利用真菌胞外酶與微生物交替進行的雙重強化采油方法與流程

本發明涉及微生物強化采油技術領域，具體涉及利用真菌胞外酶與微生物交替進行的雙重強化采油方法。

背景技術：

采用傳統方式開采原油時，隨開采時間延長，采油難度增加，采出量逐步降低，但含油地層仍有約2/3的原油難以采出。相對于尋找新的油藏，低成本且能有效增加原油采收率的微生物強化采油法(microbialenhancedoilrecovery，meor)受到廣泛關注。meor依靠微生物自身繁殖或代謝產物提高原油采收率，成本低廉且對環境無害。

meor利用的微生物主要為細菌，其作用機理是通過細菌對油層的直接及間接作用提高原油采收率。其中，直接作用包括加入營養物質激活含油地層的本源微生物，或向含油地層注入外源微生物，使注入細菌在含油地層孔隙中利用原油作為碳源大量生長繁殖，改變原油理化性質，或通過細胞封堵油藏大孔道提高采油率。間接作用指細菌產生的表面活性物質、生物氣、生物酸及生物聚合物等代謝產物的作用。在meor中，向含油地層注入微生物營養物質及外源細菌已在生產中應用，但除此之外，尚無其他增強meor的微生物代謝產物加入。

在自然界的微生物中，真菌難以在高度厭氧的含油地層生長，故長期以來的meor研究未將真菌作為驅油微生物。最新研究發現，真菌胞外酶可將原油中的瀝青、石蠟等大分子降解為小分子，降低原油黏度，改變原油理化性質。真菌雖不能以活菌形式直接參與微生物驅油過程，但真菌可合成并大量分泌催化活性很強的胞外酶，具有通過酶解作用降解原油中的大分子組分、提高原油采收率的潛力。可將利用真菌胞外酶降解原油中大分子組分提高原油采收率的技術稱之為酶法強化采油(enzymolysisenhancedoilrecovery,eeor)。目前尚無關于eeor的報道。

eeor所依據的主要機理是利用真菌胞外酶降解原油中大分子，降低原油粘度，提高采油率。但真菌產生表面活性物質的能力弱，胞外酶中表面活性物質少，加入胞外酶對原油的表面性質、界面性質及乳化性影響小，因此其驅油效果仍不能達到理想的程度。

技術實現要素：

針對現有技術中存在的問題，本發明的目的在于提供一種利用真菌胞外酶與微生物交替進行的雙重強化采油方法，該方法采用酶法強化采油與微生物強化采油交替進行，可顯著提高原油采收率，為微生物強化采油技術提供了新思路以及技術途徑。

為了達到上述目的，本發明采用以下技術方案予以實現。

利用真菌胞外酶與微生物交替進行的雙重強化采油方法，其特征在于，包括驅替液，所述驅替液包含所述真菌胞外酶的酶液和所述微生物的細菌發酵液；所述雙重采油方法為采用所述真菌胞外酶的酶液和所述微生物的細菌發酵液交替驅油。

作為優選地，所述雙重采油方法為先采用所述微生物的細菌發酵液驅油，再采用所述真菌胞外酶的酶液驅油，依此交替驅油。

作為優選地，所述真菌胞外酶的產生真菌為具有脫氫酶合成能力的胞外酶產生真菌。

進一步優選地，所述真菌胞外酶的產生真菌為aspergillusoryzaez3，所述菌株aspergillusoryzaez3，于2016年12月30日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為cctccno：m2016789。保藏地址為中國武漢武漢大學

作為優選地，所述真菌胞外酶的酶液包含脫氫酶。

作為優選地，所述微生物為能降解原油中大分子組分、具有表面活性物質合成能力及產酸產氣能力的細菌。

進一步優選地，所述微生物為細菌pseudomonasaeruginosagx，于2016年12月30日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為cctccno：m2016790。保藏地址為中國武漢武漢大學

作為優選地，所述微生物的細菌發酵液為高細胞密度發酵液或低細胞密度發酵液；所述高細胞密度發酵液為所述微生物的細菌發酵液原液；所述低細胞密度發酵液為對所述微生物的細菌發酵液原液離心處理后去除上層浮油和下層菌體后所得的中層清液或對所述高細胞密度發酵液用水稀釋后得到的稀釋液。

作為優選地，所述高細胞密度發酵液的活細胞數為5.3-6.5×10¹⁴cfu/ml，所述低細胞密度發酵液的活細胞數為1.4-2.3×10²cfu/ml。

作為優選地，所述雙重采油方法為采用所述真菌胞外酶的酶液和所述高細胞密度發酵液交替驅油或采用所述真菌胞外酶的酶液和所述低細胞密度發酵液交替驅油。

本發明提供的利用真菌胞外酶與微生物交替進行的酶法-微生物雙重強化采油方法的核心原理是：將真菌胞外酶對原油中大分子組分的強降解功能與驅油細菌的降解功能及強表面活性物質合成功能以及細菌的產酸產氣等功能相結合；采用酶法強化采油與微生物強化采油交替進行，以防止二者同時進行時驅油細菌對真菌胞外酶的降解作用。酶法強化采油階段(eeor)的主要作用是降解原油中的大分子，微生物強化采油階段(meor)的主要作用是表面活性物質合成，同時降解原油中的大分子，并形成生物氣及生物酸，改變原油的表面、界面性質與乳化性，降低原油的附著性，將eeor階段形成而未驅出的小分子原油與meor階段形成的小分子原油一并驅出。

與現有技術相比，本發明的有益效果為：

本發明所提供的利用真菌胞外酶與微生物交替進行的酶法-微生物雙重強化采油方法具有以下特點：其驅油率遠高于傳統的水驅處理，其中，高細胞密度發酵液與真菌粗酶液交替驅油的累計驅油率較水驅提高了518.7％，低細胞密度發酵液與真菌粗酶液交替驅油的累計驅油率較水驅提高了814.2％，具有極顯著的經濟效益。

