專利名稱：用于表征清澈和混濁介質中的顆粒的方法和設備的制作方法
用于表征清澈和混濁介質中的顆粒的方法和設備 相關申請的交叉引用根據U.S.C. 119(e)的規定，本申請要求以2005年1月31日提交的第 60/648,513號美國臨時專利申請作為優先柏羞礎，在此以與本文公開相一 致的程度通過引用的方式將其4^P內容納入本說明書。關于聯邦擔〗^研究或開發的聲明本發明是在由美國國家衛生研究院(NIH )提供的合同號為 PHS5P41-RR03155號的基金的i^支持下進行的。政府對本發明享有一定的 權利。
背景技術：
在過去的幾十年中，光學分析方法已經成為有用并可廣泛應用的分析工 具，用于檢測和表征各種介質中的痕量組份。在光學分析方法中，電磁輻射 被提供到樣本并與該樣本的組份相互作用。入射電磁輻射和樣本之間的相互 作用產生可被收集和檢測的散射、透射和/或發射的電磁輻射。所檢測的光 的強度、波長分布、極化狀態、散射角度或這些屬性的任何組合提供了關于 樣本組份的組成、濃度、物理狀態和/或化學環境的信息。已經證實的對表 征痕量組份尤其有用的光學分析方法包括吸收和發射光鐠技術、Raman和 Mie散射分析方法、磁共振光鐠方法以及多維光學頻i普技術。的優點。第一，光學分析方法可應用于多種類型的生物系統和生物材料，因 為大多數生物學上有意義的分子(諸如肽、寡聚核苷酸和脂類或它們的聚集 體)會吸收、散射和/或影響在紫外、可見以及紅外區域中的電磁輻射的極 化狀態。第二，很多光學分析方法，特別是例如熒光標記或紅外標簽的采用 選擇性光標記的技術的方法，提供了識別并表征生物材料的選擇性的和靈敏 的方法。第三，光方法經常為非破壞性的表征方法，從而允許分析生物樣本 的組份，而不明顯影響其生物活性、成分或生理狀態。第四，光學分析方法 可提供靜態和流動系統中原位實時檢測。最后，由于近來能夠使用便宜和靈 敏的光電檢測器，并且能夠在電磁頻譜的紫外線、可見和紅外區域中的進行 穩定光源操作，從而使得使用光方法的高通量分析在商業和技術上都可以實 行。由于具有這些益處，光學分析方法已廣泛用于對生物材料進行識別、分 類和分選。例如，已經證明光流式細胞術可以用于多種試驗環境中，包括免疫學應用、DNA分析、功能性分析、細胞分選、細胞和非細胞顆粒的定量分 析以及臨床診斷和治療。在流式細胞術中，將含有細胞和/或非細胞目標顆 粒的懸浮液注射到較快流動的液體流中，其在顆粒周圍提供鞘流，從而產生 層流。鞘流要比在^^p為流體動力聚焦(hydrodynamic focusing)的過禾呈中 的樣本泵取得更快，它使堵塞程度最小化并精確地將顆粒的樣本流聚集到小的分析體積中。顆粒的持續層流空間上分離了顆粒，以^更它們穿過iy企測區域，它們在該區域#^^征。在ib險測區域中，顆粒優選地一次一個與一個或 多個電磁輻射的入射波束(諸如具有選定的波長分布的激光)相互作用，從 而產生被檢測為時間函數的散射的、透射的和/或發射的電磁輻射。通常用在常規的光流式細胞術系統中用于表征細胞材料的光學量度包括小角^ 送散射光強度用于表征細胞直徑，以;SJE交散射光強度用于確定細胞中顆粒 結構的數量。熒光檢測方法廣泛用于常規光流式細胞術系統中，特別是與選擇性熒光 標記技^M目結合，其中對于穿過光檢測區域的每個顆粒，都同時檢測對應于 多個波長分布的熒光強度。標記探針和熒光染料過剩、以及染色和插入劑有 助于各種細胞類型和細胞成分的檢測。在一些方法中，使用熒光抗體來測量 細胞分析物的具體表面受體的密度，并且因此區別分化細胞類型的亞群。使 用結合光流式細胞術的熒光探針還可以常皿檢測并量化細胞內成分，包括 細胞內總DM、 DM或mMA中的具體核苷酸序列、選擇的肽和蛋白質以及游 離脂肪酸。因此，光流式細胞術技術使得可以基于大量，而區分個別的細胞，諸 如其在流體流中的位置、大小、顆粒結構的數量以及可檢測標記的存在和豐 度。由于這種能力，經常使用光流式細胞儀來產生生物樣本中的顆粒幹沐的 診斷性圖鐠。例如，流式細胞術已經有效地用于在治療HIV感染期間測量免 疫細胞的下降或維持，并且在癌癥患者的診斷和預后過程中用于確定腫瘤細 胞的出現或消失。盡管光流式細胞術對于識別和表征生物樣本的成分是一種很有效并且 多功能的技術，但是它具有很多重要的P艮制和缺陷。第一，關于所分析顆粒 的大小，常規光流式細胞儀的動態范圍很窄。由于該限制，常常需要多個不 同的流式細胞儀來研究包括不同大小的細胞分布的生物系統。第二，流式細 胞儀的正常運轉要求在用于分析的樣本中沒有細胞團或其它碎片，因為這些 可以阻塞或有害地影響流動細胞的層流條件。因此，樣本和鞘流體需要仔細 過濾以防止流阻塞。不以有害方式影響流動條件而又有效地執行必要的過濾 常常是很麻煩的。第三，常規的流式細胞儀包括復雜的裝置，這需要受過高 度訓練的操作人員以便正確操作。流式細胞儀的對準和校準并不是簡單的任 務，并且需要經常執行以獲得精確和很好分離開的光學分類。第四，流式細 胞儀的正常運轉需要經常清潔流動細胞和沖刷并消毒管道，以防止形成生物 被膜和污染。當使用這些方法來表征包含微生物的樣本的時候，清潔和消毒 就特別重要。第五，調查研究的樣本在很多流式細胞儀系統中的分析之后就 消失了，因此樣本不能用于使用補充技術的進一步分析。i^分析僅僅在幾 分鐘內可用的樣本或m^獲取的樣本的時候就十分不利。最后，除了其便攜 性的明顯限制"卜，即^^不能夠細胞分類的市售流式細胞儀系統的成本也 相當高，這已經妨礙了這種技術在大的研究和臨床機構之外的廣泛使用。由上述內容可以發現，4^支術領域當前需要光學方法和設備，用于識別 和表征生物樣本中以極少數量存在的樣本成分，特別是痕量的樣本成分。需 要在被分析顆粒的大小分布、成分和物理狀態方面具有大動態范圍的光學分 析方法和設備。另外，需要與常規光流式細胞4^目比不太容易形成生物凈 和污染物的光學分析方法和設備，并且其不需要對用于分析的樣^ii行麻煩 的預過濾。最后，需凓硬宜、簡單并且便攜式的光學分析設備用于分析生物 樣本，其可以由沒有經過充Wll練的技術人員操作。發明內容本發明提供了 一種用于分析樣本顆粒，特別是以低豐度存在的熒光顆粒 的光學方法、設備和設備組件。本發明提供了掃描共焦顯微鏡設備以及分析 方法，用于檢測、測量透明介質、散射介質和/或不透光介質中的分類顆粒 的濃度，所述分類顆粒包括細胞、微生物、生物學上有意義的分子及其聚集 體和復合體。本發明的方法和設備能夠利用短(例如，少于約1分鐘)樣本 掃描周期對具有較寬的尺寸范圍的顆粒進行檢測、識別和分類。本發明的目 的是提供光學分析設備和分析方法，所述設備和方法能夠檢測樣本中以極低 濃度(例如阿托摩爾或更低的濃度)存在的顆粒并且能根據物理、化學和/ 或光學特征將其精確分類。本發明的另一個目的是提供不需要樣本過濾并且 在分析期間不導致樣本丟失或降解的光學分析系統和方法。本發明的又一個 目的是提供可以由沒有經過充分訓練的技術人員操作的機械簡單、機械可 靠、便宜并且十^f更攜的光學分析設備。在一個方面，本發明提供了用于分析樣本中存在的諸如熒光顆粒的顆粒 的光學分析器以及方法。在本發明的這個方面的一個實施方案中，光學分析器包括用于容納包含顆粒的樣本的至少部分透明的容器；用于產生激發光的 光源，用于收集熒光的裝置，用于移動容器的裝置以及光電檢測器。使用光 學試管(cuvette)，諸如圓柱形試管，作為用于容納包含顆粒的樣本的至少部分透明的容器有益于本發明的這個方面的一些應用。在一個實施方案 中，向樣本提供由光源產生的校準激發光，諸如激光或燈。激發光和樣本的相互作用使得樣本中至少一部分顆粒產生熒光。用于收集熒光的裝置，諸如透鏡、反射鏡光纖光學元件、共焦顯微鏡或 波導，被定位成與樣本光通信，并且被配置以便它從樣本內和位于容器中的 觀察體積選擇性地收集熒光。在可用于分析混濁介質中的顆粒的實施方案 中，觀察體積的位置接近(例如，在約500微米內，或一些情況下在約200 微米內)容納樣本的至少部分透明的容器的壁。用于移動容器的裝置可^^作 地連接到該容器，以便其能夠以通過觀察體積傳輸至少部分顆粒的方式移動 該容器。在一些實施方案中，可用于移動該容器的示例裝置能夠以對給定樣 本掃描周期提供統計獨立觀察體積的方式旋轉和/或轉移(例如，垂直轉移、 水平轉移或兩者均有)該容器，并且，可選地，提供用于通過，見察體積一次傳輸一個顆粒的裝置。光電檢測器被提供成與收集熒光的裝置光通信，并且能夠^u見察體積接收焚光，AU見察體積測量熒光的強度以;s^產生熒光的時間曲線。可選地，在樣本和光電檢測器之間提供一個或多個孔，諸如一個或多 個狹縫，以確保來自觀察體積的焚光可被光電檢測器檢測，而來自其它區域 的相同熒光不被檢測。可選地，在光源和樣本之間提供激發光濾波器 (filter)和/或在樣本和光電檢測器之間提供發射光濾波器。在一些實施 方案中，由光電檢測器產生的對時間曲線的分析提供了樣本中離子的濃度、 大小分布和/或亮度分布的量度。在一個實施方案中，本發明提供了一種光學分析設備，所述光學分析i殳 備結合了新穎的掃描共焦顯微鏡和具有模式識別算法的處理器，所述處理器 能夠對流體樣本中以低濃度存在的熒光顆粒進行檢測、計數和/或分類。在 這個方面的一個實施方案中，本發明提供了一種用于確定流*本中的顆粒 的濃度的光學分析設備，該設備包括用于容納流體樣本的至少部分透明的容 器、用于產生激發光的光源、共焦顯微鏡、用于移動容納樣本的容器的裝置、 光電檢測器以及具有模式識別算法的處理器。在本發明的這個實施方案中， 共焦顯微鏡被提供成與光源光通信，以便它接收激發光。共焦顯艱i鏡將'^L 光聚焦于至少部分透明的容器所容納的樣本上，從而使得樣本中的顆粒產生 熒光，并且還從樣本中的觀察體積收集熒光。光電檢測器被提供成與共焦顯 微鏡光通信，從觀察體積接收至少部分熒光并且測量其作為時間函數的強 度，從而產生來自觀察體積的熒光的時間曲線。在一個實施方案中，在具有 狹縫或針孔區域的光電檢測器的前面提供一個共焦孑L,該狹縫或針孔區域提 份沐積范圍為大約1 x 10、1113到大約lx 108|111113的觀察體積。在一個實施方 案中，共焦孑L是寬度范圍為大約1到大約100微米的狹縫。用于移動容器的裝置可操作地連接到該容器，以便它能夠在光學分析期 間移動該容器。在一個實施方案中，用于移動該容器的裝置在光學分析期間 沿選定的軌跡旋轉和/或平移該容器，該分析在選定的樣本掃描周期期間通 it^見察體積傳輸(或掃描)包含顆粒的樣本，例如，通過在垂直和/或水平 方向上提供容器的旋轉和/或位移。可選地，用于移動容器的裝置在光學分 析期間旋轉該容器，從而系統地改變被分析的顆粒在被傳輸通過觀察體積時 相對于激發光的傳播軸的方向。用于移動容器的裝置可以提供通it^見察體積 有效傳輸包含顆粒的樣本的該圓柱形或非圓柱形容器的任何方式的運動，可 旋轉該容器或提供平移和旋轉運動的結合。在一個實施方案中，用于移動容 器的裝置為能夠旋轉、垂直位移和/或水平位移容納流體樣本的容器的馬達、 開關電子器件和/或偏心旋轉板機構。在一些應用中，優選的移動容器的裝 置提供了可選擇性調節旋轉速度的旋轉運動，提供了具有可選擇性調節的軌
