專利名稱：一種檢測農副產品中黃曲霉毒素b的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物檢測領域，具體涉及一種檢測農副產品中黃曲霉毒素B1的方法。
背景技術：
黃曲霉毒素B1是黃曲霉、寄生曲霉、特曲霉等的代謝產物，是I類致癌物，是一種毒性極強的真菌毒素。由于其對人體的危害，各國都對農副產品中黃曲霉毒素B1的最高允許濃度作出了嚴格的規定，建立黃曲霉毒素B1的高靈敏分析手段對農副產品監督與檢測具有重大意義。現在使用的黃曲霉毒素B1檢測方法有薄層色譜法、高效液相色譜法、免疫親和柱熒光分光光度法、酶聯免疫吸附法等。這些檢測方法大都步驟繁瑣，需特殊儀器，耗時長，不適宜現場快速篩查。因此，需要一種分析速度快、靈敏度高，可現場快速篩查的檢測方法。
發明內容
本發明要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種檢測農副產品中黃曲霉毒素B1的方法。本發明用于對農副產品中黃曲霉毒素B1的檢測，具有分析成本低，分析速度快，靈敏度高，達到我國農副產品中黃曲霉毒素B1的限量標準。分析儀器便于攜帶，可實現現場監督與檢測。
為了達到上述目的，本發明提供的檢測農副產品中黃曲霉毒素B1的方法包括以下步驟1、在石英晶體微天平金電極表面制備黃曲霉毒素B1壓電免疫傳感器；2、制備納米金標記的羊抗鼠IgG抗體(二抗)；3、作標準工作曲線取不同濃度的黃曲霉毒素B1標準溶液，加入常規濃度量的黃曲霉毒素B1單克隆抗體，再加入牛血清白蛋白，混勻，取常規量滴到已制備好的黃曲霉毒素B1壓電免疫傳感器，37℃環境中反應30min；接著加入納米金標記抗體(二抗)，實時檢測壓電石英晶體微天平的頻率變化；改變標準濃度的黃曲霉毒素B1，按上述步驟測定一系列黃曲霉毒素B1的標準溶液，用壓電石英晶體微天平頻率變化值與黃曲霉毒素B1濃度繪制標準工作曲線；4、樣品檢測取處理好的樣品溶液，加入常規濃度量的黃曲霉毒素B1單克隆抗體，再加入牛血清白蛋白，混勻，取常規量滴到已制備好的黃曲霉毒素B1壓電免疫傳感器，在37℃環境中反應30min；接著加入納米金標記抗體(二抗)，實時檢測壓電石英晶體微天平的頻率變化；實時檢測壓電石英晶體微天平的頻率變化，記錄頻率變化值；將頻率變化值與第3步繪制的標準工作曲線對照獲得樣品中黃曲霉毒素B1的數值。
本發明方法步驟1中所述黃曲霉毒素B1壓電免疫傳感器可以由以下步驟制備1)石英晶體微天平金電極表面的半胱氨自組裝將金電極浸入2.0mmol/L的半胱氨水溶液中，靜置過夜，取出金電極，金電極表面用純水清洗三次，即在金電極表面獲得一層致密均勻的半胱氨自組裝單層膜；2)石英晶體微天平表面抗體固定化將自組裝了半胱氨自組裝單層膜的晶振浸入5.0％(V/V)戊二醛溶液中，靜置1～1.5小時，取出金電極，金電極表面用純水清洗三次，再將含10.0μg/mL黃曲霉毒素B1的牛血清白蛋白交聯物溶液20μL滴至電極表面，靜置1～1.5小時，電極表面用純水清洗三次，取質量分數為1％的牛血清白蛋白溶液50μL滴至電極表面，靜置封閉0.5小時，電極表面用純水清洗三次，即獲得黃曲霉毒素B1壓電免疫傳感器。
