專利名稱：5’核苷酸酶診斷試劑盒及5’核苷酸酶活性濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及一種5'核苷酸酶診斷試劑盒，同時本發明還涉及測定5'核苷 酸酶活性濃度的方法，屬于醫學檢驗測定技術領域。
背景技術：
醫學研究表明，5'-核苷酸酶(5NT)增高主要見于阻塞性黃膽，也可見 于肝癌和肝炎。在膽汁淤積并發膽管炎、原發性和繼發性膽汁性肝硬化和慢 性肝炎時，5NT升高率高于堿性磷酸酶；肝腫瘤和肝肉芽腫時5NT升高的敏 感性高于堿性磷酸酶。因為5'-核苷酸酶活性無生理性升高，對于診斷嬰幼兒 肝病和妊娠性肝功膽汁淤積較堿性磷酸酶不但敏感，而且有特異性。因此測 定5'-核苷酸酶的活性對于疾病的診斷具有重要意義。
5'-核苷酸酶的活性測定方法很多，主要有同位素底物法、化學強酸測磷 法(1925年)。據申請人了解，目前國際上普遍采用同位素底物測試法，方法 為5'-核苷酸酶作用于H3-dUMP，終止反應后，通過離子交換層析柱分析結 果，求得5'-核苷酸酶活性。或者利用5'-核苷酸酶作用于單磷酸腺苷后產生 無機磷，再用化學強酸法分析無機磷含量得以計算出5'-核苷酸酶的活性。
同位素底物法方法復雜還有同位素污染，而且需要同位素測定儀，因此 難以切實推廣應用。無機磷測定法是1925年發明的方法，準確度不好，強酸 污染環境等等，也不適合推廣應用。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯法(Couple Reaction)技術，連續監測還 原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定5，核苷酸酶活性濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的5'核苷 酸酶診斷試劑盒，采用該試劑盒不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動 生化分析儀上進行5'核苷酸酶活性濃度測定，而且測定速度快、準確度高， 因而可以得到切實的推廣應用。
本發明5'核苷酸酶活性濃度測定方法原理如下
磷酸根+肌苷5'核苷酸酶肌苷單磷酸+水 肌苷單磷酸+輔酶次黃苷單磷酸脫氫酶黃苷單磷酸+
還原型輔酶
這種方法應用5，核苷酸酶(5'Nucleotidase; EC3丄3.5)酶(偶)聯次黃苷單 磷酸脫氫酶(IMP dehydrogenase; EC U丄205)酶促反應連續監測法。5，核 苷酸酶酶解磷酸根反應產生肌苷單磷酸，再通過(偶)聯合次黃苷單磷酸脫 氫酶的作用，最終將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在 340nm處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的速 度，通過測量340nm處吸光度上升的速度，可以測算5，核苷酸酶的活性濃度 大小。
實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮，無 論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發明5'核苷酸酶診斷試劑較為 理想
緩沖液 100mmol/L 穩定劑 500 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
次黃苷單磷酸脫氫酶 9000 U/L
磷酸根 12mmol/L肌苷 8 mmol/L
本發明的5'核苷酸酶診斷試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩定劑、輔酶、次黃苷單磷酸脫氫酶、磷酸根、肌苷。 試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試 劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑l
緩沖液、穩定劑、輔酶、磷酸根、肌苷。 試劑2
緩沖液、穩定劑、次黃苷單磷酸脫氫酶。 輔酶、次黃苷單磷酸脫氫酶、磷酸根、肌苷在試劑1或試劑2中的位置可 以不限。試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1
緩沖液、穩定劑、輔酶、磷酸根。 試劑2
緩沖液、穩定劑、肌苷。 試劑3
緩沖液、穩定劑、次黃苷單磷酸脫氫酶。 輔酶、次黃苷單磷酸脫氫酶、磷酸根、肌苷在試劑l、試劑2或試劑3中 的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可 以配制成液體試劑，直接使用。無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定5'核苷酸酶活性濃度的方法，其 輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。 實施例一
本實施例的5'核苷酸酶診斷試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L
穩定劑 500 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
次黃苷單磷酸脫氫酶 9000 U/L
磷酸根 12 mmol/L
肌苷 8 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍千燥，制成干粉試劑； 使用前，加入純凈水，復溶后使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37"C，反應時間10分鐘，起始吸光度 《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測5'核苷酸酶樣品與試劑 的體積比例為1/25，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約l分鐘左 右，檢測時間2分鐘左右，理論K值4180。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析儀 下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出5'核苷酸酶的活性濃 度大小。 實施例二
本實施例的5'核苷酸酶診斷試劑為雙試劑，包括試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩定劑 50 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
磷酸根 12 mmol/L
肌苷 8 mmol/L 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100 mmol/L
穩定劑 500 mmol/L
次黃苷單磷酸脫氫酶 9000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，起始吸光度