水平位移。在一個實施方案中，容器的垂直位移速率被選擇在大約每秒0. 01 厘米到大約每秒5厘米的范圍，和/或容器的旋轉it^被選擇在大約每秒0.1 轉到大約每秒10轉的范圍。具有模式識別算法的處理器(諸如計算機或其它硬件等同物)被提供成 與光電檢測器至少單向通信，用于接收對應于由光電檢測器產生的時間曲線 的輸出信號。模式識別算法的運算分析該時間曲線，從而確定樣本中的顆粒 濃度。在一個實施方案中，模式識別算法將時間曲線中的特征與對應于通過 觀察體積的顆粒的時間依賴型熒光強度的預定模式相匹配。在本發明中可用 的預定模式包括作為時間函數的強度分布，并且可以經驗性地確定(例如通 過測量對應于,皮充分表征的包含焚光顆粒的樣本(例如，包含萸光標記孩沐 的樣本)的熒光時間曲線)或從頭開始計算。本發明的模式識別算法可以是 較大的數據濾波算法的組件，所述較大的數據濾波算法可識別對應于通it^見 察體積的顆粒的時間曲線的特征。在一些實施方案中，本發明的模式識別算 法和數據濾波算法還能夠通過熒光相關頻語技術以及光子計數直方圖分析 來分析時間曲線。通過在時間曲線中的特征的幅度和形狀與預定模式之間建立匹配來識 別離散顆粒檢測事件。通過計算與給定樣本掃描周期的時間曲線中的特征匹 配的預定模式的數量來確定顆粒的濃度。在一個實施方案中，這是通過在大 矢量的每個點執行最小二乘計算的濾波算法的運算來執行的。該算法計算最 小化局部卡方(chi square)的濾波器最佳幅度，其中該幅^A濾波器強度 的倍數。通過以噪聲窗中規定的噪聲水平的總和以及說明在大矢量的特定點 處計數的平方根的標準方差的估算來加權原始數據和對預定模式的擬合 (fit)之間的差別，從而計算該卡方。通過在選定的樣本掃描周期期間將 匹配的數目除以分析的樣本體積iM^分析的時間曲線提取濃度，其可以利用 觀察體積的大小、容器的移動速率(例如，垂直和水平位移的速率)以;^樣 本掃描周期的持續時間的知識M確計算。利用模式識別的本發明中的數據分析的重要功能性特征在于能夠通過 移動(例如，旋轉、平移或位移)容納了被分析的樣本的試管來精確校正熒 光和激發光的透射、吸收和/或散射的變化。在一些實施方案中，該校正等 于校正作為時間函數的來自觀察體積的背景熒光和/或散射、H光中的變 化。因此，本發明中的模式識別分析增強了使用掃描光學儀器執行的測量的 精確度和再現性，其中樣本容器在光照和光分析期間被移動。可選地，模式識別算法的運算基于一個或多個諸如大小、形狀以及擴散 速率的物理特性、諸如亮度的光學屬性和/或諸如存在熒光和/或熒光豐度和/或關注的帶熒光標記的活質分子(例如，肽、蛋白質、脂肪、m-MA、寡核 苷酸或聚集體及其復合體)的化學屬性來將樣本中的顆粒分類。諸如顆粒大 小分布和顆粒亮度分布的顆粒集合的特征是通過分析與時間曲線中的特征 相匹配的預定模式的強度分布的幅度和形狀來確定的。與時間曲線中的特征 相匹配的預定模式的寬度，例如半高全寬，可以與觀察本積中的顆粒的駐留 時間(residence time)正相關。替代地，穿過觀奮本積的顆粒的大小可以 通過將預先選擇模式的寬度改變為時間曲線中的定量匹配的特征來確定。在 另一個實施方案中，時間曲線的特征的積分亮度和/或與時間曲線中的特征 相匹配的預定模式提供了顆粒的物理、光學和/或化學特性的測量，諸如觀 察區域中的顆粒的大小和形狀。使用用于分析熒光數據的模式識別算法是有益的，因為它提高了靈敏度 并擴展了本發明光分析方法和設備的功能性能力。首先，使用模式識別算法 允許利用少于一分鐘的樣本掃描周期來險測濃度低至10個顆粒/毫升的具 有低亮度的顆粒。相比于常規的掃描共焦顯微鏡方法，這提供了大約108倍 的靈敏JL提高。其次，本發明的模式識別算法允許基于具有約10%的任意精 度的大小來對顆粒進行分類。另夕卜，使用具有模式識別算法的處理器提供了 能夠基于大小在很寬的大小動態范圍，諸如從大約250納米到數十微米的范 圍內對顆粒進行分類的大小分析方法。最后，模式識別算法還提供了基于其 它重要顆粒屬性的精確顆粒分類，這些顆粒屬性諸如擴散常數、形狀、亮度 以及成分。該數據分析方法的另一個優點在于，通過模式識別用于分析的預定模式 及其在這樣的分析算法中的使用并不十分依賴于顆粒成分或顆粒分散于其 中的介質的成分。在本發明中，濃度測量包含識別顆賴驗測事件的數量以及 確定在樣本掃描周期期間掃描的樣本的凈體積。顆趟農測事件是通過將預定模式與來自觀察體積的熒光的觀察到的時間曲線的特;M目匹配來識別的。本 發明的預定模式能夠被縮放、標準化和/或校正，從而利用樣本中存在的顆 粒的類型和包含顆粒的介質的物理屬性，諸如密度和離子強度的知識，在經 驗上或理論上來說明樣本中顆粒的傳輸速率和擴散中的差別。因此，本技術 允許在不需要嚴重依賴于經過了分析的系統的精確屬性的復雜校準程序的 情況下來確定顆粒的濃度。在顆粒分類的情況中，本方法和設備采用關于與 時間曲線中的特樹目匹配的預定模式的幅度和形狀的校準程序。例如，顆粒 的大小可以由其通過共焦體所花費的時間來推導。原則上，給定狹縫的大小、 光學倍率以及旋轉速率，就可以獲得該大小而不需要先驗的校準。然而，在本發明中也可以使用利用已知大小的顆粒進行的校準。共焦顯微鏡和用于移動容納樣本的至少部分透明的容器的裝置的結合提供了 一種用于將相當大體積(例如，毫升)的流^v^送穿it^見B積 而不需要使用流動系統的有效手段。在該說明書的上下文中，術i吾掃描指的 是傳導或運送包含顆粒的樣M過共焦顯微鏡的觀察體積，以《更可以光學地 檢測和/或表征顆粒。另夕卜，在本說明書中的掃描還可以指透明容器的移動， 以便例如通過旋轉樣本容器，使觀察體積中的顆粒的位置關于激發光的光軸 而變化。在本發明的一個實施方案中，容器被同時旋轉并垂直位移以提供經 過了分析的樣本的掃描。容器的垂直位移產生使顆粒穿過》見察體積的容器的 軌跡，并確保了在樣本掃描期間被分析的掃描樣本體積在統計學上是獨立 的。在本說明書的上下文中，關于由本設備和方法分析的觀察體積的"統計 學上獨立"指的是這一事實，即在后續掃描期間在相同配置中觀察到相同顆 粒的概率非常小(例如，低于O. 01%),并且在一些情況下可忽略(例如， 低于0.0001%)。除了將顆粒傳送穿過觀察體積之外，容器的旋轉還系統性 地改變了顆粒關于激發光的光軸的位置，從而提供了一種在光學檢測期間掃 描顆粒位置的手段。因此，在光學分析期間容器的旋轉提供了一種表征顆粒 的手段，其作為關于激發光的傳播軸的觀察區域中旋轉位置的函數。具體地， 容器的旋轉允許從多個光學透視(即，穿過顆粒的軸)來表征顆粒，其提供 了關于顆粒大小、形狀以及成分的附加信息。圓柱試管的較慢的垂直反轉(大 約2. 5至5厘米/秒)和旋轉(大約5至10轉/秒)的結合提供了對測量在 亞阿托摩爾濃度下的樣本中顆粒濃度并且將它們關于大小分類的有用的容 器城。在光學分析期間傳送穿過觀察體積(例如，通過旋轉、垂直位移和/或 水平位移)的流體樣本的凈體積取決于掃描周期的長度，和容納樣本的容器 的運動速率以及觀察體積的大小。觀察體積的大小是由共焦顯微鏡中采用的 共焦孔的大小，特別是位于樣本和光電檢測器之間的共焦孔的大小來控制
的。較小的觀察體積有益于增加信號背景比，并且確保了顆粒穿過觀奮沐積 并且每次檢測一個。然而，使用較小的觀g積需要更長的樣本掃描周期來 分析與使用較大的觀察體積的系統中所分析的相比等同的凈樣本體積。因 此，觀察體積和樣本掃描時間的選擇表示了這些設備性能和屬性之間的折 衷。在一些應用中，最好的折^A使用提供所關注顆粒的表征和精確檢測的 最大的共焦孔。通過增加觀察體積(使用更寬的共焦孔)，對于給定運行時 間所掃描的總體積就更大。替代地，經過了光學分析的樣本可以在分析之前 被稀釋，以獲得確保顆粒每次一個地被運送穿過檢測體的濃度。當表征在高 度散射或吸收介質中分軟的顆粒時，樣M釋也是有用的。在光學分析期間用于掃描樣本的設備組件的組合對本發明的這個方面 的方法和設備提供了多個實際好處。第一，結合用于移動樣本容器的裝置來 使用共焦顯微鏡，提供了 一種用于將顆粒傳送穿過觀察區域同時不需要產生 流體流的手段。結果，經過了分析的樣本并不要求如同在光學流式細胞術系 統中那樣的大范圍預過濾以防止與樣本流和阻斜目關的問題發生。另外，樣本不從設備的內部運轉，從而使得本分析系統較不易受到與污染物、細 菌生長和生物被膜形成相關問題的影響。而且，樣本在光學分析期間沒有被 丟失、毀壞或退化，從而允許樣本在通過方法的檢測和表征之后進行附加 的以及補充的分析。第二，使用共焦顯微鏡使得能夠使用小至皮升的很小的 觀察體積，其對確保顆粒每次一個地穿過觀察體積并且改善信噪比是4艮有用 的。然而，容器的垂直位移和旋轉允許使用諸如掃描周期等于大約l秒至大 約100秒的相對短的樣本掃描周期來表征諸如樣本體積等于大約1毫米至 10毫米的大體積樣本。第三，使用共焦顯微鏡允許選擇光照焦點，以便使 觀察區域位于相對接近于(例如，大約50微米至大約500微米)容納樣本 的容器壁的位置。這一特征允許適用本設備和方法來有效地分析部分透明和 /或高度散射介質例如混濁介質的成分。第四，結合用于移動樣本容器的裝 置使用共焦顯微鏡提供了這樣一種手段，用于使容納顆粒的樣本傳送穿過觀 察區域而不需要包括可移動光學組件的復雜光學系統，諸如平移光源、光電 檢測器或分色鏡。本發明的這個方面是有利地，因為它提供了一種不需要在 掃描之間重復的光學再對準的簡單、機械上堅固可靠的試驗系統。在另一個方面，本發明提供了用于選擇性，測并測量流*本中的顆 粒濃度的方法和設備，以及能夠區別具有不同物理屬性和/或化學屬性的顆粒的光學分析方法和詔:備。在本發明的這個方面的一些實施方案中，通過利 用可以與樣本的特異性組分(共價或非共價地)選擇性結合的一個或多個熒光探針來處理樣本來提供檢測特異性，所述熒光探針諸如熒光染料、著色、 共價標簽和/或插入劑，所述樣本的特異性組分諸如表面結合位點、細胞間 或細胞內蛋白質、肽、寡核苷酸，或它們的任何聚集體或復M。例如，本 方法和設備非常適于分析已經被可與樣本的不同組分選擇性結合的多個不 同熒光探針處理過的流體樣本，所述熒光探針諸如核酸熒光團以及熒光抗 體。在這個實施方案中，利用不同波長分布的光同時或順序^Ui并且以多個 不同波長進行熒it^測，使得可以進行區別檢測并對與一個或多個熒光探針 選擇性結合的樣本中的顆粒進行定量。替代地，基于穿過觀察體積的顆粒的 擴散常數，本發明的一些方法和設備提供了檢測特異性。在本發明的這些實 施方案中，分析了觀察得到的熒光的時間曲線中的特征的強度分布，以確定 與檢測顆粒相關的擴散常數。例如，在一些例子中，時間曲線中的特征寬度 或與時間曲線中的特征匹配的預定模式與觀察體積中顆粒的駐留時間或擴 散常數正向相關。