專利名稱：具有精神分裂癥樣的認知行為異常的動物及其產生方法
技術領域：
本發明涉及以精神分裂癥樣的認知行為異常為特征的疾病動物模型及其產生方法。
精神分裂癥的發生期主要是在青春期和青年時期，多數是慢性經過，主要是與外界交往漸漸減少，活動能力日益減低，其典型的癥狀表現在知覺、思想、情感、行動方面。在社會上精神病癥狀分為陽性癥狀(幻覺、妄想、思維減弱、緊張、運動障礙等)和陰性癥狀(情感淡化、意欲低下、病理性退隱等)，由于本疾病的特殊性，亟需確立一種系統的治療體系，它包括早期發現、治療、盡早返回社會并參加社會活動以及預防復發。
唯一能改善精神分裂癥陽性癥狀的治療藥物是具有拮抗神經傳遞物質、多巴胺和5-羥色胺的藥物。患者需要長期口服這些藥物，大多數患者服用最多的藥物是吩噻嗪類化合物、硫雜蒽類化合物、丁酰苯類化合物、苯甲酰胺類化合物。
除了對這些藥物的作用機制研究之外，以苯丙胺為代表的興奮劑事實上可誘發人類精神分裂癥的陽性癥狀，因此有人曾對多巴胺的作用提出了一種假說通過多巴胺的異常作用可促使精神分裂癥發作。另外，根據這些事實，慢性給藥苯丙胺有時可用于精神分裂癥的動物模型。具有誘發人類幻覺的藥物，同樣也可用作精神分裂癥的動物模型。作為上述的例子，可舉例所給苯環己哌啶的動物，所述藥物為與記憶和學習的腦生理機能相關的谷氨酸受體抑制劑。
這些精神分裂癥的動物模型多數依賴于給藥時產生的暫時性腦機能異常，而并非在人當中所見到的重復出現的慢性精神分裂癥的病態。另外，多巴胺拮抗藥的作用主要以改善陽性癥狀為主，對陰性癥狀的改善極有限。其原因認為是沒有合適的精神分裂癥的動物模型。
到目前為止，有關精神分裂癥的發病機理存在著各種各樣的學說。其中學說之一主要以Winberger為代表的學者提出的神經發育障礙學說(文獻1)，實際上什么樣的生物因子以怎樣的機制引起腦神經發育異常至今還不完全清楚。本發明就是為了使學說更具有科學性首次提供一種動物模型。
為了解決上述課題，本發明人特別著重上述的神經發育障礙學說。即，本發明人通過給與特定的蛋白質因子抑制腦機能的發育，或者通過表達編碼蛋白質因子的基因，來產生與精神分裂癥極相類似的并具有持續性認知行為異常的動物模型。
以下，是對本發明進行詳細的說明，這些最佳方式的詳細說明以及實施例并不表示是限定或限制本發明的有效范圍。
圖2是根據大鼠生后數天，針對前置刺激抑制和驚嚇反應變化的測定圖。
圖3是針對對照給藥組和EGF給藥組的前置刺激抑制給與氯氮平后測定其給藥效果之圖。
圖4是針對對照給藥組和EGF給藥組的前置刺激抑制和驚嚇反應給與氯氮平和氟哌啶醇后測定其給藥效果之圖。
圖5是針對生后52天和24天的大鼠，通過測定給藥表皮生長因子產生的運動量異常的效果圖。
圖6是針對生后52天的大鼠，通過給藥表皮生長因子產生的運動量異常以及通過氯氮平和氟哌啶醇來改善運動量異常的效果測定圖。
圖7是通過給與表皮生長因子后導致的對社會作用的異常以對嗅覺反應行為作為指標的測定圖。
圖8是通過能動反應法測定的給與表皮生長因子后對大鼠的學習能力帶來的影響。
給與這些蛋白質因子或這些蛋白質因子表達的時期必須是在動物的發育期，應當是懷孕中的胎兒時期或出生后早些時期。本說明書中所說的發育期的幼小動物是指該動物的神經系統正處于發育階段，神經系統發育還不完全的動物。在神經系統發育不完善的幼小動物中，蛋白質因子抑制腦機能的發育效果是顯著的。例如，對于老鼠來說，從重量上判定大腦完全發育約在生后20-30天。因此本發明所使用的動物必須是在腦發育結束前才能給與蛋白質因子或使其表達。
另外，本發明所用的動物模型，除人以外的所有哺乳類動物都適用于本發明。優選動物種類為猴、黑猩猩、狗、貓、兔子、豚鼠、大鼠、小鼠等。到目前為止多數實驗數據來自于大鼠、小鼠、黑猩猩和猴，這些動物為特別優選的種類。
