一種利用鐮刀菌及其產生的酶去除黃曲霉毒素B1的方法與流程

本發明屬于微生物技術領域，涉及一種利用鐮刀菌及其產生的酶去除黃曲霉毒素B1的方法。

背景技術：

黃曲霉毒素具有強毒性、強致畸性和強致突變性，是危害最大的真菌毒素之一，不僅對糧食和飼料造成污染，而且嚴重危害人和動物的健康。在黃曲霉毒素中以黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，簡稱：AFB1)最為常見，危害性也最強，已經給相關行業帶來巨大的經濟損失。國家質檢總局規定食品中AFB1為必檢項目，中國食品衛生標準規定了幾種主要易受污染食物中的最大允許量標準：玉米、花生、花生油≤20μg/kg；食用油為≤10μg/kg；其他糧食、豆類、發酵食品為≤5μg/kg。

黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉等多種真菌產生的次級代謝產物，其中包括多種衍生物，目前已分離鑒定出12種，包括B1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、Q、H1、GM、B2a和毒醇，其中AFB1的致癌、致畸和致突變毒性最強。黃曲霉毒素的基本結構為二氫呋喃環和香豆素，B1是二氫呋喃氧雜萘鄰酮的衍生物，含有一個雙呋喃環和一個氧雜萘鄰酮(香豆素)，分別與毒性和致癌性有關。黃曲霉毒素不僅抑制蛋白質的合成，而且干擾信息RNA和DNA的合成，導致動物全身性損害。黃曲霉毒素主要攻擊靶位為肝臟，可導致肝炎、肝硬化、肝壞死和肝癌。

黃曲霉毒素可溶于多種極性有機溶劑如氯仿、甲醇和乙醇中，但難溶于水，在光、熱和酸性條件下穩定，當溫度達到280℃以上才發生裂解。由于黃曲霉毒素結構穩定，傳統的物理化學方法很難將其高效去除。與物化方法相比，生物降解具有成本低、條件相對溫和不會對產品品質造成破壞等優點，因此是一種高效去除黃曲霉毒素的方法。AFB1具有環狀結構，屬于難生物降解的化合物，目前對其進行生物降解的研究并不多見。伊朗學者Mohsen Farzaneh等從開心果中篩選出了一株枯草芽孢桿菌，在35-40℃條件下24h內對開心果中AFB1的降解去除率高達95％，其粗酶的降解效率為78.4％。中國學者曹洪等從假蜜環菌多酶復合體中成功分離純化出一種新的黃曲霉毒素降解酶，能夠催化斷裂二氫呋喃環。

技術實現要素：

本發明的目的之一是提供一種能夠高效生物降解AFB1的真菌菌株，可以快速高效生物降解去除生物質材料中的AFB1。

本發明的目的之二是提供一種上述菌株的培養方法，利用此方法對上述菌株進行發酵培養，所獲得的培養物具有較高的光密度和細胞菌落形成單位(CFU)。

本發明的目的之三是提供一種利用上述菌株有效去除黃曲霉毒素B1的方法。

為此，本發明第一方面提供了一種鐮刀菌菌株，其為腐皮鐮刀菌R30株(Fusarium solani strain R30)，保藏編號為：CGMCC NO.12250，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱：CGMCC；地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所)，保藏日期：2016年5月16日。所述菌株的特征在于能夠高效生物降解黃曲霉毒素B1(AFB1)。

本發明第二方面提供了一種用于去除生物質材料中的黃曲霉毒素B1的菌劑，其為本發明第一方面所述菌株的發酵培養物分離后獲得的濕菌體，所述發酵培養物的光密度(OD_680nm)≥40；所述發酵培養物的細胞菌落形成單位(CFU)≥20億/mL。

本發明第三方面提供了一種用于去除生物質材料中的黃曲霉毒素B1的菌劑的制備方法，其包括：

步驟B，將發酵菌種接種至發酵培養基中進行發酵培養，獲得發酵培養物；

步驟C，對發酵培養物濃縮分離后再進行清洗分離處理，獲得鐮刀菌濕菌體；

其中，所述發酵菌種由相應的菌株經過種子培養獲得；

發酵菌種的相應的菌株為與權利要求1或2所述的鐮刀菌菌株的18S rDNA的同源性至少為90％的菌株；優選發酵菌種的相應的菌株為與權利要求1或2所述的鐮刀菌菌株的18S rDNA的同源性至少為95％的菌株；進一步優選發酵菌種的相應的菌株為如權利要求1或2所述的鐮刀菌菌株。