附圖說明

下面結合附圖和具體實施例對本發明做進一步詳細說明。

圖1為模擬驅油裝置。包括驅油裝置基本組成、驅油管結構和采氣裝置；具體為：壓力表a1、壓縮空氣入口b1、壓縮空氣出口c1、模擬驅油管d1、上端進出閥門a2、下端進出閥門e2、驅替液貯存管b2、快裝卡箍c2、油沙管d2、不銹鋼濾板g2、棉質濾布h2、密封墊圈f2、采氣管密封玻棒a3、采氣注射器針頭b3、驅油管上端出口連接的導管c3。

圖2為hcf-ces交替驅替和lcf-ces交替驅替的累計原油驅油率；圖中，縱坐標為總驅油率，單位為％，橫坐標為驅替批次數；

圖3為不同的原油驅替方式驅替結束后油沙管內殘留油沙的情況圖；圖中，top為油沙管上段，end為油沙管下段。

具體實施方式

下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域的技術人員將會理解，生產上常稱為采油方法，而在實驗室進行試驗時，常稱為驅油方法，二者表述的是相同的意思。

本實施例所用的材料如下：

模擬驅油用油：采自中國陜北延長油田，該油樣飽和烴含量為684.50g/kg，芳香烴含量108.33g/kg，膠質39.83g/kg，瀝青質含量39.50g/kg，未知組分含量為77.00g/kg。

驅油細菌培養基：葵花籽油50g，葡萄糖8g，玉米漿8g，酵母膏1.2g，nano35g，k2hpo42g，cacl20.12g，mgso40.24g，feso40.12g，na2moo40.08g，水1l。

驅油菌種：為本研究室從中國陜北延長油田長6組井油油樣及油井旁油污土壤分離篩選出的優良驅油微生物，細菌為pseudomonasaeruginosa，代號gx，在genbank的登錄號為kt189160，于2017年1月10日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為cctccno：m2016790；該菌對原油理化性質有顯著影響，對純瀝青的降解效果良好。

pseudomonasaeruginosagx的16srdna序列如seqidno.1所示，具體如下：

tgcaagtcgagcggatgaagggagcttgctcctggattcagcggcggacgggtgagtaatgcctaggaatctgcctggtagtgggggataacgtccggaaacgggcgctaataccgcatacgtcctgagggagaaagtgggggatcttcggacctcacgctatcagatgagcctaggtcggattagctagttggtggggtaaaggcctaccaaggcgacgatccgtaactggtctgagaggatgatcagtcacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgaaagcctgatccagccatgccgcgtgtgtgaagaaggtcttcggattgtaaagcactttaagttgggaggaagggcagtaagttaataccttgctgttttgacgttaccaacagaataagcaccggctaacttcgtgccagcagccgcggtaatacgaagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcgcgtaggtggttcagcaagttggatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcatccaaaactactgagctagagtacggtagagggtggtggaatttcctgtgtagcggtgaaatgcgtagatataggaaggaacaccagtggcgaaggcgaccacctggactgatactgacactgaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcgactagccgttgggatccttgagatcttagtggcgcagctaacgcgataagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttacctggccttgacatgctgagaactttccagagatggattggtgccttcgggaactcagacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgtaacgagcgcaacccttgtccttagttaccagcacctcgggtgggcactctaaggagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacggccagggctacacacgtgctacaatggtcggtacaaagggttgccaagccgcgaggtggagctaatcccataaaaccgatcgtagtccggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagtcggaatcgctagtaatcgtgaatcagaatgtcacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgctccagaagtagctagtctaaccgcaagggggacggtac。

真菌為aspergillusoryzaez3，在genbank的登錄號kt189153，其固態發酵產物具有很高的脫氫酶活性。

該菌株的its序列如seqidno.2所示，具體如下：

gcgagcccaacctcccacccgtgtttactgtaccttagttgcttcggcgggcccgccattcatggccgccgggggctctcagccccgggcccgcgcccgccggagacaccacgaactctgtctgatctagtgaagtctgagttgattgtatcgcaatcagttaaaactttcaacaatggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataactagtgtgaattgcagaattccgtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccccctggtattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgctgcccatcaagcacggcttgtgtgttgggtcgtcgtcccctctccgggggggacgggccccaaaggcagcggcggcaccgcgtccatcctcgagcgtatggggctttgtcacccgctctgtaggcccggccggcgcttgccgaacgcaaatcaatctttttccaggttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcaagccggaggaaa。

真菌酶制劑的制備參見文獻《bacterialdegradationofcrudeoilusingsolidformulationsofbacillusstrainsisolatedfromoil-contaminatedsoiltowardsmicrobialenhancedoilrecoveryapplication》

本實施例所用到的模擬驅油裝置如圖1所示，包括驅油裝置基本組成、驅油管結構和采氣裝置，具體為：壓力表、壓縮空氣入口、壓縮空氣出口、模擬驅油管、上下端進出閥門、驅替液貯存管、油沙管、不銹鋼濾板、棉質濾布、采氣管密封玻棒、采氣注射器針頭、驅油管上端出口連接的導管等。

一、試驗方法：

1.模擬驅油驅替液制備

細菌gx發酵液：于600ml組培瓶中加入150ml驅油細菌培養基，121℃滅菌30min，待冷卻后接種5ml細菌gx種子液(用接種環從細菌斜面挑取1環菌體接種至100ml滅菌的牛肉膏蛋白胨液體培養基中，37℃，150r/min搖床振蕩培養3d)，37℃，150r/min搖床振蕩培養5d，4℃保存待用。經稀釋平皿涂抹法測定，發酵液活細胞數為5.3-6.5×10¹⁴cfu/ml；經排油圈法測定，發酵液的排油圈直徑為19.3-24.2cm。