由于不同類型的顆粒(諸如不同大小、形狀或電荷的顆粒) 具有不同的擴散常數，所以本發明的這個功能能力提供了一種用于區別樣本 中不同顆粒類型的手段。替代地，基于測量顆粒亮度，本發明的一些方法和 設備提供了檢測特異性。在這些實施方案中，測定了時間曲線中特征的總積 分強度，并用于區別不同類型的顆粒。例如在一些例子中，本發明的這個方 面提供了一種基于諸如蛋白質、肽、脂類以4核苷酸的具體生物分子的出 現或豐度來區別諸如細胞或微生物的顆粒的手段，所述具體生物分子選^^地 與加入到樣本中的一個或多個熒光探針相結合。在另一個方面，本發明提供了多信道光學分析器，它能夠同時或獨立監 測來自與被傳送穿過觀察區域的顆粒相結合的多個不同熒光探針的熒光。在 一個實施方案中，多個光電檢測器、波長區別元件以;M目應的共焦孑W皮提供 成與共焦顯微鏡光通信，并且向用于分析的流^#本中提供具有不同 _和 /或發射波長的多個熒光探針。選擇每種熒光探針的成分，以使其選擇地與 樣本中目標物質相結合，例如通過使用可選擇地結合到不同的表面結合位點或細胞內蛋白質或肽的多個不同核酸熒光或熒光抗體。從一個或多個光源的 光的皿使得標記有一個或多個探針的顆粒發出熒光。熒光的強度和波長分 布取決于與顆豐y目結合的熒光探針的豐度和特性，因此可以用于基于成分對 顆粒分類。多個光電檢測器備有波長區別元件，諸如光濾波器、ib斷、棱鏡、 單色儀或分色反射鏡，以便每個都能夠檢測M定的熒光探針產生的熒光， 而不檢測從與顆豐対目結合的其它熒光探針產生的熒光。因此，在這個光配置 中的每個光電檢測器都獨立產生對應于選擇的熒光探針的來自觀察體積的 熒光的時間曲線。本發明的這個實施方案另一有益的，因為可以用發射光位于 電磁頻鐠的不同區域中的多于一個的熒光探針來標記目標顆粒，所以該實施 方案提供了很好的檢測特異性，。對一致檢測事件的兩個或多個光電檢測器 的輸出結果進行分析，使得可以進行區別檢測并對目標顆粒進行定量。在另一個方面，本發明提供了多信道光學分析器，其中提供了多個光電 檢測器，每一個具有不同大小的與共焦顯微鏡光通信的共焦孔徑(例如狹 縫)。在這個實施方案中，光電檢測器檢測來自具有不同有效焦距體積的觀4察體積的光。在本發明中同時分析的觀察體積可以被定位以便重疊，并JL^ 一些實施方案中被集中布置。對應于不同有效焦距體積的觀察體積的熒光時 間曲線的同時分析有助于更精確地解析樣本中顆粒的大小分布，因為顆粒的 大小將改變通過共焦狹縫的通行時間。可以使用不同的共焦孔徑來更精確地 確定顆粒的大小和/或亮度。而且，使用本實施方案的多信道系統可以確定 顆粒沿光軸方向的位置。本發明還包括采用統計分析方法的方法和設備，所述統計學方法可以與 模式識別分析技術一起使用或替代模式識別分析技術使用。例如在一個實施 方案中，本發明提供了如下設備和方法，其中通過光子直方圖分析算法的運 算產生檢測光子的直方圖，從而分析觀察到的時間曲線。使用該分析方法獲得的光子計數直方圖可表;^u見察體積發出的熒光波動的幅度分布，并且與 概率分布相關，可以檢測每采樣時間內的給定數量的光子。對于熒光顆粒的某一種類而言，光子計數直方圖可以通過兩個M來表征觀奮沐積中的顆 粒的平均數以及顆粒亮度，顆粒亮度被定義為每個顆粒在每個采樣時間內檢 測到的光子的平均數。另外，如果各熒光種類具有間隔足夠大的亮度量級， 就可以使用光子計數直方圖分析來區別樣本中出現的不同熒光種類。替代 地，本發明提供如下設備和方法，其中通過熒i^目關分析算法的運算來分析 觀察到的時間曲線。本發明的示例性熒i^目關分析算法確定熒光波動的時間 自相關，這提供了作為時間函數的熒光波動的持續時間的量度。這種分析提 供了關于觀察體積中分子數量的信息，以及確定觀察到的熒光中波動的方法
和員，諸如被檢測顆粒的擴散常數和擴M率。在另 一個方面，本發明的光學分析設備和方法能夠基于從穿過觀察體積 的顆粒的熒光強度曲線導出的控制信號來進行閉環反饋控制。本發明的這個 方面提供了如下光學分析方法和設備，其中可以多次檢測和表征流體樣本中 的選定顆粒。在本發明的這個方面的實施方案中，通過沿選定的容器軌跡平 移容納樣本的容器，來運送包含顆粒的樣本穿過觀察體積。收集來自觀察區域中的顆粒的熒光，從而產生時間曲線，由處理器對時間曲線進^亍實時分;f斤。 處理器具有用于分析時間曲線的模式識別算法，并且被提供成與能夠選擇性 調節移動容器的軌跡的控制器至少單向通信。通過分析時間曲線而實時測定 顆粒的特征，并且作為提供給控制器的一個或多個控制信號的基礎。在一個 實施方案中，提供給控制器的表示新的容器軌跡的控制信號能夠使選定的顆 粒在樣本掃描周期期間多次穿過觀察體積。例如，被檢測顆粒的物理或化學 特性可能表明需要進一步的光學分析以明確分類顆粒，因此，處理器產生控 制信號以起動一次能夠使目標顆粒穿過觀察體積的經修正的容器軌跡，從而 提供一個或多個另外的顆粒檢測事件。本發明還提供了能夠對引入經過光學分析的流體樣本中的離子濃度進 行積分測量的積分顆粒測量系統。在本發明的這個方面，容納樣本的容器可 操作地連接到將顆粒引入樣本的裝置。例如在一個實施方案中，在容器上連 接一個試管，用于在光學分析之前或期間使氣體起泡穿過樣本或持續或滴狀 地引入流體。流體引入系統可以連接到能夠向樣M供包含顆粒的液滴的容 器。在這些實施方案中，顆粒被連續或^t地系統提供給容器。本發明的光 學分析設備周期性地或連續地探測樣本，從而提供作為時間函數的樣本中的 顆粒的表征。例如在一個實施方案中，本發明的積分顆粒測量系統可以測量 流體樣本中積累的顆粒的濃度、大小分布、成分、亮度或者這些特征的任何 組合。本發明的這個方面對于檢測環境樣本中的病原體和/或污染物特別有 用，所述環境樣本諸如室內空氣或水中樣本。本發明的方法和設備可廣泛應用于對共焦顯微鏡的觀察體積中的通過 光致發光、化學發光和/或電致發光過程而發光的顆粒進行光學分析。例如， 本設備和方法可用于對能經歷化學發光和/或生物發光的顆粒進行識別、分 類和/或確定其濃度。在本發明的這些方面，不需要向樣本^:供激發光就可 以收集、檢測和分析來自穿過共焦顯微鏡的觀察體積的顆粒的發射。本發明 方法中的熒光可由單光子吸收過程或多光子吸收過程^L^。本方法中通過使 用諸如兩個光子激發方案的多光子激發所提供的優點是在很小的觀察體積 內具有強^A夠大的'M光，能產生適當的多光子吸收，從而4吏得由，見察體 積中產生的熒光可以凈皮收集、檢測和分析。本發明方法和設備可用于表征包括各種材料的樣本，這些材料包括但不 限于液體、膠體、分散懸液、乳狀液，溶膠以及混合物。本發明方法和i殳 備可用于檢測高度透明介質、部分透明介質以及高度散射介質中的自然發焚 光的組分或帶熒光標記的組分。本發明提供了特別適于分析生物樣本的非破 壞性的光學分析方法，所述生物樣本諸如體液、組織懸液、食物以及飲料、 從諸如重組細胞表達系統的表達系統產生的流體，以及這些樣本衍生的樣 本。本方法能夠檢測和分類低濃度的生物材料，包括但不限于原核細胞， 真核細胞，細菌，病毒，諸如蛋白質、肽、寡核苷酸、DM、 mRNA、脂類的 生物分子，以及它們的所有聚集體和復合體。通過本設備和技術可分析的材 料成分的高度多樣性使得它們適用于寬范圍的用途，包括但不限于表征細 胞材料和孩￡生物、識別生物樣本中存在的生物分子、分析食物中存在的物質、 樣本中的病原體的檢測、用于臨床診斷和治療應用的生物樣本的化驗、樣本的高通量定量分析以及用于監測蛋白質表達水平的功能測試。在另一個實施方案中，本發明提供了一種用于分析樣本中的顆粒的方 法，包括下列步驟(1)在至少部分透明的容器中提供包含顆粒的樣本；(2) 將激發光導向至樣本，從而使得樣本中的至少一部分顆粒產生熒光；(3) 收集來自樣本的觀察體積的熒光，并且將來自觀察體積的熒光導向至 光電檢測器；(4 )移動容器，從而使樣本中的顆粒穿過觀察體積；以及(5 ) 使用光電檢測器測量來自觀察體積的作為時間函數的熒光的強度，從而產生 與來自觀察體積的熒ibN應的時間曲線。可選地，本發明的這個方面的方法 還可以包括使用模式識別算法分析時間曲線的步驟。在另一個方面，本發明提供了 一種用于測定包含顆粒的樣本中的顆粒濃 度的方法，包括下列步驟(1)在至少部分透明的容器中提供包含顆粒的 樣本；(2)將激發光導向至與包含顆粒的樣本光通信的共焦顯微鏡；(3) 使用共焦顯微鏡將激發光聚焦到樣本上，從而使得顆粒產生熒光；(4)使 用共焦顯微鏡收集來自樣本中的觀察體積的熒光；(5 )平移容器，從而使 樣本中的顆粒穿過觀察體積；(6)使用定位成與共焦顯微鏡光通信的光電 檢測器，測量來自觀察體積的作為時間函數的焚光強度，從而產生與來自觀察體積的熒ibf目應的時間曲線；以及(7 )使用才莫式識別算法分析時間曲線， 從而由時間曲線測定樣本中顆粒的濃度和大小。
圖1A提供了本發明的用于測量流##本中熒光顆粒濃度的光學分析設 備的俯視圖的示意圖。圖1B示出了包括圓柱形試管的容器的放大側視圖， 并且i^示了可用于本發明的一些方法中的一致旋轉軸和垂直位移軸。圖2提供了本發明的光學分析設備的照片，包括結合了具有模式識別算 法的處理器的掃描共焦顯樣支鏡。圖3示出了使用光學分析器產生的移動穿過觀察體積的顆粒的示例性 焚光時間曲線。圖4A示出了由光學分析器產生的時間曲線(上圖)以及與時間曲線的 特樹目匹配的相應預定模式(中圖)，圖4A還示出了與時間曲線相匹配的 每個模式的相關卡方值(下圖)。圖4B提供了顯示時間曲線中觀察到的特 征(曲線A)和適合匹配該特征的預定模式(曲線B)的重疊圖。圖4C示出 了放大比例的單個模式的強度分布，并且圖4D顯示了對不均勻樣本進行分 析獲得的大小分布。圖5提供了本發明的多信道光學分析器的示意圖。圖6提供了說明本發明的示例性模式識別算法中的步驟的功能流應圖。圖7示出了本發明的設備和方法對包含熒光球體的樣本產生的示例性 光子流直方圖。圖8示出了本發明的設備和方法對包含熒光球體的樣本產生的作為顆 粒濃度函數的總計數(熒光時間曲線中的"^值)圖。圖9示出了用本發明方法對包咱、體細胞的牛奶樣本產生的示例性光子 流直方圖。圖10示出了使用本發明方法和設備產生的作為體細胞濃度的函數的總 計數(閾值附近的熒光時間曲線中的"^值)圖。圖11示出了使用采用模式識別數據分析的本發明光學分析設備的濃度 -稀^^度研究的結果。圖12示出了4艮據細菌的顯著衰減焚M焚光時間曲線產生的校準。
圖13提供了幅度直方圖(即強度分布)，表明了本發明方法基于顆粒 的強度分布對顆粒分類的能力。圖14A和14B分別示出了對照樣本和AD樣本的焚光時間曲線。圖14C 示出了從3維掃描產生的類似3維圖像，示出了大熒光寡聚物的數量(拉長 的白點)。圖15提供了對照樣本和AD樣本的聚集體濃度和大小的相關圖。 圖16A-16D示意說明了使用本發明中的多狹縫共焦孔用于測定觀察體 積中的顆粒位置。圖16A和16B示意圖示了使用單狹縫共焦孔的本發明的實 施方案，并且圖16C和16D圖示了使用雙狹縫共焦孔的本發明的實施方案。
