本發明涉及一種基于單域重鏈抗體(又稱納米抗體技術)的免疫親和吸附材料，特別是針對c-Myc標簽的免疫親和吸附材料。
技術背景
c-Myc標簽蛋白的發現源于1985年Evan制備獲得了一株針對人原癌基因產物Myc蛋白的單克隆抗體9E10，此后研究發現該抗體識別的表位由10個氨基酸殘基組成，其序列為Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu，并且這10個氨基酸與其它蛋白融合表達后依然能夠保持很強的抗原活性，可以被相應抗體識別，而且不受到蛋白框架的影響。因此，c-Myc標簽系統廣泛應用于免疫學檢測、細胞成像、親和純化以及蛋白質工程等領域。
免疫親和層析、免疫親和磁珠及免疫共沉淀等技術常用于分離純化含有c-Myc標簽融合蛋白。這類親和純化技術基于配基與c-Myc標簽特異性結合的原理，一般地，將特異性結合c-Myc標簽的配基與載體偶聯或吸附，然后用于從溶液中特異性吸附c-Myc標簽融合蛋白。
市場上針對c-Myc標簽融合蛋白純化用的親和柱和親和磁珠，偶聯的配基大都是單克隆抗體或多克隆抗體。單克隆抗體的研發和生產過程較為繁瑣和復雜，多克隆抗體來源有限。現有的針對c-Myc標簽融合蛋白純化的親和柱和親和磁珠價格普遍偏高。而納米抗體可以在大腸桿菌、酵母等生物中大量表達，有利于降低相關制品的生產成本。
蛋白純化過程中需要用到酸或堿性溶液對目的蛋白進行洗脫。由于單克隆抗體或多克隆抗體由重鏈和輕鏈組成，酸堿洗脫會不可避免的導致抗體活性降低，因而不能重復使用。相比之下，單域重鏈抗體僅由一個結構域組成，具有耐酸堿、耐高溫。本發明中提供的親和吸附材料可重復多次使用。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種針對c-Myc標簽的免疫親和吸附材料及其應用。
為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：
針對c-Myc標簽的免疫親和吸附材料包括載體和配基，所述配基為單域重鏈抗體，具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。該配基可特異性識別c-Myc標簽。
所述配基還可以為在前述單域重鏈抗體基礎上通過隨機或定點突變技術進行改造所獲得的能與c-Myc標簽特異性結合的抗體。
所述載體為磁珠、瓊脂糖凝膠微球、硅膠微球或多孔材料。
上述c-Myc標簽免疫親和吸附材料的制備方法，其特征為：
所述載體為磁珠時，制備方法為：取1mg羧基磁珠于離心管中，加入600～1000μl活化緩沖液(10mM，NaH2PO4，pH 6.0)，渦旋混合均勻，磁力架回收磁珠，再用活化緩沖液洗滌2遍。分別加入1～5mg碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，渦旋混合后，靜置35min。用偶聯緩沖液(10mM，Na2HPO4，pH 7.4)洗滌磁珠5遍，加入抗c-Myc標簽單域重鏈抗體，室溫反應3～5h，得到共價偶聯了抗c-Myc標簽單域重鏈抗體的免疫磁珠；
所述載體為瓊脂糖凝膠微球時，制備方法為：將CNBr活化的干膠用0.1M HCl洗滌10～20次，每次平衡6～10min。用偶聯緩沖液(10mM，Na2HPO4，pH 7.2)洗滌5～20次，加入抗c-Myc標簽單域重鏈抗體，室溫反應3～10h，得到共價偶聯了抗c-Myc標簽單域重鏈抗體的免疫親和吸附材料；
所述載體為硅膠微球時，制備方法為：將硅膠微球用純水和磷酸緩沖液(PBS，10mM，pH 6.5)交替洗滌5～15次，用PBS緩沖液懸浮硅膠微球，加入抗c-Myc標簽單域重鏈抗體，混勻，加入終濃度1～10mg/ml的碳二亞胺(EDC)，迅速混勻，4℃攪拌反應12～20h，得到共價偶聯了抗c-Myc標簽單域重鏈抗體的免疫親和吸附材料。
將上述免疫親和吸附材料(載體為瓊脂糖凝膠微球和硅膠微球)裝填至層析柱，即得到c-Myc標簽免疫親和層析柱，方法為：根據層析柱容量，取適量上述免疫親和吸附材料于層析柱，加入8～10倍柱床體積的PBS(10mM，pH 7.2)洗滌后，4℃，保存于20％乙醇溶液。
本發明還涉及裝載有權利要求1所述c-Myc標簽免疫親和吸附材料的親和層析柱。