高細胞密度發酵液(highcelldensityfermentationbroth，hcf)：細菌gx發酵液原液。

低細胞密度發酵液(lowcelldensityfermentationbroth，lcf)：將細菌gx發酵液于4℃，10000r/min離心5min去除上層浮油及下層菌體，中層清液4℃保存備用，其中的活細胞數為1.4-2.3×10²cfu/ml，排油圈直徑為22.3-23.9cm。

驅油酶液：稱取aspergillusoryzaez3粗酶粉3.00g加入裝有200ml自來水的500ml三角瓶中，于28℃120r/min搖床中振蕩15h，適量玻璃纖維過濾，所得濾液即為粗酶液(crudeenzymesolutions,ces)。2次eeor所用酶液的脫氫酶活性分別為80.38u和72.56u。

2.模擬驅油驅油管準備

油沙管填充材料：細沙，粒徑0.15-0.25mm(60-100目)，其中，石英為78％，長石6％，重質礦物16％。用2mol/l稀鹽酸溶液浸泡細沙12h，用大量自來水沖洗，以除掉其中的caco3等酸溶鹽及水溶性鹽，再用純水除去殘留的礦質離子；80℃烘干后用磁鐵去除沙粒中的鐵屑，密封裝袋備用。用排水法測定真體積，計算得真密度ρ為2.56g/cm³。

油沙管準備及驅油管組裝：在空油沙管下端鋪好濾布、不銹鋼濾板后加硅膠墊圈，與下端閥門準確對接后用快裝卡箍將二者組合，垂直放置；將300.0g細沙分次從空油沙管上端均勻裝填到油沙管中，每次裝填后均用直徑為24mm的平頭圓木棒搗實。待全部細沙裝填完畢，用木棒自下而上環油沙管均勻敲擊油沙管外壁5min，保證管內細沙達到致密狀態；在裝滿細沙的油沙管上端加濾布、不銹鋼濾板及硅膠墊圈，再用快裝卡箍將油沙管與驅替液貯存管及上端閥門連接，組裝成完整的模擬驅油管。在制備好的油沙管中，沙芯柱高290mm，直徑29mm，容重1.57g/cm³，根據公式(1)計算，沙芯柱的孔隙度為38.8％。沙芯孔隙體積(porevolume,pv)為74.3cm³。

原油填充：將100ml原油加入到200ml燒杯中，60℃水浴溶化，擦干燒杯外壁，稱量燒杯與原油的初始總質量(m1)；關閉驅油管下端開關，將約100ml原油灌入驅替液貯存管；加墊圈后用快裝卡箍將驅替液貯存管與上端閥門及壓縮空氣導管連接；將此燒杯置于油沙管下端出口，打開驅油管上下開關，從驅替液貯存管上端通入0.1mpa壓縮空氣，將驅替液貯存管內原油壓入油沙管內，使原油進入沙芯孔隙中并附著在組成多孔體的沙粒載體表面；繼續通入壓縮空氣，使油沙管內多余原油流入下端的接收燒杯中，直至出口不再有油滴滴下繼續用壓縮空氣驅替30min，保證沙芯柱孔隙中的游離態原油盡可能被空氣驅出。關閉驅油管上下開關，稱量此時燒杯及杯內原油總質量(m2)，m1與m2之差為油沙管內沙芯多孔體吸附的原油質量。將驅油管置28℃培養箱老化24h，使油沙管沙芯多孔體中的原油進一步均勻分布于沙粒載體表面。

松結合態原油驅除：保溫老化結束后取出驅油管，向驅替液貯存管中加入100ml45℃純水，將已定量(m3)的250ml三角瓶c1置于油沙管下端出口，打開驅油管上下開關，從驅替液貯存管上端持續通入0.1mpa壓縮空氣，至驅油管下端出口不再有水滴流出時關閉空氣壓縮機，此時隨純水流出的原油為沙芯多孔體孔隙中可用水驅出的松結合態原油。將c1置于4℃冰箱中冷卻，待原油凝固后小心倒出三角瓶c1內純水，使原油附著到三角瓶c1瓶壁上，自然風干三角瓶c1，稱取c1質量(m4)，m4與m3之差為水驅松結合態原油質量。(m2-m1)-(m4-m3)為油沙管初始含油量。

3.原油驅替

本實施例提供兩種原油驅替的方法，包括meor和eeor兩種方式，其中，meor包含hcf驅替和lcf驅替，eeor為ces驅替，具體組合如下：

對照空白驅替方法a：

ck，水驅，連續5批次均為水驅；

原油驅替方法b：

hcf與ces交替驅油，連續5批次按hcf-ces-hcf-ces-hcf順序交替進行。

原油驅替方法c：

lcf與ces交替驅油，連續5批次按lcf-ces-lcf-ces-lcf順序交替進行。

本實施例提供的驅替過程共進行5批次，每批次培養7d，溫度40℃。

驅替方法：

hcf驅替：向驅油裝置的驅替液貯存管中加入100mlhcf，將已定量(m5)的250ml三角瓶c2置于油沙管下端出口下方，打開驅油管上下端開關，從驅油管上端緩慢通入0.1mpa壓縮空氣，待發酵液逐滴流出約20ml時關閉空氣壓縮機，將流出的hcf再次返回驅替液貯存管，相同步驟重復3次，以保證hcf充滿沙芯多孔體孔隙中。向驅替液貯存管內加滿驅替液，排凈空氣后關閉驅油管上下端開關，結束注入。將已完成hcf充填的驅油管置于40℃培養箱，培養7d。

lcf驅替：用lcf代替hcf，其他操作同hcf驅替。

ces驅替：將100mlces加入已完成hcf、lcf驅替的驅替液貯存管中，其他操作同hcf驅替，用ces對油沙管中hcf、lcf驅替后殘留原油進行真菌酶解驅替。

