專利名稱：5＇核苷酸酶診斷試劑盒及5＇核苷酸酶活性濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及一種5'核苷酸酶診斷試劑盒，同時本發明還涉及測 定5'核苷酸酶活性濃度的方法，屬于醫學檢驗測定技術領域。
技術背景醫學研究表明，5'核苷酸酶(5' NT)增高主要見于阻塞性黃膽， 也可見于肝癌和肝炎。在膽汁淤積并發膽管炎、原發性和繼發性膽汁 性肝硬化和慢性肝炎時，5' NT升高率高于堿性磷酸酶；肝腫瘤和肝 肉芽腫時5' NT升高的敏感性高于堿性磷酸酶。因為5'-核苷酸酶活 性無生理性升高，對于診斷嬰幼兒肝病和妊娠性肝功膽汁淤積較堿性 磷酸酶不但敏感，而且有特異性。因此測定5'-核苷酸酶的活性對于 疾病的診斷具有重要意義。
5'-核苷酸酶的活性測定方法很多，主要有同位素底物法、化學 強酸測磷法(1925年)。據申請人了解，目前國際上普遍采用同位素 底物測試法，方法為5'-核苷酸酶作用于H3-dUMP，終止反應后，通 過離子交換層析柱分析結果，求得5'-核苷酸酶活性。或者利用5' -核苷酸酶作用于單磷酸腺苷后產生無機磷，再用化學強酸法分析無機 磷含量得以計算出5'-核苷酸酶的活性。
同位素底物法方法復雜還有同位素污染，而且需要同位素測定儀， 因此難以切實推廣應用。無機磷測定法是1925年發明的方法，準確度 不好，強酸污染環境等等，也不適合推廣應用。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提出一種利用、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯法(Couple Reaction)技術，連續 監測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化， 得以測定5'核苷酸酶活性濃度的方法，同時，本發明還將給出用以 實現該方法的5'核苷酸酶診斷試劑盒，采用該試劑盒不僅可以在紫 外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行5'核苷酸酶活性濃 度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。 本發明5'核苷酸酶活性濃度測定方法原理如下
腺苷單磷酸+水5'核苷酸酶腺苷+磷酸根 腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子 氨離子+丙酮酸+還原型輔酶丙氨酸脫氫酶 L-丙氨酸
+水+輔酶
這種方法應用5'核苷酸酶(偶)聯腺苷脫氨酶(EC 3.5.4.4)及丙氨酸脫 氫酶(EC 1.4丄1)酶促反應連續監測法。5'核苷酸酶解腺苷單磷酸 反應產生腺苷，再通過(偶)聯合腺苷脫氨酶及丙氨酸脫氫酶的作用， 最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為氧化型輔酶(在 340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度 下降的速度，通過測量340nm處吸光度下降的速度，可以測算5'核 苷酸酶的活性濃度大小。
實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合 考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發明5'核苷 酸酶診斷試劑盒較為理想緩沖液 100mmol/L 穩定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
腺苷脫氨酶 6000 U/L
丙氨酸脫氫酶 12000 U/L
腺苷單磷酸 6 mmol/L
丙酮酸 16 mmol/L
本發明的5'核苷酸酶診斷試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、腺苷單磷酸、丙酮酸、腺苷脫氨酶、
丙氨酸脫氫酶
試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、腺苷單磷酸、丙酮酸。 試劑2
緩沖液、穩定劑、腺苷脫氨酶、丙氨酸脫氫酶。 還原型輔酶、腺苷單磷酸、丙酮酸、腺苷脫氨酶、丙氨酸脫氫酶在 試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態，在使用 前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 也可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑l
緩沖液、穩定劑、還原型輔酶。
試劑2
緩沖液、穩定劑、腺苷單磷酸、丙酮酸。 試劑3
緩沖液、穩定劑、腺苷脫氨酶、丙氨酸脫氫酶。 還原型輔酶、腺苷單磷酸、丙酮酸、腺苷脫氨酶、丙氨酸脫氫酶在 試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態， 在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定5'核苷酸酶活性濃度的 方法，其還原型可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一種。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。 實施例一
本實施例的5'核苷酸酶診斷試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
腺苷脫氨酶 6000 U/L
丙氨酸脫氫酶 12000 U/L
腺苷單磷酸 6 mmol/L
丙酮酸 16mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑;
使用前，加入純凈水，復溶后使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間IO分鐘， 起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被 測5'核苷酸酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為負反應 (下降反應)，延遲時間大約l分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，理 論K值—4180。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生 化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出5' 核苷酸酶的活性濃度大小。 實施例二
本實施例的5'核苷酸酶診斷試劑為雙試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 10Ommol/L