作為給與所述蛋白質因子或使其表達的方法大致可分為2種。其中一種方法是，直接將蛋白質因子注入動物的腹腔或皮下等。由于蛋白質因子在消化道內易被分解，所以不適于口服。蛋白質因子的給藥量與該蛋白質因子的種類、動物的種類和給藥方法有所不同，通常以1天為0.01mg/kg-100mg/kg適宜，優選每天0.1mg/kg-10mg/kg。有關蛋白質因子的給藥方法，由于在體內該蛋白質因子被分解代謝，使體內的濃度較低，所以連續數天重復性注射藥物是必要的。這些蛋白質因子可以使用通過基因重組法可在細菌內大量生產的因子或可使用來自于動物細胞的純化蛋白質因子等。
另一種方法是，應用這些編碼蛋白質因子的基因，使該蛋白質因子過量表達。有關表皮生長因子、腫瘤生長因子α、肝素結合性表皮生長因子及雙調節素，它們的編碼基因是已知的，應用本技術領域中常用的各種方法，可使其該蛋白質因子進行過量的表達。即，對動物的預定部位如腦室等注入上述編碼蛋白質因子的基因，通過強制性使該蛋白質因子進行過量表達，進而可以產生本發明的認知行為異常的動物模型。為了使這些基因能在局部進行表達可采用如下所述方法，即重組病毒載體法、在磷酸鈣中使DNA形成微小結晶經細胞吞食的磷酸鈣協同沉淀法、用瞬間高壓電在細胞膜上打孔的方法(電穿孔法)、DEAE-葡聚糖法以及在人工脂質膜內封入DNA并與細胞膜融合形成的脂質轉染法等。另外，也可應用所謂的使用特殊的槍使金粒子與DNA結合并射入組織內的粒子槍法。采用這些方法注入的基因其結果與該蛋白質因子的給藥結果相同。
另外對動物的胚胎發生初期或受精卵進行基因轉換使上述蛋白質因子過量表達，通過這一操作過程可產生本發明的動物模型。為了達到這樣一種目的所采用的手段一般是在顯微鏡下向在微玻璃管內的受精卵采用直接注入DNA的微注射法，和以胎兒胚性細胞(ES細胞)重組目的DNA并把ES細胞還原為初期胚的方法。采用這種方法，若一次產生基因導入的動物，僅需維持其動物體系，便可作為精神分裂癥的動物模型。
本發明動物模型的應用，尤其適用于與精神分裂癥和/或與此類似的精神病的治療或診斷藥物開發過程，同時也適用于與精神分裂癥和/或與此類似的精神病的機理闡明。如上所述，精神分裂癥治療藥物的開發，就現狀而言，并不是能夠解決所有的精神病的癥狀。特別是對陰性癥狀有顯著改善的藥物還未開發，究其原因是缺乏可做研究用的良好的動物模型。所以，本發明的動物模型可以解決上述的問題。另外，根據神經發育障礙學說產生的本發明的動物模型，有益于從生物化學上闡明精神分裂癥的機制。本說明書所述作為認知行為異常模型的使用方法是通過本發明方法產生的動物的使用方法，意味著是一種如下所述的方法將本發明產生的動物作為開發與精神分裂癥和/或與此類似的精神疾患癥狀的治療或診斷藥物的手段以及作為從生物化學上闡明精神分裂癥的機制的方法。但是，本發明的認知行為異常的動物不僅僅限定于上述的使用方法，也可用于其它用途，這也屬于本發明的范疇之內。
依據本方法產生的精神分裂癥的動物模型，在神經發育結束后的生長過程中如同在精神分裂癥患者中所看到的呈現持續性認知行為異常的癥狀。所以精神分裂癥多發生在青春期或青春期以后。對本發明的動物模型中的認知行為異常的評價方法將在下面闡述。又，本說明書中所說認知行為異常是持續性的，而非暫時性的，只有時間持續10天以上才可稱為認知行為異常。
作為認知行為異常的評價方法，可通過行為學方法測定驚嚇反應中的前置刺激抑制、潛伏抑制、社會相互作用、動物的運動量等。有關驚嚇反應中的前置刺激抑制，其評價指標與人類相同，都是以驚嚇反應作為感覺-運動反應能力的試驗指標。該試驗的特點就是科學地、客觀地來評價在精神分裂癥中重點對其注意力和腦內信息處理能力的異常性。其試驗就是在120分貝的大音量中在引起驚嚇之前，事先在30-150毫秒內使之接受不能引起自身驚嚇反應的較弱音量的刺激(前置刺激)，然后測定所需大音量突然引起驚嚇反應的降低。由于這個前置刺激而造成的降低部分則稱為前置刺激抑制，在精神分裂癥患者和其動物模型中其前置刺激抑制顯示了異常的減少是已知的(文獻2)。