水驅(ck)：以100ml純水代替hcf，共進行5批次水驅替，其操作過程同hcf。

4.驅替過程中產氣分析

氣體收集：待驅替培養結束后，將三角瓶c2置于油沙管下端出口下方，將氣體收集裝置連接在驅替液貯存管上端，于針頭處連接一次性注射器。打開驅油管上端開關，管內所產氣體推動注射器活塞直至移動停止(驅油管內氣壓與大氣壓平衡)，記錄注射器氣體體積，小心取下注射器，密封注射器前端出氣口。

產氣分析：氣體中co2體積利用堿吸收法測定。同時記錄殘留氣體體積，并用氣相色譜法鑒定堿吸收殘留氣體成分。

5.驅替注入液與驅出液分析

驅出液水相收集：在氣體收集結束后取下氣體收集裝置，連接空氣壓縮機，打開油沙管下端出口，從驅替液貯存管上端持續通入0.1mpa壓縮空氣，待油沙管下端驅出約20ml液體時移開三角瓶c2，取已滅菌具塞玻璃瓶收集約10ml驅油管內液體，其中的水相用于活菌數、ph、排油圈直徑及脫氫酶活性測定，剩余液體轉入c2瓶中回收其中的原油。

理化性質：測定驅出液及驅替液注入液的ph、脫氫酶活性、排油圈直徑及表面張力(所用儀器為jyw-200a液體表、界面張力儀)。

微生物分析：采用稀釋平板涂布法測定驅出液及驅替液注入液的活細菌總數，并對平皿中數量多、占總細菌總數比例最高的優勢細菌進行鑒定，觀察菌落特征，進行16srdna序列分析，將獲取的序列在ncbi數據庫blast程序中進行相似度搜索比對，建進化樹，確定其分類地位。

6.驅出原油分析

原油收集及質量測定：在驅出液水相收集結束后，將三角瓶c2復位，連續通入壓縮空氣至油沙管下端出口不再有發酵液流出時關閉空氣壓縮機。另取已定量(m6)的250ml三角瓶c3置于油沙管下端，依照同一步驟向驅替液貯存管加入100ml45℃純水，由驅替液貯存管上端持續通入0.1mpa壓縮空氣，以驅出油沙管內殘余發酵液，該水驅過程重復兩次。將c2、c3置于4℃冰箱中冷卻，待原油凝固后小心倒出三角瓶內水相，收集c2水相測定表面張力。自然風干c2、c3，使原油附著到三角瓶壁上，稱取c2質量(m7)，c3質量(m8)。質量m8+m7-m6-m5即為發酵液驅出的吸附態原油質量。驅油率odr％(oildisplacementrate,odr％)據式(2)計算，meor或eeor處理較水驅處理增率⊿ck％據式(3)計算，驅替液注入與驅出時各參數的變化率⊿in％據式(4)計算計算：

式中：mt與mck分別表示meor或eeor處理與水驅處理的各參數值；tout與tin分別表示驅替液驅出與注入時的各參數測值。

meor、eeor及水驅替(ck)時驅替產物收集及計算均采用上述方法。

7.油沙中殘留原油分析

油沙中殘留原油質量測定：待5批次驅替完成后，從油沙管上端開始，按順序逐步掏出油沙，分別稱取沙芯上段(0-3cm)、中段(13-16cm)及下段(27-29cm)油沙，用正己烷分次溶解油沙中殘留原油，直至油沙顏色接近細沙原色為止，回收有機相自然揮發，即得殘留原油重(m1)，烘干已洗凈細沙并稱重(m2)，油沙中殘留原油含量oc(oilcontent,oc)依據式(5)計算：

油沙管上下段殘留原油族組分測定：

瀝青質：將殘留原油質量測定回收的油沙管上下段原油用正己烷按原油：正己烷為1:35的比例溶解，溶解液靜置沉降24h，3500r/min離心5min，分別收集沉淀和有機液相。將沉淀置干燥器中干燥稱重，即得瀝青質質量。有機液相采用氧化鋁柱層析法測定原油族組成。

未知組分質量測定：層析結束后回收層析柱內氧化鋁，脫脂棉及(nh4)2so4，烘干稱重，計算層析結束后柱內總質量與初始質量的差值，即得層析柱中殘留的未知組分質量。根據式(6)計算各組分質量占原油總質量的比例p，據式(3)計算各組分較對照的相對增率。

式中：w2及w1分別表示某組分接受瓶與組分總質量及空瓶質量，wck為正己烷洗出的不同部位殘留原油總質量。

8.油沙管流速測定：

在水洗結束后，向驅替液貯存管加入100ml純水，由驅替液貯存管上端持續通入0.1mpa壓縮空氣，待油沙管下端有液體滴出時開始計時(t1)，不再有液體滴出時結束計時(t2)，據式(7)計算100ml純水通過油沙管的流速cs(currentspeed，cs)。

利用sas9.2(sasinstituteinc,cary,nc,usa)對所有數據進行相關性分析及差異顯著性檢驗。

二、試驗結果與分析

1、驅油率

由表1看出，hcf-ces交替驅替與lcf-ces交替驅替在5批次驅替過程中的累計驅油率分別為27.53％與41.84％，分別為水驅的6.2倍與9.4倍，與水驅處理的差異均達到顯著水平(p＜0.05)，且lcf的總驅油率、總驅油量均顯著高于hcf(p＜0.05)。在5批次驅替過程中，在第1批次及第3批次的meor中，lcf的驅油率、驅油量均顯著高于hcf(p＜0.05)。

表15次驅替過程中meor與eeor的驅油量及驅油率

注：同行不同小寫字母表示同1批次驅替不同處理差異顯著(p＜0.05)，同列不同大寫字母表示相同處理下不同驅替批次差異顯著(p＜0.05)。

從表1看出，eeor也有良好的驅油效果。在第2、4批次的eeor中，ces1(與hcf交替的eeor)與ces2(與lcf交替的eeor)的驅油量分別為水驅處理的2.55與2.59倍、18.5與23倍，驅油率分別為水驅處理的2.71與3.56倍、26.4與39.4倍，二者與水驅處理差異均顯著(p＜0.05)。由于2、4批次eeor所用ces相同，故ces1與ces2的驅油量、驅油率均無顯著差異(p＞0.05)。

