專利名稱：26s蛋白酶體調節亞基1(非atp酶)的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體地說，本發明涉及一種26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)用作檢測肝癌的蛋白質分子標記的應用。
背景技術：
肝癌是一種嚴重危害人類的疾病。西方發達國家肝癌的發病率較低，國際上對肝癌的基礎研究仍較為薄弱，而我國是肝癌高發國家，發病率和死亡率呈現上升趨勢，且發病年齡構成年輕化，每年用于肝癌治療的醫療支出大為增加，肝癌成了嚴重危害我國人民生命財產安全的頭號敵人，并且是影響社會經濟發展的一個重要因素，加大力度進行我國肝癌的基礎研究具有戰略意義，而分離和鑒定新的肝癌相關基因是目前肝癌基礎研究中的前沿課題。
到目前為止，已有不下20種的基因異常表達被確定與肝癌的發生發展有關，但已確定的肝癌相關基因在肝癌中的異常表達率并不高，肝癌的發病機制至今仍未闡明，肝癌的早期診斷率仍有待提高。此外，傳統的肝癌手術加化療以及近年來配合使用的多種基因治療方法仍沒有明顯提高肝癌患者的生存率，因而尋找新的肝癌相關基因尤其是肝癌高表達基因對于探討肝癌的發病機制具有重要意義。
因此，為治療和診斷目的研究和開發在肝癌中高表達的基因和/或蛋白具有重要意義。本領域迫切需要新的在肝癌中高表達的基因和/或蛋白。
26S蛋白酶體調節亞基1(26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 1；26Sproteasome regulatory subunit RPN2；26S proteasome regulatory subunit S1；26S proteasomesubunit p112；26S proteasome regulatory subunit S1；26S proteasome subunit p112；P112；S1；26S proteasome regulatory subunit RPN2)的Genebank登錄號為gi|25777600，NCBI的登錄號為NP_002798，Swissprot登錄號為Q99460，IPI號為IPI00299608.2。26S蛋白酶體，在真核細胞中，對泛素化蛋白質的ATP依賴的降解途徑起著關鍵性的作用。26S蛋白酶體由一個20S蛋白酶體以及兩個19S調節亞單元(19S regulatory particles，RP)構成，一個19S RP包含6種不同的ATP酶亞基以及至少11個非ATP酶亞基，其中一種就命名為26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)。26S蛋白酶體在細胞中很多生物過程都起著重要的作用，尤其是在細胞周期的各個階段的過渡起著關鍵性的作用(Mol.Cell Biol.1999 October；19(10)6872-6890)。
在一篇發表Molecular Microbiology的文獻(Differentiation of Trypanosoma brucei maybe stage non-specific and does not require progression of cell cycle，Molecular Microbiology.2003 Jul；49(1)251-65)中，19S RP中的11個非ATP酶亞基被逐個knock-down，結果發現在每個非ATP酶亞基的knock-down系統中，細胞的分裂周期停止，都停留在G1期和G2期了。這就表明26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)可能在細胞分裂周期中起著一定的作用。
由上可以看出，傳統觀點都認為26S蛋白酶體與蛋白降解、特別是細胞周期的關系非常密切，而26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)是其中不可或缺的一部分。截止目前，還沒有26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)或26S蛋白酶體與肝細胞癌的相關性的報道。
發明內容
通過篩選在肝細胞癌癌組織以及肝細胞癌癌旁組織中差異表達的蛋白質，本申請的發明人找到了一種在肝細胞癌的癌組織和癌旁組織中存在差異表達的蛋白質(在癌組織中上調表達)，經質譜鑒定為26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)。進一步的免疫印跡實驗證實，26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)的確在肝細胞癌的癌組織與癌旁組織中存在差異表達(在癌組織中上調表達)。
基于26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)與肝細胞癌的這種相關性，以該蛋白作為一個蛋白質分子標記對其表達量進行檢測可以用于檢測肝癌。
因此，本發明的首要目的即在于提供一種26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)用作檢測肝癌的蛋白質分子標記的應用。
本發明的另一個目的在于提供一種抗26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)的抗體，包括單克隆抗體和多克隆抗體，用于制備檢測肝癌的制劑的應用。
本發明的再一個目的還在于提供一種抗26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)的抗體，包括單克隆抗體和多克隆抗體，用于制備檢測肝癌的試劑盒的應用。
