球處理標準溶液的方法處理濃縮液，然后測定植物新生幼嫩葉片吲哚-3-乙酸的含量，即完成。
[0066]其它與【具體實施方式】十二相同。
[0067]下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。
[0068]實施例一:
[0069]本實施例吲哚-3-乙酸分子印跡磁性纖維素微球的制備方法，按照以下步驟進行:
[0070]一、纖維素的活化預處理
[0071]取IOg微晶纖維素(25 μ m)于三口瓶中，加入一定量的無水DMAc浸泡兩天，倒出上層清夜，再將浸泡后的微晶纖維素于真空干燥器中，在溫度為60°C條件下干燥40h進行活化，得到活化后的干燥纖維素；
[0072]二、纖維素的溶解(3%的纖維素溶液的制備)
[0073]使用溶脹法，對纖維素進行活化預處理，再通過氯化鋰/N，N-二甲基乙酰胺(LiCl/DMAc)體系制備纖維素溶液:
[0074]LiCl和DMAc均為吸濕性的藥品，在制備LiCl/DMAc體系用于溶解纖維素之前，需要除去其中所含的全部水分，稱取8.0g無水LiCl，將其加入到98mL無水DMAc中，攪拌至完全溶解后可得到質量百分含量為8%的LiCl/DMAc溶液，稱取3.0g步驟一得到的活化后的纖維素，加入到上述質量百分含量為8%的LiCl/DMAc溶液中，在磁力作用下攪拌，纖維素集結成為大量絮狀顆粒漂浮于LiCl/DMAc溶液中并逐漸溶解變小，直至形成均勻溶液，得到質量百分含量為3%的纖維素溶液；
[0075]三、納米Fe3O4磁性液體的制備
[0076]采用共沉淀法制備 納米數量級的Fe3O4粒子:
[0077]將蒸餾水300mL置于1000mL大燒杯中，放在電磁爐上加熱至沸騰3min，直至趕盡所有氧氣，靜置，冷卻至室溫待用。配制0.5mol/L FeSO4溶液:稱取FeSO4.7Η20固體6.95g于IOOmL小燒杯中，加入少量冷卻后的蒸餾水溶解，轉移至50mL容量瓶中，定容，搖勻。配制1.0moI/L FeCl3溶液:稱取FeCl3.6H20固體13.52g于IOOmL小燒杯中，加入少量冷卻后的蒸餾水溶解，轉移至50mL容量瓶中，定容，搖勻溶液。將0.5mol/L FeSO4溶液23mL和1.0moI/L FeCl3溶液17.2mL混合于三口瓶中，在氮氣流的保護下攪拌至均質化，迅速加入
14.4mL質量百分含量為28%的NH3 -H2O溶液，調節混合溶液的pH值至11，在氮氣條件下以SOOrpm攪拌2h至溶液變為深棕色，生成物放入微波加熱器內于80°C、氮氣條件下加熱lh，溶液變黑，沉淀物用磁石收集后用體積百分含量為10%的醋酸和蒸餾水交替洗滌3次(仍然在三口瓶中)，得到Fe3O4粒子；
[0078]四、納米磁性纖維素微球粒子的制備
[0079]利用包埋法制備殼核型納米磁性纖維素微球粒子:
[0080]取步驟三得到的Fe3O4粒子3.9g，加入質量百分含量為27%的PEG6000 30mL溶液，用快速混勻器混勻lOmin，再超聲處理lh，然后再加入油酸2mL和聚乙烯醇(PVA)0.3g，混勻5min，混勻后超聲30min，得到懸浮液，向上述懸浮液中加入步驟二得到的纖維素溶液98mL，邊加入邊進行超聲，超聲時間為30min，得灰棕色懸浮液，即得到納米磁性纖維素微球粒子；
[0081]五、β -CD ( β -環糊精)的硅烷化
[0082]取β -⑶加入到無水DMF中，制備成質量百分含量為21%的β -⑶的DMF溶液，再向30mL上述溶液中加入NaH至NaH達到飽和(剩余的NaH通過過濾除去),然后于800rpm下進行磁力攪拌lh，攪拌過程中加入GPTMS2mL，然后于80°C反應12h(將溫度控制在±0.1°C區間內變化)，將得到的沉淀物依次用DMF、甲醇和丙酮洗滌，每次30mL，得到硅烷化β -⑶，再將硅烷化β -⑶于110°C下真空干燥12h，然后置于干燥器中備用；
[0083]六、IAA分子印記微球的制備