由圖2看出，hcf、lcf累計驅油率均較水驅處理大幅增加，且lcf-ces交替驅替的驅油率大于hcf-ces交替驅替。

2、驅替過程中原油移動量

由表2看出，5批次驅替結束后，油沙管上段、中段及下段的殘留原油含量不同。水驅ck、hcf-ces交替驅替及lcf-ces交替驅替處理的殘留油含量均為上段＜中段＜下段，說明驅油過程中原油在油沙管內從上部向下部移動。在上段、中段及下段，lcf-ces交替驅替的殘留原油含量較水驅對照分別降低29.4％、28.2％及11.2％，其降幅遠高于hcf-ces交替驅替的11.5％、3.9％及3.4％，表明lcf-ces交替驅替的原油遷移量遠大于hcf-ces，其中油沙管上段和中段lcf-ces交替驅替的殘留原油含量均顯著低于hcf-ces交替驅替(p＜0.05)。上述結果表明低細胞密度有利于原油在驅替過程中遷移。

表2驅替結束油沙管殘留原油含量oc(g/kg)

注：同行不同小寫字母表示相同位置不同處理差異顯著(p＜0.05)；同列不同大寫字母表示相同處理不同位置殘留原油含量差異顯著(p＜0.05)。

由圖3看出，lcf-ces交替驅替的油沙管內油沙顏色較淺，表明殘留原油量少，hcf-ces交替驅替次之，水驅處理油沙管內油沙顏色最深。其中lcf-ces交替驅替的油沙管內油沙顏色分布較為均勻，hcf-ces交替驅替與水驅處理油沙管內油沙顏色由上段向下段逐漸加深。

3、驅替過程中油沙管殘留原油族組成變化

由表3看出，在油沙管上段，經5批次驅替后，在hcf-ces與lcf-ces交替驅替處理殘留原油中，飽和烴及瀝青含量分別較水驅降低65.9％與44.5％及56.2％與37.8％，且其差異均達到顯著水平(p＜0.05)；上述結果表明，高密度細胞驅替液對原油的利用及降解能力大于低密度細胞驅替液。hcf-ces與lcf-ces交替驅替處理的膠質及未知組分含量較水驅處理分別增加了191.2％與240.0％及151.1％與70.5％，與水驅處理的差異均達到顯著水平(p＜0.05)，表明油沙管上段以原油的降解及向下遷移為主，原油中原有及新產生的輕組分飽和烴大量向下移動，導致殘留原油重組分相對含量增加。2種交替驅替方式的芳香烴含量雖有增加，但與水驅處理的差異均未達到顯著水平(p＞0.05)。

由表3看出，在油沙管上段，hcf-ces、lcf-ces2種交替驅替的4種可檢測組分及未知組分總和分別較水驅處理降低21.4％、14.2％，該降低值為檢測過程中原油中易揮發組分隨有機相揮發造成的損失，其中hcf-ces交替驅替處理較lcf-ces交替驅替處理降低幅度更大，則從另一角度表明細胞密度高時降解原油產生的易揮發輕組分含量亦較高。

表3油沙管上段殘留原油族組分

注：同行數據后不同小寫字母表示相同組分不同處理差異顯著(p＜0.05)。

由表4看出，在油沙管下段，經5批次驅替后，hcf-ces交替驅替的膠質含量顯著低于lcf-ces交替驅替處理(p＜0.05)；除膠質外，其他4種組分含量均表現出hcf-ces交替驅高于lcf-ces交替驅的現象，但僅未知組分的差異達到顯著水平(p＜0.05)，表明油沙管下段這4種組分含量與細胞密度之間呈正變關系：即高密度細胞處理的含量較高。此外，hcf-ces交替驅與lcf-ces交替驅作用后原油中飽和烴，芳香烴及未知組分較水驅處理均有所降低，其中芳香烴及lcf-ces組合的未知組分的降低幅度達顯著水平(p＜0.05)；膠質含量較水驅處理有所增加，其中lcf-ces交替驅替與水驅處理的差異顯著(p＜0.05)。該結果表明，不同處理原油驅替結束后，殘留油輕質組分含量減少；在輕質組分被驅出后，難降解及驅替的膠質組分相對含量增加。

由表4看出，在油沙管下段，hcf-ces、lcf-ces2種交替驅替的4種可檢測組分及未知組分總和分別較水驅處理降低9.9％、16.2％，該降低值為上述組合中微生物及真菌酶對原油降解產生的可揮發性輕質組分隨有機溶劑揮發造成的損失。

表4油沙管下段殘留原油族組分

注：同行數據后不同小寫字母表示相同組分不同處理差異顯著(p＜0.05)。

比較表3和表4油沙管殘留油上、下段原油組分含量差異，可知hcf-ces交替驅替、lcf-ces交替驅替下段的飽和烴含量遠大于上段，反映了飽和烴在驅替過程中向下大量遷移累積，導致下段的芳香烴，膠質與未知組分含量均相對降低，出現下段低于上段的現象。

4、驅替過程中產氣量及成分

4.1產氣量：由表5看出，在5批次驅替過程中，水驅處理均未產氣。在meor及eeor中，均有不同量氣體產生，且meor的產氣總量遠高于eeor。在meor中，hcf、lcf處理的產氣總量分別為249.0ml/管、115.0ml/管，hcf的產氣總量為lcf的2.2倍。在eeor過程中，產氣量很少，ces1、ces2處理的產氣總量分別約為meor的1/25、1/35。