本發明的又一個目的在于提供一種體外檢測肝細胞組織中26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)的表達是否異常的方法，該方法包括以下步驟A、用特異性抗26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)的抗體檢測待測肝細胞中26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)的數量；B、將步驟A測得的26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)的數量與正常肝組織中的26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)的數量進行比較，如測得的蛋白數量高于正常值，則表示被檢測肝組織中26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)的表達異常。
雖然現有技術中有關于26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)與細胞周期的相關報道，但是到目前為止，還沒有26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)與肝細胞癌的相關性的報道，因此，本發明的這一發現將為肝細胞癌的診斷和/或治療提供一條全新的途徑。
圖1顯示了對26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)的免疫印跡分析結果。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。
下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
本申請的發明人用非酶解樣品制備法(nonenzymatic sample preparation，NESP)制備的肝細胞癌的癌組織與癌旁組織蛋白質樣品，以同位素親和標簽與凝膠增強的液質聯用技術(gel-enhanced liquid chromatography-mass spectrometry coupled with isotope-coded affinitytag，GeLC-MS-ICAT)對其中的蛋白進行鑒定并比較其表達量。結果發現26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)在肝細胞癌癌組織中高表達。免疫印跡實驗進一步證實26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)的確在肝細胞癌的癌組織與癌旁組織中存在差異表達。
因此，以26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)作為一個蛋白質分子標記對其表達量進行檢測可以用于檢測肝癌，即26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)可以用作檢測肝癌的蛋白質分子標記。
實施例1、肝細胞癌癌組織及癌旁組織蛋白質樣品的制備本實施例中所使用的尿素、3-[(3-膽酰胺丙基)-二乙銨]-1-丙磺酸(CHAPS)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、二硫蘇糖醇(DTT)均購自Sigma公司。
本實施例以非酶解樣品制備法(nonenzymatic sample preparation，NESP)制備肝細胞癌的癌組織及癌旁組織蛋白質樣品，具體如下手術切除的新鮮組織塊迅速置于冰上，快速切成幾個肉眼可見、無壞死區域的小塊。用預冷的不含谷氨酰胺的RPMI1640培養基(5％胎牛血清，0.2mM PMSF，1mM EDTA，苯甲異噁唑青霉素25mg/mL，慶大霉素50mg/mL，青霉素100U/mL，鏈霉素100mg/mL，兩性霉素B 0.25mg/mL，制霉菌素50U/mL)洗滌組織小塊數次后，在液氮中快速研磨成細胞沉淀，細胞沉淀分別溶于適量裂解液(8mol/L尿素、4％CHAPS、40mmol/L Tris和65mmmol/L DTT)中，超聲細胞破碎儀(Soniprep 150，英國，MSE)冰浴間歇超聲2min，15000r/min、4℃離心1h。取上清，以改良的Bradford法(見Bio-Rad公司產品說明書)進行總蛋白質定量，制備好的肝細胞癌癌組織及相應癌旁組織的蛋白質樣品分裝，-80℃保存備用。
以上述方法制備11對肝細胞癌癌組織及癌旁組織蛋白質樣品。11例肝細胞癌標本均來自東方肝膽外科醫院，由2個病理科醫生明確為肝細胞癌。均為男性，平均年齡48.5歲(31～65歲)，血清檢測hepatitis B病毒感染陽性，11例(100％)屬臨床分級(TNM分級)III級。其中，甲胎蛋白(AFP)高于25μg/L的10例(90.9％)；9例腫瘤大于5cm。11例肝細胞癌標本的病理資料詳見表1。
表1、11例肝細胞癌標本的病理資料
本實施例所用癌組織及癌旁組織樣品均為取自同一肝細胞癌患者的成對樣品，所有11例肝細胞癌病例有極相似的病例診斷指標均為男性，平均年齡48.5歲(31～65歲)，血清檢測hepatitis B病毒感染陽性，11例(100％)屬TNM分級III級。其中，AFP高于25μg/L的10例(93.75％)；9例腫瘤大于5cm。這種取樣方法有利于降低個體間差別對實驗分析工作的影響。
實施例2、差異表達蛋白的篩選本實施例中使用的尿素、3-[(3-膽酰胺丙基)-二乙銨]-1-丙磺酸(CHAPS)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、二硫蘇糖醇(DTT)購自Sigma公司；碘乙酰胺(IAA)、丙烯酰胺、N，N-甲叉雙丙烯酰胺等購自Fluka公司；cleavable ICAT試劑購自Applied BiosystemsFramingham，MA公司。