[0084]將1.0mmol的IAA、4.0mmol的4-VP (4_乙烯基吡唳)和2.0g步驟五得到的硅烷化的β -CD溶解到IOmL DMSO中，混合后于暗處存放12h，將12mL上述混合物、0.09g步驟四得到的納米磁性纖維素微球粒子、23.7mmol TRM (三羥甲基丙烷三丙烯酸甲酯)(9.46mL)、79.6mmol 苯乙稀(ST) (9.16mL)>0.Bmmol AIBN (偶氣二異丁臆)(0.098g)和 80mL 水混合后攪拌30min，得到均勻的懸浮液，向上述裝有懸浮液的300mL三口瓶中充滿氮氣后塞緊瓶塞密封，然后于微波儀中，在600w、70°C的條件下聚合反應60min，再用25mL體積百分含量為10%的乙酸甲醇溶液超聲洗滌7次直到無IAA被檢測到為止，然后于120°C下真空干燥llh，研磨后用超強磁鐵收集，即得到吲哚-3-乙酸分子印跡磁性纖維素微球。 [0085]對本實施例步驟四制備的納米磁性Fe3O4纖維素微球粒子進行表征:使用激光粒度儀對微球粒徑的范圍進行統計，再通過電鏡來觀察微球的粒徑大小以及表面形貌，最后測試磁性；用X射線光譜儀對微球粒子的組成進行表征；對纖維素微球的選擇性以及選擇條件進行表征。通過微球對含量低的分子的選擇效果的測試，來確定選擇性優劣。
[0086]將本實施例制備的微球用激光粒度儀對其粒徑分布進行表征，其中分析模式為polydis.，樣品折射率為3.1，介質名稱為水，介質折射率為1.33，遮光比為23.2%，截斷下限為0.05，截斷上限為300.00，超聲時間為2min，擬合殘余為0.92，結果如圖2和圖3所示，圖2和圖3的結果顯示，本實施例制備的磁性纖維素微球粒徑分布在600nm到1.21 μ m之間，并且大部分粒子的粒徑分布在納米尺度上，該尺度磁性纖維素微球所占的比例為79%。經過表征表明，所制備的磁性纖維素微球粒子符合要求，其粒徑主要分布在納米尺度，微米尺度上的微球所占比例極小。
[0087]將本實施例制備的納米磁性纖維素微球用電鏡對其表面形貌進行觀察，結果如圖
4-7所示，結果表明納米磁性纖維素微球成球形狀良好。
[0088]實施例二:
[0089]本實施例吲哚-3-乙酸分子印跡磁性纖維素微球作為吸附劑用于定量檢測植物組織中吲哚-3-乙酸的含量，按照以下步驟進行:
[0090]一、用液相色譜繪制吲哚-3-乙酸的標準校正曲線:液相色譜檢測條件為:固定相為Hypersil ODS C-18，流動相為體積百分含量為0.45%的乙酸甲醇溶液，流動相流速為1.0mL/min,檢測波長為280nm,采用agilentllOO液相色譜儀,校正吲哚-3-乙酸標準溶液的線性范圍為 2 ~IOOppm (采用 2ppm、5ppm、8ppm、16ppm、20ppm、IOOppm 六個濃度)；
[0091]其中，用吲哚-3-乙酸分子印跡磁性纖維素微球處理標準溶液的方法為:稱取
0.05g吲哚-3-乙酸分子印跡磁性纖維素微球浸入到3mL吲哚-3-乙酸標準溶液中，于室溫下恒溫振蕩30min，用超強磁鐵進行固液分離，收集微球后先加入3mL正己烷于室溫下恒溫振蕩30min，再收集微球加入ImL體積百分含量為1%的乙酸甲醇溶液于50°C恒溫條件下振蕩30min，進行洗脫，將洗脫液在上述液相色譜條件下進行檢測，得回歸方程A=8457.4C+26639 (相關系數R2=0.9963)，其中A表示液相色譜檢測出的峰面積，C表示進樣IAA標液的濃度(ppm)；[0092]對上述儲備待測樣品進行液相色譜檢測，實驗數據記錄如表1所示:
[0093]表1IAA標液印跡效果液譜實驗數據
[0094]
【權利要求】
1.一種吲哚-3-乙酸分子印跡磁性纖維素微球，其特征在于吲哚-3-乙酸分子印跡磁性纖維素微球由1.0~1.2mmol的IAA、4.0~4.2mmol的4_VP、2.0~2.1g硅烷化的β -⑶、10~12mL的DMS0、0.05g~0.1Og的納米磁性纖維素微球粒子、23~24mmol的交聯劑、79~8OmmoI的苯乙烯、0.6~0.7mmol的引發劑和80~85mL的水制成。
