專利名稱：多功能分子雷達的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種多功能分子雷達，是一種新型生物測量儀器。通過光路和探測系統的整合，它可以在同一套裝置上實現激光掃描共焦熒光成像、雙光子熒光成像、單光子和雙光子熒光關聯譜儀、梯度場熒光關聯譜儀的全部功能，實現對活細胞體系中特定生化成份的成像和目標分子的運動學測量。
已有的激光掃描共焦熒光顯微鏡基本裝置如
圖1所示單光子共焦成像采用可見波段激光(波長一般為488nm)進行熒光激發。激發光經衰減片(11)衰減后，透過低通雙色分束片(5)(波長小于488nm時透過)，再經過X-Y掃描振鏡組(4)實現光束掃描，最后通過高數值孔徑顯微物鏡(3)聚焦在溶液或活細胞樣品(2)中。聚焦區域(1)內特定熒光粒子所發出的背向熒光被顯微物鏡(3)收集，經過X-Y掃描振鏡組(4)之后，被低通雙色分束片(5)反射，再經過濾光片(6)去除散射的激發光和其他雜光，然后由透鏡(7)會聚于孔徑可調的共焦小孔上(8)上，被探測器(9)接收后輸入到信號系統(10)進行信號采集與處理。共焦小孔與聚焦點(1)的像大小一致，利用空間濾波抑制焦點區(1)以外的熒光以及雜散光，提高熒光測量的信噪比。上述裝置技術成熟，一般用于活細胞體系的成像研究，但由于其采用的激發光源為可見或偏紫外，因此在長時間觀測中對活細胞內的殺傷作用較大，而且其采用的波長單一，無法實現連續可調。
雙光子熒光顯微鏡裝置基本與共焦顯微鏡相同，如圖2所示熒光激發光源采用紅外波段飛秒激光器，波段為680-1080nm；高通雙色分束片(12)對于波長大于680nm的激發光束透過，可見波段熒光被反射。另外，由于只有在焦點處能夠產生雙光子熒光，不需要空間濾波，因而探測器前不加共焦小孔，該裝置的主要特點是采用了波長較長的紅外激發光，對活細胞樣品的殺傷作用較小，可適用于長時間對樣品的觀測研究，由于其波長連續可調，對于熒光染料選擇余地較大。但由于該項技術較新，其實用領域還有待進一步探索。
已有技術中，針對活細胞或溶液體系，為了測量生物分子的結構變化、微觀化學反應、細胞內酶動力學等過程信息，一般采用熒光關聯譜儀。其原理是通過測量微區內少量發光分子的熒光漲落信號，并對其作關聯分析，從而得到有關熒光分子濃度、擴散速度等影響漲落的物理制信息。
單光子與雙光子激發熒光關聯譜儀的基本光路分別為圖3和圖4，其結構分別與共焦熒光顯微鏡和雙光子熒光顯微鏡相似。主要區別在于圖一和圖二中的X-Y掃描振鏡組(4)被全反射鏡(13)分別取代。另外，熒光關聯譜儀的探測器為雪崩二級管單光子計數器(16)，信號系統(17)中采用多路定標器和自關聯卡記錄數據，數據處理與系統控制軟件也與掃描熒光顯微鏡完全不同，包括自關聯數據處理與最小二乘法擬合功能，以便從實驗數據中獲得熒光粒子的擴散系數和焦點區域內熒光粒子數目等一系列參數。該裝置采用的技術屬于單分子探測領域，操作難度較大，適用于細胞體系中目標生物分子的動力學測量。
綜上所述，現有掃描熒光顯微鏡和熒光關聯譜儀都是獨立系統，功能單一。實際研究中，針對一個具體的生物體系開展研究時，多參數復合測量是非常必要的。掃描成像的方法可以獲得細胞層次的信息，熒光關聯譜儀的方法可以獲得分子層次的信息。因此，在現有條件下，對一個特定生物對象進行成像研究時，若需要同時對該對象的特定部位開展分子動力學方面的研究，需將其再移到熒光關聯譜儀上，由于在移動過程中的研究環境會發生變化，同時要將成像區域與熒光關聯譜儀的研究區域相對應也有相當的難度，其操作過程也較復雜，大大影響了實驗結果的準確性。同時，建立兩套獨立的系統所需的光學器件數目較多，也存在一定程度上的浪費。