上述c-Myc標簽免疫親和吸附材料的應用，用所述c-Myc標簽免疫親和吸附材料對樣品中含c-Myc標簽的蛋白進行純化。當免疫吸附材料的載體為瓊脂糖凝膠微球和硅膠微球時，方法為：首先用PBS(10mM，pH 7.2)洗滌免疫吸附材料，加入樣品提取液，然后用純水淋洗，再用甘氨酸鹽酸(pH 2.2)洗脫特異性吸附的含c-Myc標簽重組蛋白，收集的洗脫液，純化后的樣品提取液，可用于后續分析檢測。當載體為磁珠時，方法為：將免疫磁珠加入純水中，磁力架回收磁珠，重復清洗3～5次，然后將免疫磁珠加入樣品提取液中，混勻，磁力架回收磁珠，純水清洗3～5次后，用甘氨酸鹽酸(pH 2.2)洗脫特異性吸附的c-Myc標簽重組蛋白，收集的洗脫液，即為純化后的樣品提取液，可用于后續分析檢測。
本發明針對c-Myc標簽的免疫親和吸附材料配基為單域重鏈抗體，具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列，該配基可特異性識別c-Myc標簽。該單域重鏈抗體容易獲得，耐熱，可以通過生物學方法大量培養生產配基為單域重鏈抗體，避免了人工抗體等繁瑣生產方法，大大降低了生產成本，并且可重復使用，應用前景廣闊。
具體實施方式
下面通過c-Myc標簽免疫親和吸附材料的制備及應用，對本發明做進一步說明，這些具體實施例不應以任何方式被解釋為限制本發明的應用范圍。
實施例1：
抗c-Myc標簽單域重鏈抗體(即針對c-Myc標簽的單域重鏈抗體)免疫文庫的構建
將c-Myc標簽與牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)共價偶聯，得到c-Myc人工抗原c-Myc-BSA，取300μg c-Myc-BSA與弗氏完全佐劑乳化后，對羊駝(Lama pacos)進行皮下多點注射免疫。加強免疫采用150μg c-Myc-BSA與弗氏不完全佐劑乳化，間隔2周進行，每次免疫7天后靜脈取血，采用間接ELISA法測定血清效價，選擇血清效價最高的樣品分離淋巴細胞，提取RNA。
RNA的提取參照TAKARA公司RNAiso試劑說明書進行。以RNA為模板，oligo dT為引物，參照TAKARA公司反轉錄酶說明書合成cDNA第一鏈。
采用PrimeSTAR高保真DNA聚合酶，經巢式PCR獲得重鏈抗體的可變區編碼基因(采用的引物見表1)。第一輪PCR分別以引物AlpVh-LD和CH2-R擴增cDNA，反應條件為，98℃，10s，55℃，20s，72℃，1min，20個循環，98℃，10s，68℃，1min，72℃延伸10min。
將第一輪PCR產物用1.2％的瓊脂糖凝膠電泳，回收600bp～750bp的DNA片段，作為第二輪PCR的模板，分別用引物AlpVh-SfiI和AlpVHHR1-NotI，AlpVh-SfiI和AlpVHHR2-NotI，進行擴增，反應條件為，98℃，10s，50℃，20s，72℃，40s，5個循環，98℃，10s，68℃，40s，30個循環，72℃延伸10min。經DNA片段回收試劑盒回收、定量，于-20℃保存備用。將噬菌粒pHEN1和PCR擴增產物分別用Sfi I、Not I雙酶切，經瓊脂糖凝膠回收、定量后，以1∶3摩爾比，在16℃，過夜連接。
表1文庫構建及鑒定所用的引物
注：下劃線表示限制性內切酶識別序列
連接產物經乙醇沉淀后，溶于10μL無菌水，分十次進行電穿孔轉化大腸桿菌TG1。取10μL電擊、培養后的菌液倍比稀釋，涂布氨芐青霉素2×YT培養板，計算庫容。其余部分全部涂布于24cm×24cm氨芐青霉素2×YT培養板，37℃，倒置培養13～16h。用10mL，2×YT培養基將培養板上的菌苔刮洗后，加入終濃度20～30％甘油，分裝，-80℃保存備用。
根據計算的庫容量結果，接種10倍庫容量的活細胞于20mL的2×YT(含2％葡萄糖，100μg/mL氨芐青霉素)，37℃，200r/min培養至OD600達0.5，按感染復數20∶1加入輔助噬菌體，37℃，200r/min，60min。將培養物離心，用50mL的2×YT(含100μg/mL氨芐青霉素和50μg/mL卡那霉素)重懸沉淀，37℃，200r/min過夜培養后，8000rpm離心取上清，加入5×PEG/NaCl溶液，冰上放置1.5h或4℃過夜，8000rpm離心30min，重懸沉淀于含10％甘油的磷酸緩沖液(PBS，0.01M，pH 7.4)，即得到抗c-Myc標簽單域重鏈抗體免疫文庫，取10μL測定滴度，其余分裝于-80℃保存備用。
實施例2：
抗c-Myc標簽單域重鏈抗體的淘選與鑒定