具體實施方式
參照附圖，類似的標號表示類似的元件，并且在多于一個附圖中出現的 相同的標號指的pl:相同的元件。另外，此后，應用下列定義"流體"和"流*本"同義使用，并且指的是能夠符合容納它的容器 的形狀的任何材料。本發明的方法中可使用的流體包括但不限于液體以及 多于一種液體的混合物，諸如泡沫、乳狀液、溶膠的^^體，顆粒的分歉系， 顆粒懸浮液，以及它們的任何組合。本說明書中的流體包括生物流體，諸如 尿、血、脊髓液、細胞和非細胞血成分(包括血漿、含血小板樣本、包含紅 細胞的樣本、包含白細胞的樣本、組織提取物和組織懸液)、食物、由重組 技術產生的發酵介質、由重組技術產生的材料(包括治療和診斷材料)、由 轉基因動物和轉基因植物生產的材料(包括治療和診斷材料)、牛奶和奶產 品、水、々欠料、化學和制藥產品以及疫苗。"顆粒"指的是樣本中存在的可溶解的以及不可溶解的材料。本說明書 中的顆粒包括但不限于分子、離子、聚合物、生物分子、諸如真核細胞和 原核細胞的細胞、細胞組分、諸如細菌和病毒的微生物、病原體以及它們的 所有組分、復合體和聚集體。"生物分子"指的是由生物體產生或對活生物 體重要的分子，包括但不限于蛋白質、肽、肽激素、脂類、DM分子、RNA 分子、寡核苷酸、碳水化合物、多糖；糖蛋白、脂蛋白、糖，以及它們的衍 生物、變體、聚集體及復合體，包括具有一個或多個熒光標記的這些分子的 被標記類似物。"熒光顆粒"指的是被亂發光齓&時能夠產生熒光的顆氺立， 并且包括固有熒光顆粒和利用其與一個或多個熒光團的相互作用(共價的和 非共價的)而發熒光的顆粒，包括熒光標記顆粒、有色顆粒(stained particle )、熒光標簽顆粒以及與插入劑或染料相連的顆粒。熒光顆粒可以 與單個熒光團或多個熒光團相連。可以用可選擇性結合顆粒的具體類型或這 類顆粒的具體元素的熒光團對熒光顆粒選擇性地標記或標簽，上述類型的顆 粒諸如蛋白質和/或寡核苷酸。"焚光時間曲線"指的是作為時間函數的熒光強度的分布。熒光時間曲 線中的"特征"是指時間曲線中以作為時間函數的強度變化為特征的的部分， 對于一些應用而言，"特征"優選地指作為時間函數的強度在統計學上顯著 的變化。熒光時間曲線的特征可能是由于一個或多個顆粒存在于和/或通過 本發明設備和方法的觀察體積而造成的。"光通信"以及"光耦接"在本說明書中同義使用，并且指的是兩個或 多個設備元件的結構，其中光能夠從一個元件傳播到另一個元件。這些設備 元件可以直接被光耦接或使用各種設備組件而間接被耦接，所述各種設備組 件包括但不限于波導、光導纖維元件、反射器、濾波器、棱鏡、透鏡、光 柵，以及這些i殳備組件的4壬^r組合。術語"強度"和"多個強度"指的是電幅度或光的磁場矢量，所述光諸 如激發光或熒光。術語"強度，，和"多個強度，，可以互換使用，是指在檢測 光的時候由光電檢測器產生的信號的幅度，例如由光電二fe管或光電倍增管 產生的電流的幅度。術語"電磁輻射，，和"光"在本申請中,皮同義使用，并且指的是電波或 磁場波。可用于本發明的設備和方法中以激發熒光顆粒的電磁輻射包括紫外 線光、可見光、近紅外線、遠紅外線，或這些光線的組合。"部分透明"指的是能夠傳輸至少部分入射其上的電磁輻射的材料、設 備或設備組件的屬性。"平移"指的是設備或設備組件的位移，諸如容納用于分析的樣本的至 少部分透明的容器的移動。平移可以包括任何類型的運動，包括但不限于， 垂直位移、7jc平位移、圓形軌道運動、橢圓軌道運動、拋物線運動、直線運 動，以及這些運動方式的任何組合。平移可以提供周期或非周期運動。"預定模式"指的是作為匹配或擬合時間曲線中的特征的時間函數的強 度分布的函數形式。用于匹配特征的預定模式可以由從頭開始的方法導出， 諸如使用經適當換算或標準化的高斯函數或洛倫茲(Lorentizian)函數，
或可以例如通過測量與穿過觀察體積的已知大小、形狀和亮度的顆豐立的通過 相對應的強度分布而經驗性地導出。預定模式可以被換算、標準化或調節， 以優化預定模式與熒光時間曲線中的特征的匹配。在本發明中有用的預定模 式的函數形式取決于光檢測和表征系統的特征性試驗^lt，包括但不限于， 狄和檢測光學的對準以及位于光電檢測器前面的孔的寬度。另夕卜，在本發 明中有用的預定模式的函數形式還可以取決于被檢測和/或表征的顆粒的特 性，諸如相對于共焦顯微鏡的點傳播函數的體積的顆粒的大小、顆粒的形狀 以及顆津立的亮度。在下面的描述中，闡述本發明的設備、設備組件和方法的多個具體細節， 以便提供本發明的確切本質的透徹解釋。然而，對本領域的普通技術人員顯 而易見的是，沒有這些具體細節仍可以實施本發明。本發明提供了用于檢測、識別、分類和表征流^#本中的顆粒的方法和 設備。具體地，本發明提供了使用模式識別數據分析技術的掃描共焦顯微鏡 設備，用于測量以很低濃度存在的焚光顆粒的濃度，以及用于基于大小、形 狀、擴散常數和/或組分表征熒光顆粒。圖u提供了本發明的用于測量流體樣本中的熒光顆粒濃度的光學分析 設備的俯視圖的示意圖。光學分析設備IOO包括光源110、共焦顯樣i鏡120 以及用于容納包含顆粒的流體樣本135的至少部分透明的容器130，諸如光 學試管，用于移動容器的裝置140、光電檢測器150以及具有模式識別算法 的處理器160。在圖1A示出的實施方案中，共焦顯微鏡120包括瞄準元件 (例如針孔或狹縫)170、分色反射鏡180、笫一物鏡190、第二物鏡200和 共焦孔210 (例如針孔或狹縫)。可選地，光學分析設備100可以進一步包 括發射濾波器212、氣義濾波器214、 轉換器220、顯示器230以及設 備控制器240。光源110產生氣t光(由點線300示意表示)，其被提供到共焦顯微鏡 120。激發光可選地通過瞄準元件170，從而產生射向分色鏡180的準直激 發光。至少部分準直激發光穿過第一物鏡190，其將激發光聚焦到樣本135。 聚焦的激發光至少部分穿it^器130的壁，并且聚焦在位于樣本135內的小 觀察體積270中。提供到樣本的激發光300激發熒光顆粒，其產生熒光。來 自觀察體積270的熒光的一部分(由虛線310示意表示)被共焦顯微鏡120 收集并提供給光電檢測器150，其測量作為時間函數的熒光310的強度。盡 管熒光310通常沿與激發光300的傳播軸一致的傳播軸傳播，但是為了描述 這些圖，圖1A (以及圖5)中將熒光310顯示為稍微偏離'^t^光300，以便 將激發光與熒光區別開來。在圖1A所說明的實施方案中，來自觀察體積270 的熒光310被分色反射鏡180反射，通過第二物鏡200以及共焦孔210，并 且在光電檢測器150的感應表面(例如光電陰極或光電二&管)上成像。使 用共焦孔210以防止不是從第一物鏡的共焦平面產生的熒光到達光電檢測 器150的感應表面。本發明包括不具有瞄準元件170的實施方案，特別當光 源110包括提供不需要進一步瞄準的空間準直激i光束的激光器時。在光學分析過程中，用于移動容器的裝置140沿選定的軌跡移動容器 130,從而將包含顆粒的樣本傳送穿過觀察體積270。對于一些應用，優選 地，顆粒被一次一個地傳送進和傳送出觀察體積。在圖1A所說明的實施方 案中，用于移動容器的裝置140繞穿it^器中心并且與激發光的傳播軸相交 的旋轉軸旋轉容器130，同時沿諸如基本平行于或一致于容器140的旋轉軸 的軸垂直位移容器130。容器130的旋轉通過箭頭350示意說明，并且容器 130的垂直位移通過箭頭360示意說明(參見圖1B)。圖1B示出了包括圓柱形試管的容器130的放大側視圖。圖1B還示出了 樣本135中的觀察體積270。圖1B中還示出了旋轉-垂直位移軸385和滋義 光的傳播軸384。如箭頭350和360所示意表示的，容器130同時繞旋轉-垂直位移軸385旋轉和沿旋轉-垂直位移軸385垂直位移。容器的旋轉和垂 直平移的結合將包含顆粒的樣本傳送穿過觀察體積270,并且系統地改變觀 察體積270中的顆豐ijf目對于激發光的傳播軸384的位置。在可用于優化與測 量的熒光強度相應的信噪比的實施方案中，旋轉速率和/或垂直位移是可選 擇性調節的。本發明包括下述實施方案，其中容器130的移動方式不^^走轉 和垂直位移相結合的方式，而包括水平位移與旋轉或垂直位移相結合，或者 水平位移與旋轉和垂直位移相結合的平移方式。可選地，激發光300穿過位于光源110前面的激發濾波器214，氣發濾 波器214能夠傳輸可^L^樣本中顆粒的光波長，并且能夠基本上阻止與M 熒光顆粒產生的熒光310相應的光波長的傳輸。可選地，熒光310穿過位于 光電檢測器15 0前面的發射濾波器212 ，發射濾波器212能夠傳輸與焚光310 相應的光波長，并且能夠基本上阻止與樣本中熒光顆粒的激發波"M目應的光 波長的傳輸。可選地，分色反射鏡180能夠諸如通過優選傳輸激發光300并 優選反射熒光310來區別波長。由'激發濾波器214、發射濾波器212、分色 反射鏡180或者這些光組件的任何組合提供的波長區別增強了光學分析設 備100在檢測、測量顆粒的濃度以及分析顆粒方面的總體靈敏度。熒光310的強度由光電檢測器150作為時間函數檢測，從而產生來自觀 察體積270的熒光的時間曲線。在圖1所示的實施方案中，由m轉換器 220將對應于光電檢測器150的光電流的輸出信號#擬信號轉變為數字信 號，并且輸出信號被送到處理器160，諸如具有模式識別算法的微計算機。 圖1中所示的箭頭表示從光電檢測器150產生的輸出信號的通信。模式識別 算法的操作將預定模式與時間曲線中的特征匹配，并JME給定的樣本掃描時 間內對匹配數量計數。用于匹配特征的預定才莫式可以通it^頭開始的方法導 出，諸如使用經適當換算或標準化的高斯函數或洛倫茲函數，或可以諸如通 過測量與穿過觀奮本積的具有已知大小、形狀和亮度的顆粒的通^目對應的 強度分布而經驗性地導出。由于匹配預定模式的特征對應于在樣本中被檢測 的顆粒，所以可以利用在給定樣本掃描周期內穿過觀務沐積的樣本凈體積的 結果來實現對顆粒濃度的測量。在一個實施方案中，在給定樣本掃描周期內 穿過觀察體積的樣本凈體積是通過用給定樣本掃描周期內的容器130軌跡 的凈長度乘以共焦顯微鏡120的點傳播函數的體積。使用具有的點傳播函數 體積約等于lxl0VW的共焦顯微鏡，以及1分鐘數量級的樣本掃描時間， 使得穿過觀察區域的凈體積為毫升數量級。在一些應用中，優選使用具有點 傳播函數的體積范圍在1 x 105 jam3至大約5 x 1()7jum3之間的觀察體積。本發 明的模式識別算法可以是數據濾波算法的組件，所述數據濾波算法能對與穿 i^見察體積的顆粒的通it^目對應的時間曲線中的特征進行識別并計數。可選地，模式識別算法的運算還基于大小和/或形狀對觀察中的顆粒分 類。在一個實施方案中，通過評估與時間曲線中的特似目匹配的預定模式的 幅度和形狀來實現分類。例如，與時間曲線中的特斜目匹配的預定才莫式的寬 度與觀察體積中的顆粒的駐留時間、顆粒的大小、顆粒的形狀或顆粒的擴散 常數相關。可選地，模式識別算法的運算還通過測定與時間曲線中的特似目 匹配的預定模式的總積分強度，基于顆粒的亮度對觀察體積中的顆粒進行分 類。在一些例子中，基于亮度的對顆粒的區分提供了與結合到選擇性熒光標 記的分子的身份和豐度相關的信息，所述選擇性焚光標記諸如熒光抗體標簽 或熒光DM探針。