所說潛伏刺激就是評價由于在一系列的訓練試驗中進行的試驗前的所謂「適應」所導致的訓練抑制性，如上面所舉例的前置刺激抑制和試驗的圖形相似(文獻3)。例如在巴浦洛夫型的條件反射訓練中，若已經適應了鈴聲(CS)而并不是事先提供食物(US)，那么鈴聲(CS)就等于供給食物(US)的訓練而受到抑制。通常，在精神分裂癥患者及其模型中，由于缺少分散注意力和/或「適應」的訓練，被認為是很難完成CS事前供食的訓練抑制和潛伏抑制(文獻3)。
所說社會相互作用的試驗可將精神分裂癥患者不愿意與人接觸、遠離社會作為指標。在動物當中，初次看到不認識的動物時，一般都靠嗅覺進行交流，所以主要測定嗅覺活動等(文獻4)。我們知道一般的精神分裂癥患者及其模型，對嗅覺的指標都很低。
圖2表示出生后數天分析的前置刺激抑制(圖2A)和驚嚇反應(圖2B)程度的結果。在圖2中，○表示細胞色素-C給藥對照組(n＝10)的結果，▲表示表皮生長因子給藥組(n＝10)的結果。圖2A的前置刺激抑制測定是分別在出生后21、28、30、37、46、51、60、90天在75分貝的前置刺激中進行的。其值用平均值±SEM表示，星號表示2組的有意差(*P＜0.05，**P＜0.01)。圖2B表示在120分貝音量所致的驚嚇反應中，對照組大鼠和EGF大鼠的之間的差異(對照百分率)。關于圖2的結果，被認為是在出生28天之后的動物存在著有意差。2.氯氮平對前置刺激抑制異常的改善效果用本動物模型評價了已被認可的作為人類精神分裂癥的治療藥物為8-氯-11-(4-甲基-1-哌嗪基)-5H-二苯并[b，e][1，4]-二氮雜草(氯氮平Sigma-Aldrich Fine Chemicals)的藥效，及討論了該動物模型的對藥物效果評價的可行性。氯氮平在人類重組表皮生長因子給藥組和對照組(細胞色素-C給藥)中是從前置刺激抑制慢性異常初次看到的出生后21天開始，以2.5mg/kg的用量每天連續注入腹腔內。到出生后30天(P30)、33天(P33)、37天(P37)時，測定了前置刺激抑制(PPI)(圖3)。關于生后30天(P30)、33天(P33)、37天(P37)的結果，分別用圖3A、3B、3C表示。用氯氮平治療9天后也就是在大鼠出生后30天時，在表皮生長因子給藥組(EGF CZP)中與細胞色素-C給藥組(Cont CZP)相比，前置刺激抑制的異常是有意義的(圖3A)，但在大鼠生后33天(P33)或37天(P37)時，在表皮生長因子給藥組(EGF CZP)中與細胞色素-C給藥組(Cont CZP)之間的前置刺激抑制的有意差消失了(圖3B、3C)。
同樣，也對作為人類精神分裂癥的治療藥物4-(4-[p-氯苯]-4-羥基哌啶子基-4′-氟丙基苯基甲酮(氟哌啶醇Sigma-Aldrich Fine Chemicals)進行了評價。氟哌啶醇采用腹腔注射，劑量為0.3mg/kg。圖4分別對下例4組進行了探討，即作為載體注入生理鹽水的大鼠對照組(CON/VEH)、注入生理鹽水的表皮生長因子給藥組(EGF/VEH，n＝10)、注入氯氮平的表皮生長因子給藥組(EGF/CLZ，n＝10)和注入氟哌啶醇的表皮生長因子給藥組(EGF/HPD，n＝6)。生理鹽水、氯氮平、氟哌啶醇的給藥時間均為一周。在最后一次給藥23小時之后，又對各組大鼠進行了試驗。圖4A是在75分貝的前置刺激強度時的前置刺激抑制的數據，星號表示與CON/VEH組比較的有意差(*p＜0.05、**p＜0.01)。圖4A顯示了氯氮平給藥后使前置刺激抑制得到顯著的改善。但是，氟哌啶醇給藥則無顯著變化。圖4B顯示各組對120分貝音量的驚嚇反應的程度(相對CON/VEH組的百分率)。與CON/VEH組比較，在表皮生長因子給藥組中，顯示驚嚇反應有意義的增高，而上述的抗精神病藥物對于120分貝的驚嚇反應是無效的。3.表皮生長因子給藥后導致運動量的持續異常測定了動物出生后第24天和第52天的運動量。方法是對出生后第24天，使用運動量測量裝置(Neuro Science)進行了自動測定。在第52天時，測定了水平運動和垂直運動，這種運動是在51×51×80cm的箱子內進行的，其中每隔17cm畫一條線，測定10分鐘越過線的次數以及跳躍的次數。