過硫酸胺(AP)、TEMED、Tri-n-butylphosphat(TBP)、PDQuest軟件等為Bio-Rad產品。
Avidin親和柱購自Applied Biosystems，Framingham，MA公司。
LCQTMDeca XP system和ProteomeXTMWorkstation購自Thermo Finnigan公司。
所使用的上樣緩沖液的組成為1mol/L Tris-HCl(pH6.8)0.6ml，50％甘油5ml，10％SDS 2ml，巰基乙醇0.5ml，蒸餾水1.9ml，少量六溴酚藍。
首先采用同位素親和標簽與凝膠增強的液質聯用技術(gel-enhanced liquidchromatography-mass spectrometry coupled with isotope-coded affinity tag，GeLC-MS-ICAT)對實施例1得到的11對蛋白質樣品中的其中一對(病例編號為4 29)肝細胞癌的癌組織及癌旁組織中的差異表達蛋白進行篩選鑒定，方法參照2003年Steven P.Gygi發表在MCP上的文獻(Jiaxu Li et al.Mol Cell Proteomics.2003 Nov；2(11)1198-204.Epub.2003 Sep.23)，具體過程如下NESP法制備的一對肝細胞癌癌組織與相應癌旁組織蛋白質樣品(病例編號為4 29)，分別取100μg，先用TBP還原蛋白質，而后分別用cleavable ICAT試劑(C12和C13)標記(其中C12與C13分別對應癌組織與相應癌旁組織，標記方法參照產品說明書)。混合后加入適量上樣緩沖液，跑5％濃縮膠(上層膠)和7.5％～17.5％分離膠(下層膠)，電泳條件為15mA/膠30min，然后30mA/膠，保持至溴酚藍前沿入濃縮膠8cm左右。
考染染出條帶后，將整個上樣條帶平均切為8份，每份再分別切成1mm3的小塊，在100mM NH4HCO3、30％ACN中脫色，真空冷凍干燥，100μl 50mmol/L NH4HCO3(pH8.3，蛋白質∶胰蛋白酶＝1∶5，w/w)中4℃放置2hr，加入50μl 50mmol/L NH4HCO3(pH8.3)，37℃酶解過夜。
抽提蛋白(60％ACN、0.1％TFA)，真空冷凍干燥。酶解后的每份肽段混合物經Avidin親和柱純化出已標記肽段后，再用LCQTMProteomeXTMWorkstation進行液相串聯(LC-MS/MS)質譜鑒定，Bioworks軟件(Thermo finnigan公司)進行數據庫搜索并用relex軟件(Scripps Research Institute，USA)進行數值計算。
運用NESP法和GeLC-MS-ICAT技術，我們共鑒定到426種有定量關系的蛋白質。其中兩倍以上量變的蛋白質共201種，肝細胞癌癌組織高表達的有155種蛋白質；肝細胞癌癌旁組織高表達的有46種蛋白質。
用LC-MS/MS質譜鑒定、數據庫搜索及比值計算得1個含Cys的肽段被總共鑒定到2次，與26S蛋白酶體調節亞基1(26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 1；26Sproteasome regulatory subunit RPN2；26S proteasome regulatory subunit S1；26S proteasomesubunit p112；26S proteasome regulatory subunit S1；26S proteasome subunit p112；P112；S1；26S proteasome regulatory subunit RPN2)相符，氨基酸覆蓋率為2.28％。relex軟件計算結果顯示26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)在肝細胞癌癌組織中高表達，癌組織/癌旁組織的比值為2.027(SD＝0.658)，詳細的鑒定情況及肽段打分結果見表格2。
表2、GeLC-MS-ICAT中1個含Cys的肽段的詳細鑒定結果
實施例3、26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)差異表達的免疫印跡驗證為確認26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)的差異表達，取10位肝細胞癌患者的癌組織及相應癌旁組織蛋白質樣品(NESP法制備，表1中除4 29例以外的其它10例)，用購買的抗26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)抗體進行免疫印跡分析，具體過程簡述如下每個樣品取20μg蛋白質樣品用12％SDS-PAGE分離，轉移至PVDF膜(購自Amersham Biosciences公司)上，一抗使用山羊抗人26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)單抗(購自Abcam Ltd公司，1∶250)，室溫孵育2小時，用TBST(每升含Tris 2.42g，氯化鈉8g，Tween 20ml，用HCl調節pH到7.6)洗滌三次，每次5分鐘，二抗為抗山羊抗體(購自Santa Cruz公司，1∶10000)室溫孵育1小時，再用TBST洗滌三次，每次10分鐘，最后用ECL plus試劑(Amersham Biosciences)反應5分鐘后，以X-光片曝光檢測，檢測結果如圖1所示。