2.根據權利要求1所述的一種吲哚-3-乙酸分子印跡磁性纖維素微球，其特征在于所述的納米磁性纖維素微球粒子是按以下步驟制備的: 一、采用加熱至沸騰3~5min后再冷卻至室溫的蒸餾水配制0.5mol/L FeSO4溶液和1.0moI/L FeCl3 溶液，將 0.5mol/L FeSO4 溶液和 1.0moI/L FeCl3 溶液按摩爾比 1:1.5 ~2混合，在氮氣條件下攪拌至均質化，得混合溶液，然后加入質量百分含量為25%~28%的NH3.H2O溶液，調節混合溶液的pH值至11~13，在氮氣條件下以800~1000rpm攪拌1.5~2h,得生成物,將生成物放入微波加熱器內，于80°C~90°C、氮氣條件下加熱I~1.5h,用磁石收集沉淀物，然后用體積百分含量為8%~10%的醋酸和蒸餾水交替洗滌3~4次，得到Fe3O4粒子； 二、取步驟三得到的Fe3O4粒子3.5~3.9g，加入質量百分含量為25%~28%的PEG600025~30mL溶液，用快速混勻器混勻10~15min，再超聲處理I~2h，然后再加入油酸2~3mL和聚乙烯醇0.3~0.4g,混勻5~8min,混勻后超聲30~40min,得到懸浮液，向上述懸浮液中加入步驟二得到的纖維素溶液98~IOOmL,邊加入邊進行超聲，超聲時間為30~40min，得到納米磁性纖維素微球粒子。
3.根據權利要求1所述的一種吲哚-3-乙酸分子印跡磁性纖維素微球，其特征在于所述的硅烷化的β -⑶是按以下步驟制備的:取β -⑶加入到無水DMF中，制備成質量百分含量為20%~22%的β -⑶的DMF溶液，再向30~35mL上述溶液中加入NaH至NaH達到飽和，然后于800~1000rpm下進行磁力攪拌I~1.5h，攪拌過程中加入GPTMS2~3mL，然后于75°C~80°C反應10~12h，`將得到的沉淀物依次用DMF、甲醇和丙酮洗滌，得到硅烷化β-⑶，再將硅烷化β-⑶于100°C~110°C下真空干燥12~14h，然后置于干燥器中，干燥后即得硅烷化的β -⑶。
4.一種制備權利要求1所述的吲哚-3-乙酸分子印跡磁性纖維素微球的方法，其特征在于它包括以下步驟: 一、向微晶纖維素中加入無水DMAc浸泡40~50h，倒出上層清液，再將浸泡后的微晶纖維素于真空干燥器中，在溫度為55°C~60°C條件下干燥30~40h進行活化，得到活化后的干燥纖維素； 二、將無水LiCl加入到無水DMAc中，攪拌后制得質量百分含量為8%~12%的LiCl/DMAc溶液，再將步驟一得到的活化后的纖維素加入到上述LiCl/DMAc溶液中，進行磁力攪拌，得到質量百分含量為2.8%~3%的纖維素溶液； 三、采用加熱至沸騰3~5min后再冷卻至室溫的蒸餾水配制0.5mol/L FeSO4溶液和`1.0moI/L FeCl3 溶液，將 0.5mol/L FeSO4 溶液和 1.0moI/L FeCl3 溶液按摩爾比 1:1.5 ~2混合，在氮氣條件下攪拌至均質化，得混合溶液，然后加入質量百分含量為25%~28%的NH3.H2O溶液，調節混合溶液的pH值至11~13，在氮氣條件下以800~1000rpm攪拌1.5~2h,得生成物,將生成物放入微波加熱器內，于80°C~90°C、氮氣條件下加熱I~1.5h,用磁石收集沉淀物，然后用體積百分含量為8%~10%的醋酸和蒸餾水交替洗滌3~4次，得到Fe3O4粒子； 四、取步驟三得到的Fe3O4粒子3.5~3.9g，加入質量百分含量為25%~28%的PEG600025~30mL溶液，用快速混勻器混勻10~15min，再超聲處理I~2h，然后再加入油酸2~3mL和聚乙烯醇0.3~0.4g,混勻5~8min,混勻后超聲30~40min,得到懸浮液，向上述懸浮液中加入步驟二得到的纖維素溶液98~IOOmL,邊加入邊進行超聲，超聲時間為30~40min，得到納米磁性纖維素微球粒子； 五、取β-⑶加入到無水DMF中，制備成質量百分含量為20%~22%的β -⑶的DMF溶液，再向30~35mL上述溶液中加入NaH至NaH達到飽和,然后于800~1000rpm下進行磁力攪拌I~1.5h，攪拌過程中加入GPTMS2~3mL，然后于75°C~80°C反應10~12h，將得到的沉淀物依次用DMF、甲醇和丙酮洗滌，得到硅烷化β -⑶，再將硅烷化β -⑶于100°C~110°C下真空干燥12~14h，然后置于干燥器中備用； 六、將1.0~1.2mmol的ΙΑΑ、4.0~4.2mmol的4-VP和2.0~2.1g步驟五得到的硅烷化的β -CD溶解到10~12mL DMSO中，混合后于暗處存放12~14h，將10~12mL上述混合物、0.05g~0.1Og步驟四得到的納米磁性纖維素微球粒子、23~24mmol交聯劑、79~8OmmoI苯乙稀、0.6~0.7mmo1引發劑和80~85mL水混合后攬祥30~40min,得到均勻的懸浮液，向上述裝有懸浮液的容器中充滿氮氣后密封，然后于微波儀中，在600~700w、65~70°C的條件下聚合反應60~70min，再用20~30mL體積百分含量為10%~15%的乙酸甲醇溶液超聲洗滌6~8次，然后于110~130°C下真空干燥10~12h，研磨后用超強磁鐵收集，即得到吲哚-3-乙酸分子印跡磁性纖維素微球。