圖5表示出生后24天(P24)和52天(P52)水平運動(Line Cross)和垂直運動(Rearing)次數的平均值(±SEM)。圖5A表示出生后24天的結果(n＝10、雌性8只，雄性7只)，圖5B表示出生后52天的結果(n＝10、雌雄各5只)。圖5左側縱軸表示水平運動的次數，右側縱軸表示垂直運動的次數。左半部的柱狀線表示越線的次數，右半部的柱狀線表示跳躍的次數。白柱表示給藥對照組(CON)，黑柱表示表皮生長因子給藥組(EGF)。
就生后24天而言，表皮生長因子給藥組(EGF)和細胞色素-C給藥組(CON)相比，在水平、垂直兩項運動量中沒有觀察到有意義差(圖5A)。如果讓動物繼續發育，當出生后52天具有生殖功能時與細胞色素-C給藥組比較，則在表皮生長因子給藥組的垂直運動的次數上觀察到有意義的改變(圖5B)。這些都與人類精神分裂癥的發病時期以青春期后多發相一致。
另外，使用生后52天的大鼠針對運動量方面抗精神病藥物的效果進行了探討。圖6表示是對下列4組進行探討的結果，即注入作為載體的生理鹽水的對照組(CON/VEH)、注入生理鹽水的表皮生長因子給藥組(EGF/VEH，n＝10)、注入氯氮平的表皮生長因子給藥組(EGF/CLOZ，n＝10)和注入氟哌啶醇的表皮生長因子給藥組(EGF/HAL，n＝6)。各組雌雄動物數相同。生理鹽水、氟哌啶醇、氯氮平給藥時間為三周，最后一次給藥48小時后，對各組進行了試驗。星號(*)和井號(#)分別表示與CON/VEH組和與EGF/VEH組之比的有意差(*p＜0.05、#p＜0.05)。如圖6所示，由于慢性注入氟哌啶醇和氯氮平，使EGF大鼠組的垂直運動有意義的減少了。但是，這些藥物對水平運動是無效的。4.表皮生長因子給藥后所致社會相互作用的異常按照File等的方法，對表皮生長因子給藥后所致大鼠社會相互作用的異常情況進行了探討。用出生后52天齡的大鼠2只。觀察了2只大鼠之間對嗅覺反應的行為并以對嗅覺反應行為的時間作為陌生的指標。在評價社會相互作用的試驗里，造成一種環境就是在對照組和表皮生長因子給藥組中引起大鼠產生回避行為。具體的是在并不適應強光的環境中，即在很寬敞的地方觀察對嗅覺反應的行為。兩組動物對嗅覺反應的行為用攝象機拍攝下來，再記錄這兩組動物對嗅覺反應的行為(圖7)。
圖7縱軸表示對嗅覺反應行為時間的平均值(±SEM)。下面用4組探討了對嗅覺反應的行為。即注入作為載體的生理鹽水的大鼠對照組(CON/VEH)、注入生理鹽水的表皮生長因子給藥組(EGF/VEH，n＝10)、注入氯氮平的表皮生長因子給藥組(EGF/CLOZ，n＝10)和注入氟哌啶醇的表皮生長因子給藥組(EGF/HAL，n＝6)。EGF處理過的大鼠，在其處理前三周給藥氯氮平或氟哌啶醇，最后一次給藥48小時后，對各組分別進行試驗。星號表示與CON/VEH組比較的有意差(**p＜0.01)。與對照大鼠組相比，在表皮生長因子給藥組中，對不曾認識的對方動物對嗅覺反應的行為顯著地減低(CON/VEH)。另外，在表皮生長因子給藥組中，對減低的嗅覺反應的行為通過氯氮平給藥后可恢復(EGF/CLOZ)。然而，氟哌啶醇對嗅覺反應行為的恢復是無效的(EGF/HAL)。5.通過主動回避反應探討訓練能力通過主動回避反應對訓練能力進行了探討。主動回避試驗采用了生后51-60天齡的大鼠，并在穿梭盒子中進行了試驗(1天進行10次)。這里所述的條件刺激(conditioning stimulusCS)是指，給與80分貝的音量和室內光5秒鐘的刺激。當進行條件刺激(CS)時，為了使其刺激停止回避下面將要敘述的無條件刺激(unconditioned stimulusUS)，必須將試驗動物移動到穿梭盒子裝置的另一方(回避行為)。這里所述無條件刺激(US)，使用電休克刺激，用0.6mA強度的恒定電流通過10秒鐘，研究并探討動物通過訓練學習是否能夠回避電休克。