圖1的免疫印跡結果顯示，10對癌組織與癌旁組織中除三對(3 17，4 5，4 24)不甚明顯外，其余各對均呈現癌組織中26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)的雜交條帶的濃度都明顯高于相應的癌旁組織的現象；可見26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)在肝細胞癌的癌組織中存在高表達，該結果與質譜檢測結果一致。
綜上所述，26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)在肝細胞癌的癌組織及癌旁組織中存在差異表達，顯然與肝細胞癌的發生發展有著密切的相關性，因此，以26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)作為一個蛋白質分子標記對其表達量進行檢測可以用于檢測肝細胞癌。相應的，特異性抗26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)的抗體，包括各種抗26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)的單克隆抗體和多克隆抗體，由于其能夠用于檢測26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)的表達量，因而可以用于檢測肝癌，或者用于制備檢測肝癌的制劑或試劑盒等，這對于本領域的技術人員來洗是顯而易見的。
雖然有關26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)動態的生物學功能及腫瘤相關機制還有待進一步研究，但是將其作為檢測肝癌的標記物卻是肯定的。26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)可作為肝細胞癌的潛在標志，而其在胞內的生物學功能提示26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)可能作為肝癌的預后分子標記和臨床治療的靶分子。
權利要求
1.一種26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)的應用，其特征在于，用作檢測肝癌的蛋白質分子標記。
2.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述用作檢測肝癌的蛋白質分子標記是檢測該蛋白在肝細胞組織中的表達量。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于，所述檢測該蛋白在肝細胞組織中的表達量是檢測該蛋白在肝細胞組織中是否存在上調表達。
4.一種抗26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)的抗體的應用，其特征在于，用于制備檢測肝癌的制劑。
5.如權利要求4所述的應用，其特征在于，所述抗26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)的抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體。
6.一種抗26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)的抗體的應用，其特征在于，用于制備檢測肝癌的試劑盒。
7.如權利要求6所述的應用，其特征在于，所述抗26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)的抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體。
8.一種體外檢測肝細胞組織中26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)的表達是否異常的方法，其特征在于包括以下步驟A、用特異性抗26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)的抗體檢測待測肝細胞中26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)的數量；B、將步驟A測得的26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)的數量與正常肝組織中的26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)的數量進行比較，如測得的蛋白數量高于正常值，則表示被檢測肝組織中26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)的表達異常。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述所述抗26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)的抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體。
全文摘要
本發明通過篩選在肝細胞癌的癌組織和癌旁組織中存在差異表達的蛋白，找到了一種在肝細胞癌的癌組織中高表達的蛋白，免疫印跡實驗進一步證實了26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)的確在肝細胞癌的癌組織與癌旁組織中存在差異表達。鑒于26S蛋白酶體調節亞基1(非ATP酶)與肝細胞癌的這種相關性，該蛋白可以用作檢測肝細胞癌的蛋白質分子標記。
文檔編號G01N33/68GK1920569SQ20051002916
公開日2007年2月28日 申請日期2005年8月26日 優先權日2005年8月26日
發明者曾嶸, 袁新雨, 李辰, 周曉 申請人:中國科學院上海生命科學研究院