本發明方法步驟2中所述納米金標記的羊抗鼠IgG抗體的制備可按以下方法進行取納米金膠體250μl，用0.1mol/L碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液調節pH為9.0；取羊抗鼠IgG抗體5μl，逐滴加入到金溶膠中，強烈攪拌10min～20min，然后于室溫孵育1～1.5h，初步制得納米金標記抗體；加入質量分數為5.0％的牛血清白蛋白(BSA)溶液于納米金標記抗體溶液中，使BSA最終質量分數為1.0％，封閉納米金標記抗體；將納米標記抗體置入1.5mL的離心管中，以15000r/min的速度冷凍離心10min，控制離心溫度為4℃；棄去上層清液，用含質量分數為0.1％BSA的磷酸緩沖溶液(PBS，pH＝7.4)洗滌暗紅色沉淀物2次；將該沉淀物重新懸浮于質量分數為0.1％的BSA-PBS緩沖液中，制得納米金標記抗體。
本發明的檢測原理本發明檢測方法是基于利用壓電晶體對質量變化的敏感性，結合生物識別系統(抗原抗體特異性結合)而形成的一種自動化分析檢測系統，來檢測農副產品中黃曲霉毒素B1濃度的。本發明中，黃曲霉毒素B1全抗原修飾壓電石英晶體微天平傳感界面，形成黃曲霉毒素B1壓電免疫傳感器。抗體與樣品中黃曲霉毒素B1及固定化的黃曲霉毒素B1全抗原的競爭作用，同時，利用納米金標記的二抗與一抗的免疫識別(二抗是在一抗的基礎上制備的，對一抗有特異性識別作用)，實現大分子抗體的表面結合，進一步放大質量響應，質量放大可達數百萬倍(壓電晶體微天平本身就是對質量敏感的傳感裝置，由于納米金的質量要遠遠大于抗體或抗原的質量，取不同濃度的黃曲霉毒素B1標準溶液，加入常規濃度量的黃曲霉毒素B1單克隆抗體，再加入牛血清白蛋白，混勻，取常規量滴到已制備好的黃曲霉毒素B1壓電免疫傳感器，37℃環境中反應30min，顯然，黃曲霉毒素B1已經和黃曲霉毒素B1單克隆抗體先反應了，如果樣品中黃曲霉毒素B1多的話，由于大部分黃曲霉毒素B1抗體已經和樣品中的黃曲霉毒素B1反應了，那么連接到晶振表面的黃曲霉毒素B1抗體就少，進而納米金標記的二抗上去的也就少。因此，本實驗實際上其放大倍數與樣品中的黃曲霉毒素B1的含量是成反比的，也就是說，樣品中的黃曲霉毒素B1越少，那么連接到晶振表面的抗體反而越多，進而納米金標記的二抗上去的也越多，質量放大越明顯。正因為如此才會有高靈敏度。)，在30min內可以完成反應，記錄頻率變化值。
本發明主要解決了黃曲霉毒素B1快速檢測的系列問題由于黃曲霉毒素B1分子量小，壓電質量響應小，本發明利用分析樣中抗原與固定抗原對游離抗體的競爭作用，實現大分子抗體的表面結合，提高質量響應。同時，利用納米金標記的二抗與一抗的免疫識別，進一步放大質量響應，實現黃曲霉毒素B1的高靈敏定量測定。
本發明采用黃曲霉毒素B1-牛血清白蛋白(BSA)交聯物(即全抗原)進行半抗原的固定，提高表面負載量與固定效率，簡化傳感器制作程序。通過實驗條件的優化，本傳感器對黃曲霉毒素B1的頻率響應十分明顯，但對其他真菌毒素幾乎沒有頻率響應。表面修飾黃曲霉毒素B1與牛血清白蛋白封閉的免疫傳感表面起了很好的抑制非特異性吸附的效果。傳感器可用6.0mol/L尿素浸泡30min～40min再生。再生后傳感器可反復使用而無顯著靈敏度損失。
制備的黃曲霉毒素B1壓電免疫傳感器檢測步驟簡單，檢測時間不超過1小時，傳感器界面再生簡便，可以多次反復使用。檢測靈敏度高，下限可達0.50ng/mL，分析精度相對誤差在8.0％以內。檢測所需的石英晶體微天平儀器便攜且價格低廉。