表5meor、eeor驅替過程產氣種類及產氣量

注：同列不同小寫字母表示相同處理不同驅替批次的差異顯著(p＜0.05)；同行同組分不同大寫字母表示相同驅替批次不同處理同種氣體產量差異顯著(p＜0.05)。

4.2產氣種類：由表5可知，驅替過程中所產氣體以h2為主，還有少量co2。在meor中，hcf、lcf處理h2總產量分別為223.37、104.12ml/管，同一驅替批次h2/co2值差異不大，但不同驅替批次h2/co2變化大。如1、3、5批次，hcf與lcf處理的h2/co2分別為7.22與8.12、8.28與9.08、16.49與15.77。在eeor中，僅在第2批次產氣，hcf處理、lcf處理的h2/co2分別為8.34、8.03。

5、油沙管微生物及其與驅替液流速及驅油率的關系

由表6中驅出液中微生物分析結果看出，在驅替培養過程中，油沙管中生活著大量細菌。在水驅處理、meor及eeor中，驅出液中皆有細菌檢出，但數量不同。水驅處理中細菌來源于原油中的本源細菌，這些細菌在油沙管中以原油為碳源能源生長繁殖；meor及eeor中的細菌來源于原油中的本源細菌及接種的gx。在meor中，hcf、lcf驅出液的活菌數分別為9.00×10⁷～3.89×10¹⁵cfu/ml、4.33×10⁵～1.23×10⁹cfu/ml，驅出液活細菌數隨驅替批次數增加逐漸降低。在eeor中，ces1、ces2驅出液活細菌數分別為3.07×10⁶～9.00×10⁶cfu/ml、7.73×10⁵～1.65×10⁷cfu/ml。

表6驅替過程驅出液活細菌數

表7驅替過程驅替流速

注：同列不同小寫字母表示相同驅替批次不同驅替方法顯著差異(p＜0.05)，同行大寫字母表示相同驅替方法不同驅替批次顯著差異(p＜0.05)。

結合表6和表7看出，驅出液流速與驅替液注入細胞數有關。在第4次eeor驅替與第5次meor驅替過程中，液相流速均為水驅處理＞lcf-ces組合處理＞hcf-ces組合處理，且流速差異均達到顯著水平(p＜0.05)，即高細胞密度處理驅替時驅出液流速低。

從表8看出，在含有水驅處理時，驅出液中的細菌數量與驅油率之間存在顯著(p＜0.05)或極顯著正相關(p＜0.01)。即油沙管中生活的細菌數量愈多，驅油率愈高。值得注意的是，在不含有水驅的第5批次meor中，驅油率與驅出液中的活細菌數呈顯著的負相關(p＜0.05)，表明在均有細菌注入的情況下，注入液的細菌細胞密度過大，對驅油率提高不利。

表8驅出液活細菌數與驅油率的相關性

注：表中*、**分別表示驅出液中的細菌數量與驅油率的相關性達到顯著(p＜0.05)、極顯著水平(p＜0.01)。

由表9看出，驅出液中優勢細菌共7種，水驅處理、meor及eeor中的優勢細菌不同，相同處理不同批次驅出液中優勢細菌也不相同。除了pseudomonasaeruginosa為接入細菌外，其他6種均為在驅替培養過程中大量生長繁殖的原油中的本源細菌。

6、驅替過程中驅替液性質變化

由表10、表11看出，在3次meor及2次eeor中，驅替液在注入前與驅替結束后各項性質均會發生程度不同的變化。

ph：在meor及eeor中，驅替結束后，驅出液ph均較注入液降低，表明在驅替過程中有產酸作用。其中，在meor中，hcf、lcf處理的驅出液ph分別較注入液降低12.0％～20.1％、5.4％～19.2％；在eeor中，ces1、ces2處理的驅出液ph分別較注入液降低11.0％～17.0％、9.4％～15.3％。

表面張力：meor及eeor中，驅替結束后，驅出液表面張力均較注入液減小。在meor中，hcf、lcf驅出液的表面張力較注入液分別減少3.0％～18.7％、4.9％～27.5％；在eeor中，ces1、ces2驅出液的表面張力較注入液分別減少2.2％～17.0％、2.2％～18.0％。

表9驅出液中的優勢細菌

排油圈直徑：meor及eeor中，驅替結束后，驅出液排油圈直徑均較注入液減小，表明在驅替過程中驅替液中的表面活性物質減少。其中，在meor中，hcf、lcf驅出液的排油圈直徑較注入液分別減少27.0％～42.1％、29.8％～43.2％；在eeor中，ces1、ces2驅出液的排油圈直徑較注入液分別減少21.2％～22.8％、32.1％～45.8％。除第3次驅替過程中hcf處理外，其余處理注入液與驅出液的排油圈直徑差異均達到顯著水平(p＜0.05)。

表10meor驅替過程注入液與驅出液參數

注：同1批次同1驅替方式同列不同小寫字母表示某種屬性注入與驅出差異顯著(p＜0.05)。

脫氫酶活性：在第2次和第4次eeor過程中，注入的ces均具有脫氫酶活性，但驅出液脫氫酶活性均未測出，可能與驅替過程中油沙管中的細菌以脫氫酶蛋白為氮源生長消耗有關。

由表12看出，在3批次meor中，2批次驅替液的排油圈直徑測值與ph的變化率呈顯著相關(p＜0.05)，3批次驅替液的排油圈直徑測值與表面張力測值呈極顯著(p＜0.01)或顯著(p＜0.05)負相關，2批次驅替液排油圈直徑測值與表面張力測值變化率呈極顯著(p＜0.01)或顯著(p＜0.05)正相關。

表11eeor驅替過程注入液與驅出液參數

注：同1批次同1驅替方式同列不同小寫字母表示某種屬性注入與驅出差異顯著(p＜0.05)。

表12meor驅替過程驅替液性質的相關性

從表13看出，在2批次eeor中，2批次驅替液的脫氫酶活性測值及其變化率與表面張力測值及其變化率呈極顯著(p＜0.01)或顯著(p＜0.05)相關，其中，第4批次驅替液的排油圈直徑、表面張力及脫氫酶活性測值及變化率與ph變化率的相關性達到極顯著(p＜0.01)或顯著(p＜0.05)水平。