可選地，模式識別算法的運算還例如通過4^供諸如卡方值的表示每個匹 配特征的統計學顯著性的M，產生表征預定模式對觀察到的時間曲線的擬 合質量的一個或多個統計學指標。在一個實施方案中，本發明的才莫式識別算 法利用每個測量的標準差估計，通過對特征和與該特征匹配的預定模式之間 的差別進行加權，來計算每個匹配的卡方。可選地，模式識別算法的運算還 能以很容易由操作人員進行評價的格式產生可以表示處理數據和結果的輸 出，所述處理^t據和結杲例如諸如顆粒濃度、顆粒的大小分布和/或顆粒的 亮度分布。例如在一個實施方案中，模式識別算法產生一個直方圖，顯示與 最大強度或匹配特征的總積分強度相對應的匹配特征的數量。再次參照圖1A，光學分析設備100可選地進一步包括設備控制器240 和/或顯示器230。設備控制器240可操作地連接到用于移動容器的裝置140, 并且被提供成與處理器160至少單向通信。在一個實施方案中，設備控制器 從處理器160接收輸出信號(以箭頭示意示出)，并且能夠產生具有選定位 移速率的容器130的選定軌跡，例如使選定目標顆粒往復穿itifit^見察體積 270的軌跡。顯示器230被提供成與處理器160至少單向通信，并且能夠顯 示未處理的熒光數據、諸如與預定模式匹配的時間曲線的已處理數據以及模 式識別算法運算的其它結果，諸如與預定模式匹配的特征的數量、顆粒的濃度、顆粒的大小分布、顆粒的亮度分布以;ML征與觀察到的時間曲線擬合質量的統計學指標。圖2提供了本發明的光學分析設備的照片，所述分析設備包括結合了具 有模式識別算法的處理器的掃描共焦顯微鏡。圖2中示出的裝置包括具有臥 式形狀的小共焦顯微鏡以及容納圓柱形試管(直徑大約lcm)的M裝置， 所述機械裝置帶有提供旋轉運動(大約5轉/秒)和較慢垂直反轉 (inversion)運動(大約2. 5厘米/秒)的兩個馬達。慢垂直掃描有利于確 保后續垂直掃描中探測的觀察體積的統計獨立性。光照焦點集中在距離樣本 內的試管壁大約200孩i米處。為了產生激發光，提供了包括耦接到具有60nm的FWHM的525nm帶通濾 波器上的卣素燈的光源、提供515nm激發光的氬離子激光器(stabilite 2017， Spectra-Physics )、或提供532nm激發光的釹釔激光器。這個試驗 配置中的用于檢測顆粒所需要的光源輻射功率低于lmW。提供的物鏡是 Kyowa20x (N.A. 0.40)。在光電檢測器前面拔_供了長*射光濾波器，以 避免檢測由分色M射的任何激發光。使用包括光電倍增管(PMT) HC120 (Hama咖tsu)的光電檢測器實現熒光檢測。來自PMT的信號被輸入到^Uf 道12比特A/D獲取卡中。以可變時間分辨率(1/40kHz - 0. 025ms或更少) 對光電流進行采樣。作為時間函數每時間門(bin)給出光電流的信號的時 間軌跡被存儲在計算機中，并且使用我們稱之為simFCS的全面分析軟件進 行分析。在很多其它功能中，simFCS計算自相關函數以及光子計數直方圖。 simFCS還包括具有顆粒通過模式識別算法的相關濾波器程序。濾波器的功 能是將預定模式與時間曲線中的特似目匹配。與時間曲線中的特征匹配的模 式的寬度與顆粒通過光照體積的時間相關。配置該系統以便獲得陽性事件的 直方圖并且可觀察個體匹配。基于顆粒通過模式識別的相關濾波器程序允許 在少于1分鐘的掃描時間中對低亮度的顆粒進行亞阿托摩爾檢測。
在本發明中，在光學分析期間分析的總體積與總樣本掃描周期(或檢測 時間)成正比。通過下面的表達式定義在共焦顯微鏡中估計的點傳播函數體 積(VPSF):
VSPF = (Lx) x (Ly) x (Lz) (1)
其中Lx為沿X方向的觀察的長度，Ly為在Y方向上觀察的長度，Lz為在Z
方向上觀察的長度。當在光電檢測器的前面提供矩形狹縫時，Lx和Ly對應
于與激發光的傳播軸正交的軸，并且使用狹縫的物理維度和共焦顯微鏡的放 大因子來計算，并且Lz對應于與激發光的傳播軸平行的軸，并且使用系統 的物理光學來計算。在一個實施方案中，Lx、 Ly和Lz分別等于70樹來、500 微米和150微米。用公式1計算出的點傳播函數體積等于5 x 106微米3。 VSPF = (70pm) x (500jim) x (150pm) =5xl06(|im)3 使用下面的表達式計算包括旋轉和垂直反轉的移動的容納樣本的至少 部分透明的容器的軌跡的總長度(L):
L - 7T (d試管)x (Vr) (t) (2) 其中d試管為試管的直徑。Vr為試管的旋轉速度，t為樣本掃描周期(或檢 測時間)。對于樣本掃描周期等于100秒，試管的直徑等于1厘米并且旋轉 速度等于5轉/秒的情況，使用公式2計算出的軌跡總長度值等于1. 6 x 107 微米
丄=;r(lcm)(^")(100秒)("10戸)=1.6 x 107戸 秒 1，
通過下面的表達式提供在樣本掃描周期期間探測的總體積(V):
V = (L) x (截面積) (3 )
其中L是軌跡的總長度，截面積是觀察區域的橫截面面積，諸如沿與激發光
的傳播軸平行和/或一致的軸的觀察區域的沖黃截面面積。在一個實施方案中，
Ly和Lz分別等于500 ^L米和150賴沐，用下面的表達式來計算出截面積
截面積=<formula>formula see original document page 29</formula>
將7. 5 x 104平方微米的截面積和1. 6 x 107微米的軌跡總長度仏)(參見
上面的計算)代入公式3,得到在掃描期間探測的總體積(V)等于1. 2ml。
<formula>formula see original document page 29</formula>
1x10拜
因此，在該試驗配置中，在100秒的測量時間內探測了多于lml的體積。 該計算說明本發明的設備和方法在合理的短掃描時間內檢測非常低濃度(幾 個/毫升)的能力。
重要的是應注意到樣本流體從不"i^"設備的內部工作區。仔細過濾 以防止堵塞并不是必需的。不必經常清潔以防止污染物或細菌生長。樣本也 沒有在流式細胞術中丟失。它保留在試管中，并且因此如果需要可以用于進 行其它試驗。本發明的這個屬性在針對^^獲得的樣本時特別有利。
圖3示出了使用本發明的光學分析器產生的移動穿過觀察體積的顆粒 的示例性熒光時間曲線。Y軸對應于以任意單位表示的強度并且x軸對應于 以任意單位表示的時間。圖3中示出的時間曲線是使用約等于300轉/分(5 轉/秒)的旋轉速度的容納樣本的容器的旋轉以及約等于1厘米/秒的速率的 容納樣本的容器的垂JL^轉的結合來獲得的。在時間約等于9， 230和9， 520 的時間曲線中的特征對應于穿過觀奮本積的顆粒的通過。圖4A示出了由光 學分析器產生的時間曲線(上圖)以及與時間曲線中的特似目匹配的相應預 定模式(中圖)。圖4A中還示出了與時間曲線相匹配的每個模式的相關卡方 值(下圖)。圖4B提供了顯示在時間曲線中觀察到的特征(曲線A)以及擬 合匹配該特征的預定;f莫式(曲線B)的重疊圖。與該特征匹配的預定模式的 形狀是由高斯函數來確定的。使用高斯函數提供了穿過觀察體積的顆粒的運 輸的第一近似。本發明的方法還包括根據系統和用途而使用具有更復雜功能 性的預定模式。圖4C示出了放大比例的單個模式的強度分布，并且圖4D顯 示了對不均勻樣^i^f亍分析獲得的大小分布。
圖5提供了本發明的多信道光學分析器的示意圖。多信道分析器600還 包括分束器601、附加物鏡610、附加共焦孔620、附加發射光濾波器630
以及附加光電檢測器640。定位分束器601以使其反射來自觀奮*積270的 熒光。如圖5所示，該反射光穿過附加物鏡610和附加共焦孔620，并且在 附加光電檢測器640上成像，能夠測量作為時間函數的焚光強度。在本發明 的可用于同時地和獨立地監測與觀察區域中的顆粒相結合的多個不同熒光 探針發出的熒光的實施方案中，光電檢測器150和附加光電檢測器640分別 帶有能透過選定波長分布的光的不同發射光濾波器。因此，本發明的這一實 施方案產生對應于來自不同熒光探針的多個熒光時間曲線，對這些曲線進行 分析可以提供基于成分對顆粒分類的有用信息。替代地，在本發明的其它實 施方案中，光電檢測器150和附加光電檢測器640分別帶有不同大小的共焦 孔。因此，本發明的這一實施方案產生對應于不同大小的觀g積的多個熒 光時間曲線，對這些曲線進行分析可以提供基于大小和/或形狀對顆粒分類 的有用信息。
圖6提供了說明本發明的示例性模式識別算法的步驟的功能流程圖。如 該圖所示，首先選擇諸如高斯函數的函數類型作為用于擬合時間曲線中的特 征的預定才莫式的基礎。接著，將濾波器應用到具有選定長度的熒光時間曲線 的區段，所述選定長度諸如近似等于模式長度的長度。改變預定模式的強度 并JL^;I^:極限設置內獲得最小二乘擬合。如果獲得匹配，那么該特征凈皮記 錄為顆粒檢測事件并且保存該強度。如果還需要獲得大小分布，那么在最大 和最小寬度設置之間掃描模式寬度，并保存與最佳擬合相對應的模式寬度。 然后對時間曲線的下一個時間間隔重復該過程。
本發明的方法和設備可以使用各種光學、電子和,設備組件。在本方 法中可用的光源可以包括窄帶相干光源，諸如激光器以及窄帶燈光源。替4戈 地，只要能提供諸如光千涉濾波器、衍射光柵或單色儀的波長濾波元件而獲 得具有足夠窄波長分布的激發輻射，使得可以對來自觀察區域中的顆粒的發 射進行靈敏的檢測，寬帶燈也可以被用作本發明中的光源。光源包括但不限 于激光器、窄帶燈(例如水4艮弧光燈)、寬帶燈(例如氘燈、氙氣燈、卣 素燈或熒光燈， 一個或多個發光二極管(LED))。
本發明中可以使用常規共焦光顯微鏡，常規共焦光顯微鏡包括與光源光 通信的瞄準元件(例如針孔或狹縫)、分色反射鏡、物鏡和與光電檢測器光
通信的共焦孔(例如針孔或狹縫)。使用與光源光通信的瞄準元件(例如針 孔或狹縫)在本發明中是可選的，特別可用于光源為諸如激光源的具有小的