本發明可利用普通的免疫分析試劑，無需特殊標記，獲得質量響應的大大提高，顯著改善了傳感器的靈敏度。分析成本低，分析速度快，靈敏度高，可達到我國農副產品中黃曲霉毒素B1的限量標準。儀器可便攜，可實現現場監督與檢測。
具體實施例方式
實施例1、制備黃曲霉毒素B1壓電免疫傳感器1)、石英晶體微天平金電極表面的半胱氨自組裝將金電極浸入2.0mmol/L的半胱氨水溶液中，靜置過夜，取出金電極，金電極表面用純水清洗三次，即在金電極表面獲得一層致密均勻的半胱氨自組裝單層膜；2)、石英晶體微天平表面抗體固定化將自組裝了半胱氨自組裝單層膜的晶振浸入5.0％(V/V)戊二醛溶液中，靜置1～1.5小時，取出金電極，金電極表面用純水清洗三次，再將含10.0μg/mL黃曲霉毒素B1的牛血清白蛋白交聯物溶液20μL滴至電極表面，靜置1～1.5小時，電極表面用純水清洗三次，取質量分數為1％的牛血清白蛋白溶液50μL滴至電極表面，靜置封閉0.5小時，電極表面用純水清洗三次，即獲得黃曲霉毒素B1壓電免疫傳感器。
2、制備納米金標記的羊抗鼠IgG抗體取納米金膠體250μl，用0.1mol/L碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液調節pH為9.0；取羊抗鼠IgG抗體5μl，逐滴加入到金溶膠中，強烈攪拌10min～20min，然后于室溫孵育1～1.5小時，初步制得納米金標記抗體；加入質量分數為5.0％的牛血清白蛋白(BSA)溶液于納米金標記抗體溶液中，使BSA最終質量分數為1.0％，封閉納米金標記抗體；將納米標記抗體置入1.5mL的離心管中，以15000r/min的速度冷凍離心10min，控制離心溫度為4℃；棄去上層清液，用含質量分數為0.1％BSA的磷酸緩沖溶液(PBS，pH＝7.4)洗滌暗紅色沉淀物2次；將該沉淀物重新懸浮于質量分數為0.1％的BSA-PBS緩沖液中，制得的實驗所需得納米金標記抗體，該納米金標記抗體可于4℃冰箱中保存6個月以上。
3、測定黃曲霉毒素B1濃度標準工作曲線的繪制將不同濃度的黃曲霉毒素B1分別混合含100.0ng/mL黃曲霉毒素B1單克隆抗體，再加入質量分數為1.0％牛血清白蛋白，混勻，分別取20μL滴至制備好的黃曲霉毒素B1壓電免疫傳感器表面，37℃環境中反應30min；用純水清洗傳感器表面三四次后，加入10.0nmol/L納米金標記的羊抗鼠IgG抗體，實時檢測壓電石英晶體微天平的頻率變化，觀察到最初階段頻率下降非常迅速，在30min內可以完成反應，記錄頻率變化值；按上述步驟測定一系列黃曲霉毒素B1的標準溶液如0.70ng/mL，5.0ng/mL，10.0ng/mL，20.0ng/mL，50.0ng/mL，100.0ng/mL，130.0ng/mL，用壓電石英晶體微天平頻率變化值與黃曲霉毒素B1濃度繪制標準工作曲線，該工作曲線在0.70-130.0ng/mL黃曲霉毒素B1濃度范圍內成線性關系，檢測下限為0.50ng/mL。
4、待測樣品中黃曲霉毒素B1的檢測準確稱取待測樣品10.0～250.0克，加入0.2mol/L磷酸鹽緩沖溶液150～250mL，均質成勻漿；過濾取上層清液10～30mL，用甲醇∶水(60∶40，V/V)溶液10～30mL靜置提取10～20min，用20～50mL水稀釋；取處理好的樣品50～200μL，混合含100.0～300.0ng/mL黃曲霉毒素B1單克隆抗體，再加入質量分數為1.0％牛血清白蛋白，混勻，取10～20μL滴至制備好的黃曲霉毒素B1壓電免疫傳感器表面，37℃環境中反應30～50min；用純水清洗傳感器表面三四次后，加入10.0～20.0nmol/L納米金標記的羊抗鼠IgG抗體，實時檢測壓電石英晶體微天平的頻率變化；觀察頻率變化情況，在30～40min可以完成反應；記錄頻率變化值；將頻率變化值與第3步繪制的標準工作曲線對照獲得樣品中黃曲霉毒素B1的數值。