采用固相親和淘選的方法從實施例1所得抗c-Myc標簽單域重鏈抗體免疫文庫中淘選針對c-Myc標簽的單域重鏈抗體。向每個酶標孔中加入120μL用PBS稀釋的Myc-GST融合蛋白(Myc標簽與谷胱甘肽融合的蛋白)，4℃，包被過夜，每輪淘選的包被濃度分別為100，75，50μg/mL；吸出包被液，PBS洗板5次，每孔加入300μL 3％BSA-PBS，37℃，封閉2h；PBS洗板5次，加入100μL噬菌體抗體文庫(約含1×1011CFU)，37℃，孵育2.0h；吸出未結合的噬菌體，用PBST(含0.5％Tween-20)洗板3-5次(逐輪增加5次)，再用PBS洗板15-25次；以100μL洗脫液(甘氨酸-鹽酸，pH 2.2)洗脫吸附在酶標孔中的噬菌體，用35μL Tris-HCl(1mol/L，pH 8.0)中和洗脫物，取10μL用于滴度測定，其余125μL洗脫物擴增后用于下一輪淘選。
經四輪淘選后，采用輔助噬菌體KM13對隨機挑取的單克隆進行救援，分別得到展示抗體可變區的噬菌體顆粒，再用間接phage-ELISA測定噬菌體顆粒的結合活性和特異性，實驗設定對照，具體加樣步驟見表2。
表2間接phage-ELISA加樣表
將ELISA陽性克隆送生物技術服務公司進行序列測定，得到插入片段的DNA序列，其編碼針對c-Myc標簽的單域重鏈抗體。
DNA序列(SEQ ID NO.:2)：
CAGTTGCAGCTCGTGGAGTCAGGGGGAGGCGAGGTAAACCCTGGCGGATCTCTGACACTCTCCTGTGTAGCTTCTGGATTCCCCTTCGGTATCAATATCATGAGCTGGGTCCGCCAGGTTCCAGGCAAGGAGCCCGAGTGGGTCGCAGGTATTGATAATGGCGGCAGGCGTACAACATATGCGGACTCCGTGAGGGGCCGCTTCACCATCTCCAGAGACAACGACAAGAACACGTTATATCTACAGTTGGACAACCTCCAACCTAACGACACGGCCCTATATTACTGTTCGAGACAGGGGTGGGGGCAACTTCCTGCAAAGCGCTACTGGGGCAAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCGCA
編碼具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列：
QLQLVESGGGEVNPGGSLTLSCVASGFPFGINIMSWVRQVPGKEPEWVAGIDNGGRRTTYADSVRGRFTISRDNDKNTLYLQLDNLQPNDTALYYCSRQGWGQLPAKRYWGKGTLVTVSA。
實施例3：
抗c-Myc標簽單域重鏈抗體的規模制備
編碼抗c-Myc標簽單域重鏈抗體的DNA片段的獲取：1.采用限制性內切酶SfiI/NotI，雙酶切噬菌粒pHEN-anti-c-Myc單域重鏈抗體基因，瓊脂糖凝膠電泳回收抗c-Myc標簽單域重鏈抗體基因；2.直接將抗c-Myc標簽單域重鏈抗體編碼序列送生物技術服務公司進行化學合成；3.設計特異性引物，通過PCR技術從羊駝(Lama pacos)來源的cDNA庫中擴增。
將得到的抗c-Myc標簽標簽單域重鏈抗體基因片段克隆至表達載體pET25-flag(已將載體本身所帶c-Myc標簽替換為Flag標簽：DYKDDDDK)，經PCR和酶切鑒定，構建完成抗c-Myc標簽單域重鏈抗體的大腸桿菌表達質粒。
將表達質粒轉化至大腸桿菌rosetta，挑取單菌落進行誘導表達。將單菌落接入5mL LB-A(Luria-Bertani broth with 100μg/mL ampicillin)液體培養基中，37℃、220r/min振蕩培養12h；以1％培養基體積的接種量將其轉接到50mL LB-A液體培養基中，37℃、220r/min振蕩培養至OD600達到0.5(約需3～3.5h)，加入終濃度0.1mM的IPTG，30℃、200r/min誘導培養。
誘導培養物8000r/min離心，在細胞沉淀中加入25mL磷酸緩沖液(pH 7.4)混勻，8000r/min離心，去上清，保留細胞沉淀；在細胞沉淀中加入15mL相同緩沖液，混勻，冰上超聲波細胞破碎處理，超聲破碎條件為200W，破碎2s，間歇5s，共250個循環，在4℃下對細胞破碎物8000r/min離心15min，取上清進行親和層析純化和SDS-PAGE電泳分析，或在上清中加入終濃度20％的甘油，混勻，保存于-20℃冰柜待用。
通過優化誘導表達條件(如宿主菌、表達載體、誘導培養時間、溫度以及IPTG濃度等)，可以進一步提高目的蛋白(單域重鏈抗體)表達量，為大量制備抗c-Myc標簽單域重鏈抗體提供了途徑。