點大小的空間相千光源的實施方案。本發明中可以使用提供具有固定位置的 共焦體積的共焦顯微鏡，以及例如通過旋轉分色反射鏡而提供具有可選擇性 變化位置的共焦體積的共焦顯微鏡。本發明中的共焦顯微鏡可以具有固定大小的共焦孔或可選擇性變化大小的共焦孑L,并且可以水平或垂直幾何光學方 式提供。在本方法和設備中可用的容器包括任何形狀的容器，所#器至少能部 分透過激發光和來自顆粒的發射光。對于需要高檢測靈敏度的光學分析應 用，可用的容器應能高度透過激發光和發射光。對于在光學分析期間要旋轉 容器的顆粒分類測量而言，使用在不同旋轉位置時對激發光和來自顆粒的發 射光都具有基4^t定的透射率(例如在穩定在大約10%之內，或對一些應用 而言優選地穩定在大約5%之內)的容器(例如圓柱形試管或光學池)是特 別有用的。用于移動容納樣本的容器的任何裝置都可以在本發明中用于提供容器的平移、旋轉或平移;^旋轉，所述裝置包括馬達、開關電子器件和/或偏心 旋轉板機構。對于一些應用而言，優選使用不易受M波動和/或震動影響的移動容納樣本的容器的裝置。然而，本發明的光學分析方法和i殳備并不太 容易受由機械波動和/或震動引起的誤差的影響，所述4城波動和/或震動發 生的時間尺度比顆粒穿過觀察體積的時間尺度長得多(即至少3倍)。任何光電檢測設備都可用于本發明，包括但不限于光電倍增管、諸如雪 崩光電二歐管的光電4管和光電導檢測器。在本發明中可用的光電檢測器 可以帶有信號放大器、終端負載、才 轉換系統、電子濾波系統或本領域已 知的4壬何等同物。本發明的光電檢測器可凈皮配置用于光子計數。本發明的方法和設備可與計算機輔助自動控制系統相結合，因此非常適 于大量樣本的高通量光學分析。在本發明中可用的處理器包括孩i型計算機、 通用計算機或能夠運行應用軟件的處理系統。在本發明中可用的示例性計算 機包括微型計算機，諸如IBM個人計算機或其適當的等同物，以及工作站計 算機。優選地，本發明的模式識別算法被M在計算機可讀介質中，諸如計 算機壓縮光盤(CD ROM )、閃存設備或軟盤。此外，計算機可讀^h質可以是 石更盤或存儲芯片的形式，諸如隨機訪問存儲器或只讀存儲器。如本領域的普通技術人員所理解的，可以使用《^f可適當的編程語言寫出 實現本發明的數據分析方法和模式識別算法的計算機軟件代碼。示例性語言 包括但不限于，C或C的任何版本、Perl、 Java、 Pascal,或這些語言的4壬 何等同物。盡管對于本發明的一些應用而言，優選地使用計算機實現本發明 的所有步驟，但是也考慮了可以使用計算機來僅執行本方法的特定步驟或選 定的系列步驟。在此已經采用的術語和表達被用作描述而不是限制的術語，并且使用這 樣的術語和表達并不意在排除所顯示和描述的特征的任何等同物或其部分， 而M當認為在所請求保護的本發明的范圍之內可以i^f亍各種修改。因此， 應當理解，盡管已經通過優選實施方案以及可選特征具體公開了本發明，但 是本領域普通技術人員可以對本文公開的思路進行修改和變化，并且認為這 樣的修改和變化也在所附的權利要求所定義的本發明的范圍之內。在此提供 的具體實施方案是本發明可用的實施方案的實例，并JL^本領域的普通技術 人員顯而易見的是，使用大量不同的本說明書中闡述的設備、設備組件、方 法步驟均可以實施本發明。本發明有用的方法和設備可以包括大量可選的設 備元件和組件，包括但不限于光纖元件、溫度控制器、諸如FP標準具、高 通截止濾波器和低通截止濾波器的光濾波器、諸如瞄準透鏡和反射鏡的瞄準 元件、觸發脈沖發生器、激光器、單色儀、棱鏡、衍射光柵、諸如聚焦透鏡 和反射鏡的聚焦元件、反射鏡、起偏鏡、光纖耦合器和發射器、溫度控制器、 溫>1傳感器、寬帶光源和窄帶光源。下面的參考文獻總體涉及數字信號處理和模式識別(1) "Algorithms and Applications", John G. Proakis、 Dimitris G. Manolakis, Prentice Hall,第三版，1995年；(2) "Discrete Time Signal Processing"笫二 版，A.0ppenheim、 Schaf er和J. Buck, Prentice Hall, 1999年；(3) "Discrete-time Processing of Speech Signals" ，J.R.Deller、 Jr.、 J. H.L Hansen和J. G.Proakis， IEEE Press, 1999年以及(4) "Pattern Classification ( 2001 )" Duda、 Hart和Stork, Wiley-Interscience。下 面的參考文獻涉及使用光子計數直方圖分析和波動相關分光鏡分析解析熒 光數據的分析方法(1 )"The Photon Counting Histogram in Fluorescence Fluctuat ion Spectroscopy", Y. Chen、 J. D. Muller、 P. T. C. So和E. Gratton, Biophys. J. ， 1999年7月，頁碼553-567， 77巻，號碼1; ( 2 )美國專利 6, 794, 659; (3) "Two photon fluorescence correlation spectroscopy: method and application to the intracellular environment ，，， K.M. Berland、 P. T'C. So和E. GraUon， Biophys. J. ， 1995年，68巻，頁石馬 694—701; (4) "Fluorescence Correlation spectroscopy. I.Conceptual Basis and Theory" ， E丄Elson和D.Magde， Biopolymers， 1974年，13巻， 頁碼 l一27; (5) " Fluorescence Correlation spectroscopy. II. An Experimental Realization ，， ， D. Magde 、 E丄Elson 和 W. W. Webb, Biopolymers, 1974年，13巻，頁碼29-61; ( 6 ) "Fluorescence correlation spectroscopy: inception, biophysical experimentations and prospectus" ， W. W. Webb, A卯l. Opt, 2001年，40巻，頁碼3969-3983; 以及(7) "Fluorescence-intensity (Ustribution analysis and Us application in biomolecular detection technology" ，P.Kask、 K.Palo、 D.Ullmann和〖.Gall，Proc. Natl. Acad，Sci，， 1999年，美國，96巻,頁碼 13756-13761。關于通過51用和變體并入本說明書的聲明整個申請所引用的所有參考文獻，例如包括頒發或授權專利或等同物的 專利文獻；專利申請公開；以及非專利文獻或其它來源的資料，在此通過引 用的方式將其4^內容納入本說明書，如同通過個別引用的方式納入一樣， 引用的程度為每個參考文獻中至少與本申請中的公開內容相應的部分(例 如，通過引用的方式引入與本申請有部分不一致的參考文獻，但是參考文獻 中不一致的部分除外)。除非另有聲明，在此描述或例示的組件的每個表述和組合都可以用于實 施本發明。無iM可時在說明書中給出范圍，例如，溫度范圍、時間范圍或組成或濃 度范圍，則意在本發明公開內容中包括所有的中間范圍和子范圍以及所有包 括在所給范圍中的單個值。應當理解的是，本說明書中包括的范圍或子范圍 中的任何子范圍或單個值都可以沒有包括在權利要求中。本說明書中提及的所有專利和公開文獻都可表示本發明所屬技術領域 的普通技術人員的水平。在此所引用的參考文#此通過引用的方式將其全 部內容納入本說明書，以表示
公開日或提交日時的現有技術，并且意在表示 本文可以使用該信息，并在需要時用于排除現有技術中的具體實施方案。在本文中所使用的"包括"與"含有"、"包含"或"特征在于"同義， 意為包括或開放式的，并且并不排除附加的、未列舉的要素或方法步驟。本 文中所使用的"由......組成"排除沒有在權利要求要素中指定的任何元件、步驟或成分。本文所使用的"基本由......組成"并不排除本質上不影響權利要求的基本特征或新穎特征的材料或步驟。在本文的任何情況中術語"包 括"、"實際由……組成"和"由……組成"中的任何一個都可以被另外一個 或兩個術語替代。本文所述的本發明可以適合在缺少在此沒有具#^>開的任 何元件或元素或限制的情況下實施。本領域的普通技術人員應當理解，采用本文未具體示出的那些起始材 料、材料、試劑、合成方法、純化方法、分析方法、測定方法，不需進行過 多試驗，就可以實施本發明。本發明意在包括任何這樣的材料和方法的所有 公知的功能等同物。已經采用的術語和表述被用作描述性的而不是限制性的 術語，并且在使用這樣的術語和表述時不希望排除所顯示或描述的特征的任 何等同物或其部分，但^當認識到在請求保護的本發明的范圍之內可以進 行各種修改。因此應當理解的是，盡管本發明已經通過優選實施方案和可選 特征凈皮具^^開，但是本領域的普通技術人員可以對在此公開的思路進4刊務 改和變化，并且認為這樣的修改和變化也在如所附權利要求定義的本發明的 范圍之內。實施例l:在清澈和渾濁介質中分析熒光球體為了mi3晴確測量樣本中顆粒的濃度的能力，將本發明的光學分析設備 用于測定含有散射樣本的清澈緩沖溶液和Lyposin溶液(20%重量，1: 80稀 釋)中的直徑為l.Oum的橙色熒光球體(Molecular Probe F-8820)的濃 度。在上述測量中使用帶有綠光濾波器(525nmi60nm)的小卣素燈作為4I:供 激發光的光源。使用采用1分鐘樣本掃描時間的本光學分析設備可以測量在 這些樣本中的低至幾百個球體/毫升的橙色熒光球體的濃度。圖7示出了示例性光子電流直方圖，并且圖8示出了使用本方法和i殳備 產生的作為顆粒濃度的函數的總計數圖(熒光時間曲線中的峰值)。如圖8 所示，在所檢測的濃度的寬范圍上有很好的線性擬合。該研究的結果表明本 方法和設備非常適于測定在光透明樣本和散射樣本中的熒光顆并立的濃度。為了可重復地險測和測量甚至更低的濃度，例如低至幾個顆粒/毫升的 濃度，使用具有坤莫式識別算法的相關濾波器程序分析使用本方法產生的萸光 時間曲線。光子計數直方圖除了包括來自目標顆粒的信號^卜，還包括來自 背景的貢獻以及^^^轉的影響。簡單數據濾波(諸如低通^t據濾波)并不 足以實現目標檢測靈敏度，特別是當處理散射介質中的微弱顆粒的時候。具 有才莫式識別算法的相關濾波器程序在掃描期間識別光照體積中的目標顆粒 的通過，并將該事件記錄為命中，同時還記錄其強度幅度并可選地記錄其總 積分強度。為了評價模式識別算法的效果，使用熒光球體進行儀器校準。圖ll示 出了使用采用模式識別數據分析的本發明光學分析設備所得的濃度-稀釋度 研究結果。圖11示出了當濃度增加時所檢出事件(顆粒)的數量的飽和。 這是預期的結果，這是因為在高濃度時觀恭沐積中同時存在多于一個顆并立的 可能性增加了。然而，通it^發射側改變針孔降^C察體積、執行考慮了堆 積可能性的線性曲線，或通過在光學分析之前簡單稀釋樣本，可以直接校正飽和的影響。然而，在曲線的低濃度部分不需要fcE飽和的影響。在該狀態 中，如圖11中的插圖所示，該線性極好地下降至很低的濃度(幾個/毫升)。 對于這些測量來說，采用大約1分鐘的掃描時間。實施例2:對牛奶中的體細胞計數的分析。乳腺i^乳牛花費最高的疾病。估計在美國每年由于該疾病導致的總損 失是大約15至30億美元。由于牛奶中的細胞計數與乳房健康密切相關，所 以體細胞計數(SCC)被作為牛奶質量的國際標準量度。因此，當前需要用 于測量牛奶中體細胞計數的廉價、可靠和便攜的方法和設備。用實驗驗證了本發明光學分析設備測定體細胞的濃度的能力。在這些測 量中，從伊利諾斯州大學的乳牛研究中心獲得新鮮的牛奶。在分析之前用 TRIS緩沖液將牛奶樣;^釋到1/4濃度。最初的試驗是對包括來自正接受 治療乳腺炎的母牛的牛奶的樣本ii行的。測得來自這種來源的牛奶中的相應 的體細胞數約為1， 000， 000個細胞/毫升。在這些試驗中，對樣本ii行十倍 稀釋，使得可以分析具有大約105個細胞/毫升到大約106個細胞/毫升的體 細胞數的稀釋樣本。在光學分析之前向樣本中加入洗滌劑(Triton-X 100) 以使細胞膜破裂。另夕卜，加入10孩傳爾級濃度的嗅化乙錠(Molecular Probe， E-1305 )對體細胞進行熒光標記。所添加的嗅化乙錠與細胞中的DM相結合， 結合后其熒光會比游離形式增強大約20倍。