檢測實例1對牛奶中的黃曲霉毒素B1回收率的檢測取測定過牛奶(未檢出的黃曲霉毒素B1)20mL，加入2.0ng/mL的黃曲霉毒素B1。用甲醇∶水(60∶40，V/V)溶液20mL靜置提取10min，用20mL水稀釋。取上述樣品100μL，加入100.0ng/mL黃曲霉毒素B1單克隆抗體，質量分數為1.0％牛血清白蛋白，混勻。取其中20μL滴至制備好的黃曲霉毒素B1壓電免疫傳感器表面。37℃環境中反應30min。用純水清洗傳感器表面三次后，加入10.0nmol/L納米金標記的羊抗鼠IgG抗體，實時檢測壓電石英晶體微天平的頻率變化。觀察到最初階段頻率下降非常迅速，在30分鐘內可以完成反應。記錄頻率變化值。根據工作曲線計算得到黃曲霉毒素B1濃度。五次測定黃曲霉毒素B1濃度得到其結果平均值為1.91±0.15ng/mL。與五次酶聯免疫吸附法結果1.84±0.13ng/mL吻合。結果表明，本傳感器的回收率85.5％～96.5％，達可以對牛奶中黃曲霉毒素B1進行快速檢測。
檢測實例2對發霉花生樣品中的黃曲霉毒素B1的檢測取發霉花生樣品250.0g，加入0.2mol/L磷酸鹽緩沖溶液200mL，均質成勻漿。過濾取上層清液20mL，用甲醇∶水(60∶40，V/V)溶液20mL靜置提取10min，用20mL水稀釋。取上述樣品100μL，加入100.0ng/mL黃曲霉毒素B1單克隆抗體，質量分數為1.0％牛血清白蛋白，混勻。取其中20μL滴至制備好的黃曲霉毒素B1壓電免疫傳感器表面。37℃環境中反應30min。用純水清洗傳感器表面三次后，加入10.0nmol/L納米金標記的羊抗鼠IgG抗體，實時檢測壓電石英晶體微天平的頻率變化。觀察到最初階段頻率下降非常迅速，在30分鐘內可以完成反應。記錄頻率變化值。五次測定并根據工作曲線計算得到對應的試液中黃曲霉毒素B1濃度平均值為63.3±2.0ng/mL。與五次酶聯免疫吸附法結果61.8±3.2ng/mL吻合。結果表明，本傳感器可以對花生中黃曲霉毒素B1進行快速檢測。
檢測實例3對發霉大米樣品中的黃曲霉毒素B1的檢測取發霉大米樣品200.0g，加入0.2mol/L磷酸鹽緩沖溶液200mL，均質成勻漿。過濾取上層清液20mL，用甲醇∶水(60∶40，V/V)溶液20mL靜置提取10min，用20mL水稀釋。取上述樣品100μL，加入100.0ng/mL黃曲霉毒素B1單克隆抗體，質量分數為1.0％牛血清白蛋白，混勻。取其中20μL滴至制備好的黃曲霉毒素B1壓電免疫傳感器表面。37℃環境中反應30min。用純水清洗傳感器表面三次后，加入10.0nmol/L納米金標記的羊抗鼠IgG抗體，實時檢測壓電石英晶體微天平的頻率變化。觀察到最初階段頻率下降非常迅速，在30分鐘內可以完成反應。記錄頻率變化值。五次測定并根據工作曲線計算得到對應的試液中黃曲霉毒素B1濃度平均值為30.1±1.5ng/mL。與五次酶聯免疫吸附法結果28.4±2.5ng/mL吻合。結果表明，本傳感器可以對大米中黃曲霉毒素B1進行快速檢測。