本發明設計的多功能分子雷達，包括激發光源部分、樣品激勵與熒光收集部分以及熒光信號探測與處理部分。激發光源部分包括可見激發光衰減片、紅外激光衰減片和高通分束片；樣品激勵與熒光收集部分包括激光聚焦點、顯微物鏡和X-Y掃描振鏡組；熒光信號探測與處理部分包括帶通分束片、濾光片、聚焦透鏡、可調共焦小孔、探測器和信號系統。可見波段激發光經衰減片衰減，高通雙色分束片反射后，透過多波段帶通分束片再經過X-Y掃描振鏡組實現光束掃描，最后通過高數值孔徑顯微物鏡聚焦在樣品上。聚焦區域內特定熒光粒子所發出的背向熒光被顯微物鏡收集，經過X-Y掃描振鏡組之后，被多波段帶通分束片反射，再經過帶通濾光片去除散射的激發光和其他雜光，然后由透鏡會聚于孔徑可調的共焦小孔上，被雪崩二級管單光子計數器接收后，輸入到信號系統進行信號處理，得到熒光圖像與熒光關聯譜圖。
使用本發明設計的多功能分子雷達，實現了激光掃描雙光子(共焦)熒光顯微鏡與熒光關聯譜儀的一體化，在一套系統上、針對同一個樣品，進行了不同類型的多種測量，實驗裝置和儀器調節過程簡單，提高了工作效率。
圖1是共焦掃描熒光顯微鏡結構示意圖。
圖2是雙光子掃描熒光顯微鏡結構示意圖。
圖3是單光子激發熒光關聯譜儀結構示意圖。
圖4是雙光子激發熒光關聯譜儀結構示意圖。
圖5是本發明設計的多功能分子雷達結構示意圖。
圖1～圖5中，1是激光聚焦點，2是樣品，3是顯微物鏡，4是X-Y掃描振鏡組，5是低通雙色分束片，6是濾光片，7是聚焦透鏡，8是共焦小孔，9是探測器(光電倍增管)，10是信號系統(成像)，11是可見激發光衰減片，12是高通雙色分束片，13是濾光片，14是紅外激光衰減片，15是雙色分束片，16是探測器(單光子計數模塊)，17是信號系統(熒光關聯譜)，18是帶通分束片，19是濾光片，20是可調共焦小孔，21是信號系統(成像與熒光關聯譜)，22是高通分束片，I是激發光源部分，II是樣品激勵與熒光收集部分，III是熒光信號探測與處理系統。
使用本發明的多功能分子雷達，在一套系統上進行了下列五種不同的測量過程1、本發明具有激光掃描共焦熒光成像功能，已開展小鼠卵母細胞中鈣成像研究。可見波段激發光(實驗中選波長488nm激光)經衰減片(11)衰減，高通雙色分束片(22)(對可見波段激發光反射，對紅外波段激發光透射，實驗中反射488nm激發光)反射后，透過多波段帶通分束片(18)(透過紅外與可見激發光，反射波長介于紅外與可見激發光之間的熒光與波長小于可見光的熒光)，再經過X-Y掃描振鏡組(4)實現光束掃描，最后通過高數值孔徑顯微物鏡(3)聚焦在溶液或活細胞樣品(2)中(實驗中選用染有Fluo3的小鼠卵母細胞)。聚焦區域(1)內特定熒光粒子所發出的背向熒光(實驗中Fluo3發出波長為514nm的熒光)被顯微物鏡(3)收集，經過X-Y掃描振鏡組(4)之后，被多波段帶通分束片(18)反射，再經過帶通濾光片(19)去除散射的激發光(包括可見激發光與紅外激發光)和其他雜光，然后由透鏡(7)會聚于孔徑可調的共焦小孔上(20)上，被雪崩二級管單光子計數器(16)接收后。輸入到信號系統(21)，配合以光子計數卡對信號進行連續紀錄，經處理后輸出圖像，開展細胞內鈣成像研究。
2、本發明具有激光掃描雙光子熒光成像功能，已開展小鼠卵母細胞中鈣成像研究。熒光激發光源采用紅外波段飛秒激光器(實驗中激光波長選為720nm，熒光染料選用Indo-1)；經紅外衰減片(14)衰減后，透過高通雙色分束片(22)后按照與前述單光子共焦測量完全相同的光路進行激發和成像。但由于只有在焦點處能夠產生雙光子熒光(波長490nm)，不需要空間濾波，探測器共焦小孔(20)調到最大，使熒光完全通過。開展細胞內鈣成像研究。