抗c-Myc標簽單域重鏈抗體的融合表達：
將本發明抗c-Myc標簽單域重鏈抗體基因克隆至融合表達載體pAP(含有堿性磷酸酶基因)，經PCR和酶切鑒定，構建完成抗c-Myc標簽單域重鏈抗體的堿性磷酸酶融合表達質粒。
堿性磷酸酶可以非特異性催化磷酸單酯水解生成無機磷酸和相應的醇、酚或糖類化合物。該酶常作為信號元件用于ELISA、免疫印跡、組織化學等檢測方法。融合表達質粒將抗c-Myc標簽單域重鏈抗體融合于堿性磷酸酶的N端，參考應用實例3中的表達方法，可以在大腸桿菌中表達、純化出融合蛋白AP-anti-c-Myc標簽單域重鏈抗體。
抗c-Myc標簽的納米抗體的耐熱實驗
通過ELISA實驗對納米抗體熱穩定性進行測定，實驗方法如下：
取濃度為5μg/mL Myc-GST蛋白，以每孔100μL加入96孔酶標板中，4℃包被過夜；0.05％PBST洗板3次；3％的脫脂牛奶37℃封閉l h；加入稀釋后的c-Myc納米抗體，每孔100μL，37℃，孵育1h；加入1：2000工作濃度HRP標記的抗His標簽二抗，每孔加入100μL，37℃，孵育1h；加入TMB顯色液，每孔加入100μL；在多組不同在溫度下孵育30min；反應結束后，加入2M硫酸終止反應，每孔加入50μL，混勻終止反應后測定450nm吸光值。
結果顯示即使溫度高達70℃、80℃、90℃，蛋白活性依然具有生物活性，OD450值分別為1.5、1.4、1.2，具有較好的耐熱性。
實施例4：
c-Myc標簽免疫親和磁珠的小量制備
采用納米磁珠作為載體，偶聯抗c-Myc標簽單域重鏈抗體后，得到c-Myc標簽免疫磁珠，具體制備方法如下：
取1mg羧基修飾的磁珠于離心管中，加入500μl活化緩沖液(10mM，NaH2PO4，pH 6.0)，渦旋混合均勻，磁力架回收磁珠，再用活化緩沖液洗滌3遍。分別加入2mg碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，渦旋混合后，靜置25min。用偶聯緩沖液(10mM，Na2HPO4，pH 7.4)洗滌磁珠3遍，加入溶于偶聯緩沖液的抗c-Myc標簽單域重鏈抗體1mg，室溫反應3.5h，用偶聯緩沖液洗滌磁珠5次，加入500μl含1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)或1％(w/v)卵清蛋白(OVA)的偶聯緩沖液封閉未反應的活性基團，室溫反應35min。用偶聯緩沖液洗滌磁珠5次，PBS溶液(10mM，pH 7.2，0.02％w/v，Na3N)重懸后保存于4℃。
實施例5：
c-Myc標簽免疫親和吸附材料及親和柱的制備
采用瓊脂糖微球作為載體，偶聯抗c-Myc標簽單域重鏈抗體，具體制備方法如下：
將CNBr活化的干膠用0.1M HCl洗滌10次，每次平衡5min。用偶聯緩沖液(10mM，Na2HPO4，pH 7.2)洗滌10次，加入抗c-Myc標簽單域重鏈抗體(2mg/每克瓊脂糖微球)，室溫反應3.5h，使抗c-Myc標簽單域重鏈抗體與CNBr活化的瓊脂糖凝膠微球共價偶聯。用偶聯緩沖液(10mM，Na2HPO4，pH 7.2)洗滌3次后，加入封閉液室溫反應2.5h以封閉未反應的活性基團。用6倍膠體積的磷酸緩沖液(10mM，pH 7.2)和醋酸緩沖液(0.1M，pH 4.5)交替洗滌3次，得到共價偶聯了抗c-Myc標簽單域重鏈抗體的免疫親和吸附材料。取0.2ml上述免疫親和吸附材料于容量為1ml的層析柱，8～10倍柱床體積的PBS(10mM，pH 7.2)洗滌后，加入20％乙醇溶液，4℃保存。
實施例6：
c-Myc標簽免疫親和吸附材料及親和柱的制備
采用硅膠微球作為載體，偶聯抗c-Myc標簽單域重鏈抗體，具體制備方法如下：
取2g硅膠微球用純水和磷酸緩沖液(PBS，10mM，pH 6.5)交替洗滌6～10次，用10ml PBS緩沖液懸浮硅膠微球，加入5mg抗c-Myc標簽單域重鏈抗體，混勻，加入終濃度5mg/ml的碳二亞胺(EDC)，迅速混勻，4℃攪拌反應12～20h，得到共價偶聯了抗c-Myc標簽單域重鏈抗體的免疫親和吸附材料。取0.2ml上述免疫親和吸附材料于容量為1ml的層析柱，58～10倍柱床體積的PBS(10mM，pH 6.5)洗滌后，加入含0.02％(w/v)Na3N的PBS(10mM，pH 6.5)，4℃保存。
實施例7：
c-Myc標簽親和層析柱的吸附量、重復使用測定