表13eeor驅替過程驅替液性質的相關性

7、驅替液性質與驅油率的關系

由表14看出，在3批次meor中，3批次驅替注入液及2批次驅出液的表面張力測值與驅油率分別呈極顯著(p＜0.01)負相關及顯著正相關(p＜0.05)，2批次驅替液表面張力測值變化率與驅油率呈極顯著(p＜0.01)正相關；3批次驅替注入液與驅出液的排油圈直徑測值及其變化率與驅油率呈極顯著(p＜0.01)或顯著(p＜0.05)正相關及負相關。

由表14看出，在2批次eeor中，2批次注入液與驅出液的排油圈直徑測值及變化率分別與驅油率呈極顯著(p＜0.01)或顯著(p＜0.05)正相關及負相關。以上結果表明，驅替液的表面活性是影響驅油率的主要因素。

由表14看出，在2批次eeor中，2批次注入液的脫氫酶活性測值與驅油率呈極顯著(p＜0.01)或顯著(p＜0.05)正相關，脫氫酶活性測值變化率與驅油率呈極顯著(p＜0.01)或顯著(p＜0.05)負相關。該結果表明，真菌脫氫酶活性對驅油率影響很大，酶解作用對提高原油采收率有重要價值。

表14驅替過程液相性質與驅油率的相關性(n＝9)

注：*、**分別表示相關性達到顯著水平(p＜0.05)、極顯著水平(p＜0.01)。

由以上試驗結果可知，在meor過程中，高細胞密度發酵液處理的累計驅油率、原油在油沙管內遷移率及驅替液流速均低于低細胞密度發酵液處理，但高細胞密度發酵液對原油的降解能力強，產氣量大，驅出液中的細菌總數與優勢細菌數量均高于低密度細菌細胞發酵液。高細胞密度發酵液驅替時流速較低，其原因為高細胞密度發酵液含大量菌體，充滿油沙管內孔隙，產生了類似近井堵塞現象，進而限制了代謝產物向孔隙內的深入，也減弱了驅替液在沙芯中的均勻分布與流動，致使表面活性物質分布不均勻，難以與原油充分接觸，降低了驅替液流速及原油向驅出方向移動，最終導致原油在油沙管內遷移慢，驅油率降低。但由于高細胞密度發酵液細胞數量多，對原油中飽和烴及瀝青等重質組分的降解作用強，產氣量大。

第4次eeor驅替與第5次meor驅替過程中，驅替液流速均為水驅處理＞低細胞密度發酵液處理＞高細胞密度發酵液處理，三者差異顯著(p＜0.05)，進一步證明了高細胞密度發酵液處理對油沙管內孔隙的封堵作用確實存在。結合高密度細胞處理meor驅油率低的現象，可以得到如下結論：在meor中，驅替注入液的細胞密度過高，不利于采收率提高。

meor的驅油機理：表面活性物質驅油；產酸產氣驅油；降解大分子驅油。

在meor驅替過程中，驅替注入及驅出液的排油圈直徑與驅油率呈穩定的顯著正相關(p＜0.05)。由于排油圈直徑大小代表生物表面活性物質含量及表面活性，因此，該結果表明微生物產生的表面活性物質決定著驅油率高低。生物表面活性物質是微生物在一定條件下代謝合成的具有一定表面活性和界面活性，同時含有親水基和疏水基的兩性化合物，具有降低烴類物質與驅替液水相間的界面張力，并能剝落重質原油，促進原油采收率提高。

在meor中，不同驅替處理注入與驅出液的ph均降低，并有大量氣體產生，其中以氫氣為主，表明在驅替過程中產酸產氣。其中高細胞密度發酵液處理比低細胞密度發酵液處理的ph降低幅度更大，產酸及產氣量更大。由此可知，驅替培養過程中的產酸產氣量取決于細菌細胞密度。多數微生物在厭氧代謝過程中會產生一定量的有機酸。有機酸可降低油水之間的界面張力，形成油水乳濁液，從而提高原油采收率；也可產生各種氣體，如co2、h2、ch4等，這些氣體能夠增加油層內部壓力；氣體溶入原油會降低原油黏度，改善原油流動性；另外co2溶于水后形成的碳酸還可以起到酸化作用，在一定程度上降低油水之間的界面張力，提高單井產能。

隨驅替批次增加，meor驅出液活細菌數量逐漸降低，其中高細胞密度發酵液處理驅出液中的活細菌數降低幅度大于低細胞密度發酵液處理。產生該現象的原因是，隨驅替次數增加，油沙管原油中可被細菌作為碳源能源利用的小分子易利用組分不斷減少，導致細菌繁殖速率降低。由于細胞數量多，高細胞密度處理油沙管原油中易利用碳源減少量更大，可利用碳源能源更少，因而菌體繁殖受限更嚴重，驅出液中的活細菌數下降更明顯。

上述驅油試驗中，驅油菌種中的真菌也可以是其他具有脫氫酶合成能力的胞外酶產生真菌；細菌也可以是其他能降解原油中大分子組分、具有較強的表面活性物質合成能力及產酸產氣能力的強化采油細菌。

上述驅油試驗中，驅油酶液中除了包含脫氫酶外，還包含部分其他水解酶系。驅油酶液也可以是對粗酶粉進行精制，將所得純酶加入水中得到的純酶液，具有與粗酶液相同的功能。

通過上述試驗結果可總結eeor的驅油的機理如下：

在eeor中，注入液脫氫酶活性與驅油率呈顯著(p＜0.05)或極顯著(p＜0.01)正相關，表明真菌酶對驅油率影響顯著，eeor是提高原油采收率的新途徑。由于真菌胞外酶降解原油中石蠟、瀝青等重質組分的能力強。采用真菌胞外酶進行的eeor主要機理是降解作用。在eeor驅替過程中，原油族組成發生顯著變化，證明eeor中降解作用存在，表明驅替過程中真菌酶對原油中大分子有較強的降解作用，油沙管上段殘留原油中飽和烴及瀝青含量大幅度下降也支持該推論。在eeor過程中，注入的粗酶液具有脫氫酶活性，但驅出液的脫氫酶活性未能檢測出，其原因在于油沙管中有大量細菌生存，驅替液中的脫氫酶酶蛋白可被細菌作為氮源利用，導致驅出液體脫氫酶活性喪失。因此，在eeor中，真菌胞外酶的降解作用僅在驅替前期進行。