3、本發明具有單光子熒光關聯譜測量功能，已開展溶液中熒光小球的動力學研究。使用光路和操作與單光子共焦熒光成像基本相同。主要區別在于X-Y掃描振鏡組(4)鎖住，指向樣品中一個確定點，具體位置由軟件控制。另外，熒光關聯譜儀的信號系統(21)中包括多路定標器和自關聯卡兩種數據記錄硬件，可以利用軟件計算自關聯，或利用硬件實時記錄自關聯函數。信號系統軟件還可以對自關聯函數進行最小二乘法擬合，以便從實驗數據中獲得熒光粒子的擴散系數和焦點區域內熒光粒子數目等一系列參數。實驗中激發光采用波長488nm的激光，熒光小球受激后發出波長515nm的熒光，最后得到小球的動力學參數，如擴散系數，樣品濃度等。
4、本發明具有雙光子熒光關聯譜測量功能，已開展溶液中熒光小球的動力學研究。使用光路和操作與雙光子熒光成像基本相同。主要區別如前一節所述X-Y掃描振鏡組(4)鎖住，指向樣品中一個確定點。另外，信號系統(21)中采用多路定標器和自關聯卡記錄數據，最小二乘法擬合。實驗中激發光采用波長850nm的激光，熒光小球受激后發出波長505nm的熒光，最后得到小球的動力學參數，如擴散系數，樣品濃度等。
5、本發明具有梯度場熒光關聯譜測量功能，已開展溶液中熒光小球在外加激光梯度場中的動力學研究。其光路和操作過程與單光子熒光關聯譜測量基本相同，區別在于實驗中，飛秒激光器失鎖模，作為紅外連續激光器使用，提供激光梯度場(實驗中選取波長為780nm的連續激光)。可見波長的激發光作為激勵光源(實驗中選用波長488nm的激光)。兩束激光經分束片(22)后合束，并由成像系統聚焦于樣品(2)中同一個探測點(1)。
權利要求
1.一種多功能分子雷達，其特征在于該分子雷達包括激發光源部分、樣品激勵與熒光收集部分以及熒光信號探測與處理部分；所述的激發光源部分包括可見激發光衰減片、紅外激光衰減片和高通分束片；所述的樣品激勵與熒光收集部分包括激光聚焦點、顯微物鏡和X-Y掃描振鏡組所述的熒光信號探測與處理部分包括帶通分束片、濾光片、聚焦透鏡、可調共焦小孔、探測器和信號系統；可見波段激發光經衰減片衰減，高通雙色分束片反射后，透過多波段帶通分束片再經過X-Y掃描振鏡組實現光束掃描，最后通過高數值孔徑顯微物鏡聚焦在樣品上，聚焦區域內特定熒光粒子所發出的背向熒光被顯微物鏡收集，經過X-Y掃描振鏡組之后，被多波段帶通分束片反射，再經過帶通濾光片去除散射的激發光和其他雜光，然后由透鏡會聚于孔徑可調的共焦小孔上，被雪崩二級管單光子計數器接收后，輸入到信號系統進行信號處理，得到熒光圖像與熒光關聯譜圖。
全文摘要
本發明涉及一種多功能分子雷達,包括激發光源部分、樣品激勵與熒光收集部分以及熒光信號探測與處理部分,可見波段激發光經衰減片衰減,高通雙色分束片反射后,透過分束片再經過掃描振鏡組實現掃描,最后通過高數值孔徑顯微物鏡聚焦在樣品上,特定熒光粒子發出的背向熒光被顯微物鏡收集,經過掃描振鏡組后被分束片反射,再經過帶通濾光片去除散射的激發光等,然后由透鏡會聚于共焦小孔上,被單光子計數器接收后,輸入到信號系統進行處理,得到熒光圖像與熒光關聯譜圖。使用本發明的多功能分子雷達,可以在一套系統上、針對同一個樣品,進行了不同類型的多種測量,實驗裝置和儀器調節過程簡單,提高了工作效率。
文檔編號G01N33/52GK1349093SQ0113667
公開日2002年5月15日 申請日期2001年10月26日 優先權日2001年10月26日
發明者馬輝, 丁堯, 孫非, 劉廣, 金雷, 陳瓞延 申請人:清華大學