圖9示出了用本發明方法對于包含體細胞的牛奶樣本產生的示例性光 子電流直方圖。圖9所示的直方圖的展寬明顯^t決于樣本中熒光顆粒的濃 度。為了產生該系統可用的校準曲線，設置了熒光強度閾值以確定將熒光時 間曲線中的哪個特征識別為體細胞的陽性檢測。圖io示出了使用本發明方閎中的峰值)圖。如圖IO所示，在所檢測濃度的可用范圍內具有很好的線性 擬合。此外，對原始數據的重復分析表明校準曲線的線性對熒光強度閾值的 選捧并不十分敏感。實施例3:大腸桿菌的光學分析用實驗驗證了本發明測量諸如細菌的微生物濃度的能力。在這些試驗 中，將大腸桿菌在溫度為37匸、LuriaBroth培養基中以及在振蕩式培養箱 (New Brunswick Scientific, C24 )中300轉/分的搖動條件下繁殖幾個小 時。然后使用MOPS緩沖液稀釋樣本。用一種DM探針Sytox Orange對細菌 進行標記。圖12示出了根據細菌顯著衰減熒M熒光時間曲線產生的校準。 如圖12所示，采用l分鐘掃描時間能夠測量遠低于100個/毫升的濃度。另 外，用于數據分析的軟件還執行強度分析。圖13提供了幅度直方圖(即強 度分布)，表明了本發明方法基于顆粒強度分布對顆粒分類的能力。實施例4: A0蛋白質聚集體的M測本發明的目的之一是檢測和測量生物樣本(例如體液)中蛋白質聚集體的濃度。為了評價本發明的這一應用，用實驗驗證了本發明光學分析設備和方法測量低濃度的淀粉樣變蛋白P的寡聚物聚集體的能力。由尸體解剖獲得來自阿爾茨海默病受試者和年齡匹配的對照受試者的腦脊髓液樣本(AD n=19;對照n=21平均死后時間〈3. 5小時)，用熒光素-人A P (1-42 ) (FL42 ) (Anaspec, Inc )對樣本進行標記，并根椐從Pitschke改良的方法通過FCS進行測定。采用兩光子激發(780nm，鈦藍寶石激光器，模式鎖定，150fs脈沖，6-9mW樣本)以降^f樹探針的光破壞并更好的確定采樣體積。利用以光子計數才莫式工作的EG&G型SPCM-AQR-15雪崩光電二極管進行檢測。將激光器光照通過40 x NA-l. 4的油物鏡聚焦于在8槽玻片(8-chamber slide)中的10孩i升樣本滴上。使用單個分子檢測以及焚光
素和熒光素-溶菌酶的相關分析來校準儀器。16比特的數據采樣率在 16-32kHz范圍內以識別單個分子事件。將10mM NaPi-O. 2%w/v SDS， PH7. 5中的FL-42稀釋至100nM，并在CSF 樣本中加入0.02"/。 SDS以標記內源性的寡聚復合體。在AD樣本中觀察到高 于游離熒光肽背景的高亮度顆粒。在測量時間期間，未標記的CSF樣本或 10mM NaPi， PH7. 5中的100nM FL-42均不產生在被標記CSF樣本中觀察到 的高亮度寡聚物。高亮度寡聚物被檢測為稀少事件，估計的數量濃度〈1 pM。這些大的寡 聚物擴散很慢，并且大部分采樣時間為事件之間的等待時間。我們預計由于 寡聚物的低濃度和慢擴散的雙重性質，對于一次測定就將需要數天時間才能 獲得足夠的統計學數據。為了在最短的時間內采集到足夠的事件以便進行有意義的比較，在保持樣體積。不掃描共焦圖^^續監控約in'的體積。'利用4毫秒周'期掃曰描2:jLim直徑的圓中的共焦點，采樣約O. 5pl的體積。在X-Y為45 x 45 ym的平 面上進行光柵掃描，在60|im的Z-軸上以3|idi的增量進行掃描，采樣約 120pl。圖14A和14B分別示出了利用以兩光子^t^模式工作的常規掃描共焦顯 微鏡分別對對照樣本和AD樣本獲得的熒光時間曲線。圖14A對應于靜態的 對照和AD ( 20分鐘)，圖14B對應于3維AD樣本波束掃描(XY光柵掃描+z 步幅；90秒)。圖14A中如測量峰值寬度所示，強烈的尖峰基于其慢擴散被 解釋為大的寡聚AP復合體。在該尸體解剖CSF樣本的小樣本中，對照組受 試者(n=22，平均3， 105 ± 0. 648峰值S. D.)可以以p-0. 00346的顯著度與 AD組受試者(n-18，平均6. 053± 0. 800峰值S.D.)相區別。盡管兩組之間 是可以分開的，但是部分因為觀察到的時間的數量較小，所以在個體上還有 重疊。圖14B中示出的3維掃描被轉化成準3維圖像。圖14C示出從3維掃 描產生的準3維圖像，示出了大熒光寡聚物的數量(拉長的白點)。使用具有模式識別算法的相關濾波器程序分析使用本方法和設備獲取 的熒光時間曲線，并且測定拉長顆粒的大小分布，所述顆粒諸如淀粉樣變蛋 白P的聚合體和聚集體。圖15提供了對照樣本和AD樣本的聚集體濃度和大 小的相關圖。實施例5:用于更好定位和固有亮度測定的具有多狹縫共焦孔的光學分析器 可選地，本發明的光學分析器和分析方法利用多狹縫的共焦孔光配置。 除了提供顆粒濃度、顆粒亮度和/或大小特征的測量之外，本發明的這個方 面的分析器還能夠測量觀察體積中的顆粒的位置和/或軌跡。本發明的這個 功能方面使得可以使用大觀察體積進行精確的光學分析，從而使得能夠在光 掃描期間分析大樣本體積。在這些實施方案中確定顆粒位置和/或恥逆的測 定可增強檢測顆粒和表征顆粒亮度方面的靈敏度，因為在分析期間獲取的位 置信息消除和/或最小化了關于所檢測顆粒的絕對強度或亮度的不確定性。在本發明的這個實施方案中，在樣本和光電檢測器之間提供了多狹縫共 焦孔，以便來自觀察體積的至少部分熒光在由光電檢測器檢測之前穿過多狹 縫共焦孔。本文所使用的術語"多狹縫共焦孔"指的是包括多個狹縫和/或 針孔的設備組件，它們對稱或不對稱地空間分布在光電檢測器的前面，并且 能使入射熒光至少部分透射。多狹縫共焦孔可以具有任何數量的狹縫和/或 針孔，提供對顆粒的精確光檢測和/或表征，并且所提供的狹縫或針孔可以 具有相同或不同的面積。對于一些光學分析應用而言，使用包括兩個具有基 ^目同的狹縫面積的共焦狹縫的雙狹縫共焦孔(及具有兩個狹縫)是有益的。 在本發明的這個方面的實施方案中，多狹縫共焦孔可以是共焦顯微鏡的組 件。本發明的一些應用中，可用的多狹縫共焦孔包括多個寬度范圍為大約5 微米到大約IOO微米的狹縫，這些狹縫彼此的間隔是相等的，間隔范圍為大 約5微米到大約500微米。本發明的一些應用中，可用的多狹縫共焦孔包括 對稱分布在光電檢測器前面的多個狹縫。在本發明的分析器和分析方法中，使用多狹縫共焦孔來增強關于光照曲 線的中心的熒光顆粒的位置和/或軌跡的確定。所述多狹縫配置采用在單個 光電檢測器前面的多個狹縫，不同于位于單個檢測器前面的單個狹縫。圖 16A-16D示意說明并比較了在本發明中使用單個狹縫和多狹縫共焦孔用于確 定觀察體積中的顆粒位置和/或,。圖16A和16B圖示了使用單個狹縫共 焦孔的本發明的實施方案，圖16C和16D圖示了使用雙狹縫共焦孔的本發明 的實施方案。圖16A和16B示出了精確穿過共焦體積的中心的第一顆粒M (16A) 以及偏離共焦體積的中心的第二顆粒軌跡(16B)。圖16A和16B(這些圖的 上部)還顯示了對每個單個狹縫共焦孔配置的預測的熒光時間曲線。圖16A 和16B的比較顯示隨著顆粒偏離觀察體積的中心，熒光時間曲線的寬度增 加。因此，測量時間曲線的特征的寬度提供了一種確定顆粒位置和/或軌跡 的方法。多狹縫共焦孔的引入大大提高了測得的顆粒位置和/或軌跡的準確性和 精確度。圖16C和16D示出了精確穿it^見察體積的中心的第一顆粒^LilL( 16C) 和偏離觀察體積中心的第二顆粒軌跡(16D)。圖16C和16D(這些圖的上部) 還顯示了對每個雙狹縫共焦孔配置的預測的熒光時間曲線。圖16C示出了當 顆粒精確穿過觀察體積(即共焦體積)的中心時，時間曲線以兩個相同的尖 峰為特征。然而，如圖16D所示，隨著顆粒4^移動遠離觀察體積的中心， 在熒光時間曲線中的兩個峰值展寬并最終合并為單個寬峰(16D)。熒光時間 曲線中的這種從兩個峰值到單個峰值的轉變提供了 一種表征顆粒位置和/或 軌跡的有用的方法。例如在一個實施方案中，將與一個給定檢測事件相對應 的觀察到的時間曲線中峰值之間的時間間隔用于定量表征顆粒在觀察體積 中的位置(例如，如圖16A-16D所示的顆粒沿Z軸的位置)。4吏用多狹^^ 焦孔獲取的時間曲線中兩個最大值之間的時間4^供了重務f言息，可用于提高 對顆粒位置、顆粒軌跡和/或亮度強度的測量的精確度。使用多狹縫共焦孔 幾何光學觀察到的峰值形狀和間隔的變化也可以用于本發明中以確定顆津立 形狀。當顆粒穿i^見察體積時，測量到的熒光取決于顆粒的固有亮度(或強度) 以及其軌跡在光照路線中的具體位置，越靠近共焦體積的中心，亮度就越高。 在一個實施方案中，該系統能夠分析使用多狹縫配置產生的不同的熒光時間 曲線(例如通過測量觀察到的時間曲線中的兩個或多個峰值之間的時間間 隔)，并且正確地定位顆粒沿Z軸的位置(如圖16A-16D所識別的)。在知道 顆粒沿Z軸的位置(如圖16A-16D所識別的)后，就可以提高計算顆粒的強 度/亮度時的精確度。使用這種新方法，仍然有無法確定的，關于共焦平面 的反射對稱，其并不影響光照強度的計算。對使用多狹縫共焦孔光幾何學產 生的時間曲線的分析可以使用^^種方法來進行分析，所述方法包括但不限于 模式識別數據分析技術、光子計數直方圖分析以及波動相關光諳學方法。
權利要求
1. 一種用于分析樣本中顆粒的設備，所述設備包括 至少部分透明的容器，用于容納包含所述顆粒的所述樣本；光源，用于產生提供給所述樣本的激發光，從而使得至少部分所述顆粒 產生熒光；用于收集來自位于所述容器內的觀察體積的熒光的裝置；用于移動所述容器的裝置，從而使至少部分所述顆粒傳輸穿過所述觀察體積；以及與所述用于收集熒光的裝置光通信的光電檢測器，用于接收來自所述觀 察體積的至少部分所述熒光并測量其強度，從而產生所述焚光的時間曲 線。