權利要求
1.一種檢測農副產品中黃曲霉毒素B1的方法，其特征在于包括以下步驟1)在石英晶體微天平金電極表面制備黃曲霉毒素B1壓電免疫傳感器；2)制備納米金標記的羊抗鼠IgG抗體；3)作標準工作曲線取不同濃度的黃曲霉毒素B1標準溶液，加入常規濃度量的黃曲霉毒素B1單克隆抗體，再加入牛血清白蛋白，混勻，取常規量滴到已制備好的黃曲霉毒素B1壓電免疫傳感器，37℃環境中反應30min；接著加入納米金標記抗體(二抗)，實時檢測壓電石英晶體微天平的頻率變化；改變標準濃度的黃曲霉毒素B1，按上述步驟測定一系列黃曲霉毒素B1的標準溶液，用壓電石英晶體微天平頻率變化值與黃曲霉毒素B1濃度繪制標準工作曲線；4)樣品檢測取處理好的樣品溶液，加入常規濃度量的黃曲霉毒素B1單克隆抗體，再加入牛血清白蛋白，混勻，取常規量滴到已制備好的黃曲霉毒素B1壓電免疫傳感器，在37℃環境中反應30min；接著加入納米金標記抗體(二抗)，實時檢測壓電石英晶體微天平的頻率變化；實時檢測壓電石英晶體微天平的頻率變化，記錄頻率變化值；將頻率變化值與第3)步繪制的標準工作曲線對照獲得樣品中黃曲霉毒素B1的數值。
2.根據權利要求1所述的檢測農副產品中黃曲霉毒素B1的方法，其特征在于步驟1)中所述黃曲霉毒素B1壓電免疫傳感器由以下步驟制備(1)石英晶體微天平金電極表面的半胱氨自組裝將金電極浸入2.0mmol/L的半胱氨水溶液中，靜置過夜，取出金電極，金電極表面用純水清洗三次，即在金電極表面獲得一層致密均勻的半胱氨自組裝單層膜；(2)石英晶體微天平表面抗體固定化將自組裝了半胱氨自組裝單層膜的晶振浸入5.0％(V/V)戊二醛溶液中，靜置1～1.5小時，取出金電極，金電極表面用純水清洗三次，再將含10.0μg/mL黃曲霉毒素B1的牛血清白蛋白交聯物溶液20μL滴至電極表面，靜置1～1.5小時，電極表面用純水清洗三次，取質量分數為1％的牛血清白蛋白溶液50μL滴至電極表面，靜置封閉1～1.5小時，電極表面用純水清洗三次，即獲得黃曲霉毒素B1壓電免疫傳感器。
3.根據權利要求1所述的檢測農副產品中黃曲霉毒素B1的方法，其特征在于步驟2)中所述納米金標記的羊抗鼠IgG抗體的制備按以下方法進行取納米金膠體250μl，用0.1mol/L碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液調節pH為9.0；取羊抗鼠IgG抗體5μl，逐滴加入到金溶膠中，強烈攪拌10min～20min，然后于室溫孵育1～1.5h，初步制得納米金標記抗體；加入質量分數為5.0％的牛血清白蛋白(BSA)溶液于納米金標記抗體溶液中，使BSA最終質量分數為1.0％，封閉納米金標記抗體；將納米標記抗體置入1.5mL的離心管中，以15000r/min的速度冷凍離心10min，控制離心溫度為4℃；棄去上層清液，用含質量分數為0.1％BSA的磷酸緩沖溶液(PBS，pH＝7.4)洗滌暗紅色沉淀物2次；將該沉淀物重新懸浮于質量分數為0.1％的BSA-PBS緩沖液中，制得納米金標記抗體。
全文摘要
本發明公開了一種檢測農副產品中黃曲霉毒素B
文檔編號G01N33/569GK101059517SQ200710035069
公開日2007年10月24日 申請日期2007年6月6日 優先權日2007年6月6日
發明者彭新凱, 蔣健暉, 胡朝暉, 陳利國 申請人:長沙市產商品質量監督檢驗所