圖8表示各訓練次數中顯示的回避反應的百分比的平均值(±SEM)。圖8中的○表示細胞色素-C給藥對照組(CONn＝10)，▲表示表皮生長因子給藥組(EGFn＝10)。有關回避電休克的能力，在訓練中兩組都有顯著的改善，但沒有明顯的差別。另外，有關反應的時間或越過穿梭盒子中兩側的次數，兩組間無差別。在發育階段中經過EGF處理的動物學習能力是正常的，這可排除腦機能損害的可能性。
由本發明提供的精神分裂癥樣的認知行為異常的動物模型，是通過特定蛋白質因子抑制腦機能的發育而產生的模型。通過應用本發明的動物可開發或評價精神分裂癥的治療藥物和診斷藥物。
參考文獻1. Weinberger DR.Arch.Gen Psychiatry 44660-669(1987)2. BraffDL，Geyer MA.Arch Gen Psychiatry 47181-188(1990)3. Brauch I，Hemsley DR，Gray JA.J.Nerv.Ment.Dis.176598-606(1991)4. Sams-Dodd F.Rev Neurosci.10(1)59-90.(1999).5. Morrison R；“Neurotrophic Factors”Loughlin SE and Fallon JH eds.Academic Press，Chaptor11339-357(1993)
權利要求
1.一種誘導產生具有持續性認知行為異常的動物的方法，該方法包括針對發育期的幼小動物多次給與或連續給與選自表皮生長因子、腫瘤生長因子α、肝素結合性表皮生長因子和雙調節素。
2.一種根據權利要求1所述方法誘導產生的具有持續性認知行為異常的動物。
3.一種使用根據權利要求1所述方法產生的動物作為具有持續性認知行為異常的模型的方法。
4.一種誘導產生具有持續性認知行為異常的動物的方法，該方法包括在發育期的幼小動物中局部導入編碼蛋白質因子的基因并使該蛋白質因子在所述動物體內表達，所述蛋白質因子選自表皮生長因子、腫瘤生長因子α、肝素結合性表皮生長因子和雙調節素。
5.一種根據權利要求4所述方法誘導產生的具有持續性認知行為異常的動物。
6.一種使用根據權利要求4所述方法產生的動物作為具有持續性認知行為異常的模型的方法。
7.一種誘導產生具有持續性認知行為異常的動物的方法，該方法包括將編碼蛋白質因子的基因導入動物發育的初期胚或受精卵中，經過基因轉導使該蛋白質因子在由所述初期胚或受精卵發育成的動物個體中表達，所述蛋白質因子選自表皮生長因子、腫瘤生長因子α、肝素結合性表皮生長因子和雙調節素。
8.一種根據權利要求7所述方法誘導產生的具有持續性認知行為異常的動物。
9.一種使用根據權利要求7所述方法產生的動物作為具有持續性認知行為異常的模型的方法。
全文摘要
為了提供與精神分裂癥極相類似的具有慢性認知行為異常的動物，采用發育期的幼小動物，給與特定的蛋白質因子抑制腦的機能發育，從而產生了認知行為異常的動物。本發明所認定的認知行為異常的動物與精神分裂癥極相類似，它對開發治療和診斷精神分裂癥的藥物是有用的。
文檔編號G01N33/15GK1392772SQ01803071
公開日2003年1月22日 申請日期2001年10月10日 優先權日2000年10月10日
發明者那波宏之, 二村隆史 申請人:新澙大學校長代表的日本國