2. 根據權利要求1所迷的設備，其中所述用于移動所述容器的裝置繞著穿 過所述容器中心的旋轉軸旋轉所述容器。
3. 根據權利要求2所述的設備，其中所述用于移動所述容器的裝置以在大 約0.1轉/秒到大約10轉/秒的范圍內的速率旋轉所ii^器。
4. 根據權利要求1所述的設備，其中所述用于移動所述容器的裝置在垂直 方向上損:供所i^器的平移。
5. 根據權利要求4所述的設備，其中所述用于移動所述容器的裝置以在大 約0. 01厘米/秒到大約5厘米/秒的范圍內的速率垂直反轉所il^器。
6. 根據權利要求1所述的設備，其中所述用于移動所述容器的裝置同時旋 轉和垂J^轉所^器。
7. 根據權利要求1所述的設備，其中所述用于移動所i^器的裝置是馬 達、開關電子器件或偏心旋轉板設備。
8. 根據權利要求1所述的設備，其中所述用于收集來自所述觀察體積的熒 光的裝置是共焦顯微鏡。
9. 根據權利要求1所述的設備，其中所述光源產生空間上準直的齓發光。
10. 根據權利要求1所迷的設備，其中所述觀察體積位于距所述容器壁大約IOO微米到大約2000微米的距離。
11. 根據權利要求1所述的設備，其中所述觀察體積具有大約1 x 102 jam3 至大約1 x 10、1113之間的體積。
12. 根據權利要求1所述的設備，其中所述用于移動所述容器的裝置使顆 粒一次一個地穿過所述，見^^積。
13. 根據權利要求1所述的設備，進一步包括具有模式識別算法的處理器， 用于接收并分析由所述光電檢測器產生的所述時間曲線。
14. 根據權利要求13所述的設備，其中所述模式識別算法使所述時間曲線 中的特征與預定模式相匹配，其中所述預定模式對應于穿過所ii^見察體 積的顆粒的時間依賴型熒光強度。
15. 根據權利要求14所述的設備，其中所述預定模式通過經驗確定。
16. 根據權利要求13所述的設備，其中當作為時間函數的預定模式和時間 曲線的強度彼iH^目差在大約20%之內時，即為預定模式與所述時間曲線 的特^目匹配。
17. 根據權利要求13所述的設備，其中當預定模式的寬度和顆粒穿過所述 觀察體積的飛行時間相關時，即為預定模式與所述時間曲線的特;^目匹 配。
18. 根據權利要求13所述的設備，其中所述模式識別算法對所述時間曲線 的特征和所述預定模式之間的匹配的數量進行計數。
19. 根據權利要求18所述的設備，其中所述時間曲線的特征和所述預定模 式之間的匹配的數量與所述樣本中所述顆粒的濃度成比例。
20. 根據權利要求13所述的設備，其中所述模式識別算法將所述時間曲線 中的特征與預定才莫式相匹配，其中所述預定模式對應于穿過所述觀察體 積的顆粒的時間,型熒光強度，并且其中與所述時間曲線中的所述特 征匹配的所述預定模式的寬度與所述顆粒的大小成比例。
21. 根據權利要求13所述的設備，其中所，式識別算法產生包括具有不 同總積分強度的匹配特征的直方圖的輸出。
22. 根據權利要求1所述的設備，其中所述顆粒是帶熒光標記的顆粒、固 有熒光顆粒或既是帶熒光標記的顆粒又是固有熒光顆粒。
23. 根據權利要求1所述的設備，其中所述顆粒選自細胞；病毒；細菌； 蛋白質；肽；蛋白質聚集體；寡核苷酸、MA、 DNA蛋白質復合體、RNA、 RNA蛋白質復合體、球體；金屬顆粒；磁顆粒；以及抗體包被的珠狀物。
24. 根據權利要求1所述的設備，其中所述容器為圓柱形試管。
25. 根據權利要求1所述的設備，包括附加光電檢測器，其中所述光電檢 測器選擇性i^測來自所述觀察區域的具有第一波長分布的焚光，并且 所述附加光電檢測器選擇性地檢測具有第二波長分布的光，并且其中所 述第一波長分布不同于所述第二波長分布。
26. —種用于分析樣本中顆粒的設備，所述設備包括 至少部分透明的容器，用于容納包含所述顆粒的所述樣本；光源，用于產生提供給所述樣本的激發光，從而使得至少部分所述顆粒 產生熒光；用于收集熒光的裝置，包括與第一共焦孔和第二共焦孔光通信的光收集 元件，其中所述第一共焦孔具有不同于所述第二共焦孔的^lt截面面積； 第一光電檢測器，用于檢測來自位于所述容器內的第一觀察體積的熒 光，定位所述第一光電檢測器以檢測穿過所述第一共焦孔的熒光，從而 產生所述熒光的第 一時間曲線；第二光電檢測器，用于檢測來自位于所述容器內的第二觀察體積的熒 光，定位所述第二光電檢測器以檢測穿過所述第二共焦孔的熒光，從而 產生所述熒光的第二時間曲線；以及用于移動所述容器的裝置，從而使至少部分所述顆粒傳輸穿過所述第一 觀察體積以及所述第二觀察體積。
27. 根據權利要求26所述的設備，其中所述第一共焦孔具有比所述第二共 焦孔更小的橫截面面積，并且其中所述第一觀測體積位于所述第二;i見測 體積之內。
28. 根據權利要求26所述的設備，其中所述用于收集來自所述觀察體積的 熒光的裝置;l共焦顯孩t鏡。
29. 根據權利要求26所述的設備，進一步包括具有模式識別算法的處理器， 用于接收并分析由所述第 一和第二光電檢測器產生的所述第 一和第二 時間曲線。
30. 根據權利要求29所述的設備，其中通過所述模式識別算法分析所述第 一和第二時間曲線而確定所述顆粒的大小分布。
31. —種用于分析包含顆粒的樣本中的顆粒的方法，所述方法包括下列步 驟在至少部分透明的容器中提供包含顆粒的所述樣本； 將激發光導向至樣本，從而使得所述樣本中的至少部分所述顆粒產生熒 光；收集來自所述樣本中的觀察體積的熒光，并且將來自所述觀察體積的熒 光導向至光電檢測器；移動所述容器，從而使所述樣本中的顆粒穿過所i^見察體積；以及 使用所述光電檢測器測量來自所述觀察體積的作為時間函數的所述熒 光的強度，從而產生來自所述觀奮本積的所述熒光的時間曲線。
32. 根據權利要求31所述的方法，其中所述使用模式識別算法分析所述時 間曲線的步驟確定所述樣本中顆粒的濃度或所述樣本中所述顆粒的大 小分布，或兩者均被確定。
33. 根據權利要求31所述的方法，進一步包括在所述樣本中對所述顆粒進 行熒光標記的步驟。
34. 根據權利要求31所述的方法，進一步包括提供與所述樣本光通信的共 焦顯微鏡的步驟，其中所述共焦顯微鏡用于執行所述將所述M光導向 至所述樣本、收集來自觀察體積的所述熒光以及將來自所述觀察體積的 所述焚光導向至光電檢測器的步驟。
35. 根據權利要求31所述的方法，進一步包括使用模式識別算法分析所述 時間曲線的步驟。
36. 根據權利要求35所述的方法，其中所述使用所述模式識別算法分析所 述時間曲線的步驟包括將所述時間曲線中的特征與預定模式相匹配的 步驟。
37. 根據權利要求36所述的方法，其中所述使用所述模式識別算法分析所 述時間曲線的步驟進一步包括對在所述時間曲線的特征和所述預定模 式之間的匹配的數量進行計數，從而確定所述檢測時間間隔內被檢測的 顆粒的凈數量的步驟。
38. 根據權利要求37所述的方法，其中所述使用所述模式識別算法分析所 述時間曲線的步驟進一步包括將所述檢測時間間隔內祐_檢測的顆i^立的 凈數量除以所述檢測時間間隔內掃描的樣本的總體積的步驟。
39. 根據權利要求38所述的方法，其中所述容器是圓柱形，其中所述平移 所述容器的步驟包括同時旋轉并垂直反轉所述容器，并且其中所述4吏用 所述模式識別算法分析所述時間曲線的步驟進一步包括使用下面的表 達式確定所述樣本內的所述觀察體積的,總長度的步驟 L = rr (d) x (vr) (t);其中d為容器的直徑，Vr為容器的旋轉速度并且t是選定的檢測時間間 隔。
40. 根椐權利要求39所述的方法，其中使用下面的表達式計算所述檢測時 間間隔內掃描的樣本的總體積(V):V = (L) x (截面積)；其中L是所M定的皿的長度，并且截面積是沿與所述、M光的傳播軸平行的軸的觀察體積的橫截面面積。
41. 根據權利要求31所述的方法，其中所述來自所述觀察體積的所述熒光 強;l作為時間的函數被檢測，檢測時間為大約0. 5秒到大約10 ^^中的 范圍。
42. —種用于分析樣本中顆粒的設備，所述設備包括 至少部分透明的容器，用于容納包含所述顆粒的所述樣本；光源，用于產生提供給所述樣本的激發光，從而使得至少部分所述顆粒產生熒光；用于收集來自位于所a器內的觀察體積的熒光的裝置；用于移動所述容器的裝置，從而使至少部分所述顆粒傳輸穿過所述觀察體積；與所述用于收集熒光的裝置光通信的光電檢測器，用于接收來自所述，見 察體積的至少部分所述熒光并測量其強度，從而產生所述熒光的時間曲 線；以及位于所述樣本和所述光電檢測器之間的多狹縫共焦孔，以便使熒光穿過 所述多狹縫共焦孔，并且被所述光電檢測器接收。
43. 根據權利要求42所述的設備，其中所述用于收集熒光的裝置以及所述 多狹縫共焦孔是共焦顯微鏡的組件。
44. 根據權利要求42所述的設備,其中所述多狹縫共焦孔是雙狹縫共焦孑L。
45. 根據權利要求42所述的設備，進一步包括具有模式識別算法的處理器， 用于接收并分析由所述光電檢測器產生的所述時間曲線。
46. 根據權利要求45所述的設備，其中所述模式識別算法確定所述顆粒在 所述觀察體積中的位置。
47. —種用于分析樣本中顆粒的積分顆粒測量系統，所述設備包括 至少部分透明的容器，用于容納包含所述顆粒的所述樣本；光源，用于產生提供給所述樣本的激發光，從而使得至少部分所述顆粒產生熒光；用于收集來自位于所#器內的觀奮本積的熒光的裝置；用于移動所ii^器的裝置，從而使至少部分所述顆粒傳輸穿過所述觀察體積；與所述用于收集熒光的裝置光通信的光電檢測器，用于接收來自所述觀 察體積的至少部分所述熒光并測量其強度，從而產生所述熒光的時間曲 線；以及用于將顆粒引入樣本中的裝置，所述裝置與所述至少部分透明的容器可 操作地連接，以便將顆粒提供給所述樣本。
48. 根據權利要求47所述的設備，其中所述用于將顆粒引入的裝置是能夠 向所述樣^:供包含顆粒的液體或包含顆粒的氣體的插入物。
49. 根據權利要求47所述的設備，其中所述用于將顆粒引入到所述樣本的 裝置是能夠連續或滴狀地向所述樣4*供包含顆粒的液體的插入物。
50. 根據權利要求47所述的設備，其中所述用于將顆粒引入到所述樣本的 裝置是能夠使包含顆粒的氣體起泡穿過所述樣本的試管。
全文摘要
本發明提供了用于檢測、識別、分類并表征流體樣本中顆粒的方法和設備。提供了具有可旋轉和/或可平移的樣本容器的光學分析器，用于測量以極低濃度存在的熒光顆粒的濃度，并且用于基于大小、形狀、擴散常數和/或成分表征熒光顆粒。提供了使用模式識別數據分析技術和多信道檢測的掃描光學分析器。
文檔編號G01N21/64GK101147055SQ200680009509
公開日2008年3月19日 申請日期2006年1月27日 優先權日2005年1月31日
發明者A·塔哈里, E·格拉頓, G·莫托爾西 申請人:伊利諾伊大學評議會