5.根據權利要求4所述的一種吲哚-3-乙酸分子印跡磁性纖維素微球的制備方法，其特征在于步驟二中所述的將無水LiCl加入到無水DMAc中，攪拌后制得質量百分含量為8%的LiCl/DMAc溶液，再將 步驟一得到的活化后的纖維素加入到上述LiCl/DMAc溶液中，進行磁力攪拌，得到質量百分含量為3%的纖維素溶液。
6.根據權利要求4所述的一種吲哚-3-乙酸分子印跡磁性纖維素微球的制備方法，其特征在于步驟三中所述的將0.5mol/L FeSO4溶液和1.0moI/L FeCl3溶液按摩爾比1:1.5混合。
7.根據權利要求4所述的一種吲哚-3-乙酸分子印跡磁性纖維素微球的制備方法，其特征在于步驟四中所述的取步驟三得到的Fe3O4粒子3.9g，加入質量百分含量為27%的PEG6000 30mL溶液，用快速混勻器混勻lOmin。
8.根據權利要求2所述的一種吲哚-3-乙酸分子印跡磁性纖維素微球的制備方法，其特征在于步驟六中所述的將1.0mmol的IAA、4.0mmol的4-VP和2.0g步驟五得到的硅烷化的β -CD溶解到IOmL DMSO中，混合后于暗處存放12h，將IOmL上述混合物、0.09g步驟四得到的納米磁性纖維素微球粒子、23.7mmol交聯劑、79.6mmol苯乙烯、0.6mmol引發劑和80mL水混合后攪拌30min。
9.一種吲哚-3-乙酸分子印跡磁性纖維素微球的應用，其特征在于吲哚-3-乙酸分子印跡磁性纖維素微球作為吸附劑用于定量檢測植物組織中吲哚-3-乙酸的含量。
10.根據權利要求9所述的一種吲哚-3-乙酸分子印跡磁性纖維素微球的應用，其特征在于吲哚-3-乙酸分子印跡磁性纖維素微球作為吸附劑用于定量檢測植物組織中吲哚-3-乙酸的含量，按照以下步驟進行:一、用液相色譜繪制吲哚-3-乙酸的標準校正曲線:液相色譜檢測條件為:固定相為Hypersil ODS C-18，流動相為體積百分含量為0.45%的乙酸甲醇溶液，流動相流速為.1.0mL/min,檢測波長為280nm,采用agilentllOO液相色譜儀,校正吲哚-3-乙酸標準溶液的線性范圍為2~IOOppm; 其中，用吲哚-3-乙酸分子印跡磁性纖維素微球處理標準溶液的方法為:稱取0.05g吲哚-3-乙酸分子印跡磁性纖維素微球浸入到3mL吲哚-3-乙酸標準溶液中，于室溫下恒溫振蕩30min，用超強磁鐵進行固液分離，收集微球后先加入3mL正己烷于室溫下恒溫振蕩30min，再收集微球加入ImL體積百分含量為1%的乙酸甲醇溶液于50°C恒溫條件下振蕩30min，進行洗脫，將洗脫液在上述液相色譜條件下進行檢測，得回歸方程A=8457.4C+26639，其中A表示液相色譜檢測出的峰面積，C表示進樣IAA標液的濃度； 二、采集3~4cm長的植物新生幼嫩葉片20~25g，將葉片碾碎后加入50~60mL甲醇溶液中，將上述樣品于_15°C~_20°C下暗處放置12~14h，過濾后將殘渣用50~60mL甲醇洗滌3~4次，將洗滌液于45°C~50°C減壓蒸餾濃縮至5~10mL，移取上述濃縮液3~4mL,按照步驟一中用吲哚-3-乙酸分子印跡磁性纖維素微球處理標準溶液的方法處理濃縮液，然后測定植物新生幼嫩葉片吲哚-3-乙酸的含量，即完成。
【文檔編號】B01J13/14GK103626920SQ201310625906
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年11月28日 優先權日:2013年11月28日
【發明者】王霆, 金佳琪, 董仕輝, 劉暢, 孫楠, 閻秀峰 申請人:東北林業大學