據上述試驗結果可總結meor-eeor交替驅油的驅油特點及機理如下：

在eeor中，真菌胞外酶對原油中大分子組分降解能力強，粘度降低顯著，但酶液的表面活性物質作用弱，酶解產生的小分子組分因缺乏表面活性物質的脫附作用未能全部遷移驅出，但為表面活性物質進行原油脫附及驅出奠定了基礎。meor過程中，驅油作用主要來源于細菌合成的表面活性物質，同時利用細菌對原油的降解及產酸產氣等多種機制，改變原油理化性質、表面與界面性質及乳化性，降低原油在油藏中的附著性，提高驅出率。在eeor之后進行meor，就可將油藏中能脫附的原油驅出，之后再多次重復eeor-meor過程，就可最大限度將原油地質貯量變為現實產量，大幅度提高原油采收率。

本發明將meor與eeor結合，進行eeor-meor的交替驅油，克服了各自的不足之處。meor中的細菌產表面活性物質，具有強烈的脫附作用，可將eeor中產生的酶解產物驅出，導致meor驅出量增加。在meor后再進行eeor中，重復上述的eeor降解-meor驅出過程，從而使meor-eeor的驅油量遠高于meor或eeor單獨的驅油效果。

依照原油驅替規律，隨著驅替次數增加，單批次的驅油量會逐步降低。但從本發明的試驗結果發現，經過第2次粗酶液作用后，第3次meor驅替過程中低細胞密度發酵液處理的驅油量不僅未降低，反而有所增加，證明上述過程存在。即經過第2次粗酶液的酶解作用，油沙管內殘留的原油組分發生改變，易于被驅替的小分子組分增加，導致進行meor時這些酶解產物因表面活性物質充分乳化被驅出，使驅油量增加。在進行第4批次eeor時，油沙管已連續驅替3次，含油量較低，粗酶液可酶解的剩余原油重組分含量較多，粗酶液的酶解與第5次高細胞密度發酵液中菌體的降解相結合，使第5次meor驅替過程中高細胞密度發酵液處理的驅油量增加。經過eeor作用后，meor過程驅油量均有不同程度增加，充分顯示了eeor-meor交替驅油的巨大增產潛力。

水驅處理的累計驅油率趨勢線已達到平穩趨勢，表明經過5次驅替，水驅處理已基本達到驅油極限，而高細胞密度發酵液-粗酶液組合處理與低細胞密度發酵液-粗酶液組合處理在累計驅油率已達到27.53％與41.84％的前提下趨勢線仍呈上升趨勢，表明eeor-meor交替驅油具有更高的驅油潛力。結合低細胞密度發酵液-粗酶液組合處理油沙管上段殘留油含量，可推測在給予足夠驅替次數的條件下，低細胞密度發酵液-粗酶液組合處理油沙管中段及下段的殘留油含量可逐步降低接近上段殘留油含量，即油沙管內油沙含油量≤37.9g/kg。根據驅替前注入原油量計算，低細胞密度發酵液-粗酶液組合處理油沙管內油沙初始含油量為89.0g/kg，可推測出低細胞密度發酵液-粗酶液組合處理的極限驅油率≥57.4％，遠高于目前的平均采收率33％。

另外，在meor、eeor中及未注入外源細菌的水驅處理中，驅出液中均有大量細菌。meor中的細菌主要為外源注入細菌，eeor中的細菌主要為與meor交替驅油時meor殘留的細菌，水驅處理中細菌則為原油中的本源細菌在驅替培養時以原油為碳源能源生長繁殖而來。水驅處理、meor及eeor中的優勢細菌分別為p.aeruginosa、b.atrophaeus及b.cereus，與注入時的細菌種類及數量相比，均發生較大變化。其中對照水驅過程并未注入細菌，驅出液中的優勢菌p.aeruginosa為油藏中常見菌，所產表面活性物質鼠李糖脂可降低液相的表面張力，保持較高的乳化能力，并對原油有降解能力。高細胞密度發酵液-粗酶液組合處理與低細胞密度發酵液-粗酶液組合處理注入液優勢菌均為p.aeruginosa，驅出液優勢菌為b.atrophaeus與b.cereus，其中b.atrophaeus由含油土壤中分離出，其固態發酵菌劑能夠增加改變原油理化性質，b.cereus可由油井水中分離出，并可降解原油中飽和烷烴且降低原油粘度。由此可見，高細胞密度發酵液-粗酶液組合處理與低細胞密度發酵液-粗酶液組合處理驅替出優勢菌均為原油中的本源微生物，這些微生物在驅替培養中大量繁殖，在驅油時進入驅出液。

綜上模擬試驗得到如下結果：真菌粗酶液對原油具有良好的酶解驅除作用；真菌胞外酶與細菌交替進行的雙重強化采油法所得驅油率遠高于水驅處理，低細胞密度的驅油率遠高于高細胞密度，hcf-eeor組合與lcf-eeor組合發酵液的累計驅油率較水驅分別提高518.65％與814.22％，低細胞密度發酵液-粗酶液組合處理的極限驅油率≥57.4％，遠高于目前的平均采收率33％。

雖然，本說明書中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。

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<110>陜西博秦生物工程有限公司西北農林科技大學

<120>利用真菌胞外酶與微生物交替進行的雙重強化采油方法

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