《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測5'核苷酸酶樣品與試劑
1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大
約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，理論K值2170。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析儀
下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出5'核苷酸酶的活性濃
度大小。
實施例三
本實施例的5，核苷酸酶診斷試劑為三試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩定劑 50 mmol/L輔酶 3 mmoi/L
磷酸根 12mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩定劑 500 mmol/L
肌苷 8 mmol/L 試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100 mmol/L
穩定劑 500 mmol/L
次黃苷單磷酸脫氫酶 9000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定5'核苷酸酶活性濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反 應時間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm， 被測5'核苷酸酶樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應 方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右， 理論K值2170。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析儀 下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出5'核苷酸酶的活性濃 度大小。
申請人經過實驗驗證，采用以上發明內容中記載的其他測定方法均能達 到本發明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明采用本發明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀 器得出所需的測定結果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.0008;吸光度時間反應曲線應呈直線上升；試劑可測有效(R》0.99)線形范圍可達500
U/L;試劑測試的不準確度，其相對偏差不超過±5°/。；試劑測試的精密度(重 復性)的變異系數(CV)《2%;試劑在2—8'C下保存，活性可以穩定一年；
——本發明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩定期長，足以便于推廣 應用。
權利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯法技術的5’核苷酸酶活性濃度測定方法，其方法原理如下磷酸根+肌苷5’核苷酸酶肌苷單磷酸+水肌苷單磷酸+輔酶次黃苷單磷酸脫氫酶黃苷單磷酸+ 還原型輔酶將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，測算出5’核苷酸酶的活性濃度大小測定結果。
2. —種5'核苷酸酶診斷試劑盒， 緩沖液 穩定劑 輔酶次黃苷單磷酸脫氫酶磷酸根肌苷:要成分包括:,20-500 mmol/L,1-4000 mmol/L,6 mmol/L,1000--80000 U/L,1,50 mmol/L,50 mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內效果較好，在此范 圍外，試劑仍會反應作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液體試劑，直接使用。
3.根據權利要求2所述5'核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩定劑、輔酶、次黃苷單磷酸脫氫酶、磷酸根、肌苷組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述5'核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩定劑、輔酶、次黃苷單磷酸脫氫酶、磷酸根、肌苷組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩定劑、輔酶、磷酸根、肌苷組成；試劑2， 由緩沖液、穩定劑、次黃苷單磷酸脫氫酶組成。輔酶、次黃苷單磷酸脫氫 酶、磷酸根、肌苷在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述5'核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩定劑、輔酶、次黃苷單磷酸脫氫酶、磷酸根、肌苷組成多劑 試劑；試劑1，由緩沖液、穩定劑、輔酶、磷酸根、肌苷組成；試劑2， 由緩沖液、穩定劑組成；試劑3，由緩沖液、穩定劑、次黃苷單磷酸脫氫 酶組成。輔酶、次黃苷單磷酸脫氫酶、磷酸根、肌苷在試劑l、試劑2或 試劑3中的位置可以不限。
6. 根據權利要求2所述5'核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于還包括穩定劑 l"4000mmol/L或0.1。/。-100。/。體積比。所述穩定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發明涉及一種利用酶比色法及酶聯法技術的5’核苷酸酶診斷試劑盒，同時本發明還涉及測定5’核苷酸酶活性濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫學檢驗測定技術領域。本發明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、磷酸根、肌苷、次黃苷單磷酸脫氫酶及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的速度，從而測算出5’核苷酸酶的活性濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101620066SQ20081012286
公開日2010年1月6日 申請日期2008年6月30日 優先權日2008年6月30日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司