穩定劑
還原型輔酶
腺苷單磷酸
丙酮酸
50 mmol/L
0.25 mmol/L
8 mmol/L
12 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩定劑
腺苷脫氨酶
丙氨酸脫氫酶
50 mmol/L
8000 U/L 10000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37C，反應時間10分鐘，起始 吸光度1.8士0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測5'核 苷酸酶樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為負反應 (下降反應)，延遲時間大約l分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，理論 K值-2170。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出5'核 苷酸酶的活性濃度大小。 實施例三
本實施例的5'核苷酸酶診斷/測定試劑為三試劑，包括-
試劑1
緩沖液
穩定劑
還原型輔酶 試劑2
緩沖液
穩定劑
腺苷單磷酸
丙酮酸 試劑3
緩沖液
100 mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L
100 mmol/L 50 mmol/L 4 mmol/L
20 mmol/L
100 mmol/L
穩定劑 50 mmol/L
腺苷脫氨酶 4000 U/L
丙氨酸脫氫酶 20000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定5'核苷酸酶活性濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度 37°C，反應時間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm， 測試副波長405nm，被測5'核苷酸酶樣品與試劑l、試劑2、試劑3 的體積比例為4/40/5/5，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大 約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，理論K值一2170。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出5'核 苷酸酶的活性濃度大小。
.總之，實驗證明，采用本發明的測定方法完全可以通過一般生化分 析儀器得出所需的測定結果，并且靈敏度高、精確度好、不受內外源 物質的污染，便于推廣應用。
權利要求
1.一種5′核苷酸酶活性濃度測定方法，其方法原理如下id="icf0001" file="A2006100972560002C1.gif" wi="144" he="37" top= "38" left = "26" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，測算出5′核苷酸酶的活性濃度大小測定結果。
2. —種5'核苷酸酶診斷試劑盒，主要成分包括緩沖液 20——500 mmol/L穩定劑 1——50mmol/L還原型輔酶 0.1——0.35 mmol/L腺苷脫氨酵 2000——50000 U/L丙氨酸脫氫酶 2000——50000 U/L 腺苷單磷酸 l——20 mmol/L丙酮酸 1——60mmol/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。
3.根據權利要求2所述5'核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、腺苷單磷酸、丙酮酸、腺苷脫氨酶(EC 3.5.4.4)、丙氨酸脫氫酶(EC1.4丄1)組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述5'核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、腺苷單磷酸、丙酮酸、腺苷脫氨酶(EC3.5.4.4)、丙氨酸脫氫酶(EC1.4丄1)組成雙劑試劑；試劑 1，由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、腺苷單磷酸、丙酮酸組成； 試劑2，由緩沖液、穩定劑、腺苷脫氨酶(EC 3.5.4.4)、丙氨酸脫 氫酶(EC 1.4丄1)組成。腺苷單磷酸、丙酮酸、腺苷脫氨酶、丙 氨酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述5'核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、腺苷單磷酸、丙酮酸、腺苷脫氨 酶(EC3.5.4.4)、丙氨酸脫氫酶(EC1.4丄1)組成多劑試劑；試劑 1，由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶組成；試劑2,由緩沖液、穩 定劑、腺苷單磷酸、丙酮酸組成；試劑3，由緩沖液、穩定劑、腺 苷脫氨酶、丙氨酸脫氫酶組成。腺苷單磷酸、丙酮酸、腺苷脫氨酶、 丙氨酸脫氫酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據權利要求2所述5'核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于還包 括穩定劑1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩定劑為 硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發明涉及一種利用酶比色法及酶聯法技術的5′核苷酸酶診斷試劑盒，同時本發明還涉及測定5′核苷酸酶活性濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫學檢驗測定技術領域。本發明的試劑盒主要成分包括緩沖液、腺苷單磷酸、丙酮酸、腺苷脫氨酶、丙氨酸脫氫酶、還原型輔酶及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的速度，從而測算出5′核苷酸酶的活性濃度大小。采用本發明完全可以通過紫外/可見光分析儀器得出所需的測定結果，并且靈敏度高、精確度好，不受內外源物質的污染，便于推廣應用。
文檔編號G01N21/78GK101169378SQ20061009725
公開日2008年4月30日 申請日期2006年10月26日 優先權日2006年10月26日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司