用6倍柱床體積PBS(10mM，pH 7.2)清洗柱子，加入蛋白樣品溶液，流出液重新過柱。然后用3倍柱床體積純水淋洗，再用甘氨酸鹽酸(pH 2.2)洗脫特異性吸附的含c-Myc標簽重組蛋白，收集的洗脫液，即為純化后的蛋白溶液。實驗結果表明，裝填有1mL實施例5、6、7制備的親和柱/磁珠可以特異性吸附目的蛋白。重復使用10次之后，回收率仍然大于80％。可以通過生物學方法大量培養生產配基為單域重鏈抗體，避免了人工抗體等繁瑣生產方法，大大降低了生產成本，并且可重復使用，應用前景廣闊。
SEQUENCE LISTING
<110> 南昌大學
<120> 基于抗c-Myc標簽納米抗體的免疫親和吸附材料
<130> 2017
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Thr Cys Val Ala Ser Gly Gly Thr Leu Glu Asn Trp
20 25 30
Asp Ile Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Tyr Phe Ser Ser Asp Gly Ile Arg Asn Tyr Gly Asp Ser Met Arg
50 55 60
Gly Arg Phe Lys Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala Trp Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Arg Leu Ser Val Glu Asp Thr Ser Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Lys Glu Arg Val Gly Arg Ala Trp Arg Asn Asp Gly Leu Tyr Arg
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 372
<212> DNA
<213> Lama pacos
<400> 2
cagttgcagc tcgtggagtc agggggaggc ttggtgcagc ctggggagtc actgacgctc 60
acctgtgtag cctcaggcgg cactttggag aattgggata tagcctggtt ccgtcaggcc 120
ccagggaagg agcgtgaggg ggtcgcatat tttagtagtg atggtattag aaattatgga 180
gactccatga ggggccgatt caaaatctct agagacaacg ccaagaacac agcgtggctg 240
cagatgaatc gcctgagcgt tgaagacacg tccacatatt attgtgcggc caaagaaagg 300
gtcggacgtg catggcgaaa tgatggactt taccgctact ggggccaggg gacccaggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cttggtggtc ctggctgc 18
<210> 4
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (44)..(44)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (47)..(47)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 4
tcgcggccca gccggccatg gcccagktgc agctcgtgga gtcnggngg 49
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cgagtgcggc cgcggggtct tcgctgtggt gcg 33
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cgagtgcggc cgcttgtggt tttggtgtct tggg 34
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
agcggataac aatttcacac agga 24
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gccccattca gatcctcttc 20