根據本發明方法，所述發酵培養基以1L水計，包括在1L水中的以下組分：

在本發明的一些實施例中，所述發酵培養基的pH值為6.5-8.0；優選所述發酵培養基的pH值為6.5-7.2。

本發明第四方面提供了一種鐮刀菌酶制劑，其由本發明第一方面所述的鐮刀菌菌株經發酵培養后產生，所述酶制劑能夠降解黃曲霉毒素B1。

本發明第五方面提供了一種本發明第四方面所述的酶制劑的制備方法，其包括將本發明第二方面所述的菌劑或本發明第三方面所述的方法制得的菌劑進行重懸、細胞破碎處理和離心分離處理獲得酶制劑。

本發明第六方面提供了一種去除生物質材料中的黃曲霉毒素B1的方法，其包括：將本發明第二方面所述的菌劑或本發明第三方面所述的方法制得的菌劑或本發明第四方面所述的酶制劑或本發明第五方面所述的方法制得的酶制劑與含有黃曲霉毒素B1的生物質材料混合后生物降解去除生物質材料中的黃曲霉毒素B1；其中所述生物質材料包括飼料和糧食。

根據本發明方法，所述生物材料中黃曲霉毒素B1的含量為20μg/kg-20mg/kg。

本發明中，所述生物材料中水的質量含量為1％-20％，優選生物材料中水的質量含量為16.7％-20％。

在本發明的一些實施例中，所述生物降解的溫度為20-35℃，優選所述生物降解的溫度為25-30℃。

在本發明的另一些實施例中，基于生物質材料總重量計，所述菌劑的用量為0.1wt％-1wt％，優選基于生物質材料總重量計，所述菌劑的用量為0.2wt％-0.5wt％。

在本發明的又一些實施例中，基于生物質材料總重量計，所述酶制劑的用量為0.5v％-5v％，優選基于生物質材料總重量計，所述酶制劑的用量為0.5v％-2v％。

本發明中，優選所述酶制劑的蛋白濃度為400-500mg/L。

附圖說明

下面將結合附圖來說明本發明。

圖1顯示了本發明的腐皮鐮刀菌R30基于18S rDNA的分子進化樹。

圖2顯示了腐皮鐮刀菌R30優化培養生長曲線。

圖3顯示了腐皮鐮刀菌R30生物降解玉米中AFB1的動力學過程。

圖4顯示了腐皮鐮刀菌R30粗酶生物降解玉米中AFB1的動力學過程。

菌種保藏

腐皮鐮刀菌(Fusarium solani)，由石家莊北科盛安生物科技有限責任公司分離、鑒定，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱：CGMCC；地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所)進行保藏，保藏日期：2016年5月16日，保藏編號：CGMCC NO.12250。本發明中該菌株被命名為腐皮鐮刀菌R30株(Fusarium solani strain R30)。

具體實施方式

為使本發明容易理解，下面將詳細說明本發明。

為尋求安全高效去除黃曲霉毒素B1的新途徑，本發明人經過不懈的研究探索，終于從長期遭受黃曲霉毒素污染的玉米中成功篩選出了一株具備生物降解AFB1能力的微生物菌種，經分離鑒定為腐皮鐮刀菌R30(Fusarium solani strain R30)，檢測結果表明，該菌株對AFB1具有較高的生物降解能力；進一步研究發現，細胞破碎后獲得的粗酶具備更高的生物降解AFB1活性，這些發現為進一步高效去除糧食和飼料中AFB1的應用奠定了良好基礎。本發明正是基于上述發現作出的。

因此，本發明第一方面所涉及的鐮刀菌菌株能夠高效、快速地生物降解黃曲霉毒素B1，其采用以下篩選培養基進行篩選和培養獲得，該培養基的組成如下(1000L去離子水中)：

本發明篩選用于生物降解AFB1的鐮刀菌菌株的方法包括以下步驟：

(1)按照上述培養基組成配制培養基，并采用氫氧化鈉和鹽酸溶液調整上述培養基的初始pH至7.0。在50ml三角瓶中加入0.5ml的200mg/L的AFB1乙醇標準原液，采用吹風機吹干乙醇后，加入5.0ml無機培養基配制成以AFB1為唯一有機碳源的篩選培養基。經高溫(121℃)高壓(0.15MPa)下滅菌20min，然后在潔凈工作臺內紫外線照射滅菌20min后使用。在液體培養基中加入1.5％(重量/體積)的瓊脂，經過高溫高壓滅菌溶解后倒入到培養皿中冷卻，可以制備出對應的固體培養基平板。

(2)稱取10g污染了AFB1的玉米粉樣品加入到100ml經滅菌的生理鹽水中，充分震蕩30min后靜置2h。在超凈工作臺內取上清液100μL接種到篩選培養基中，在溫度30℃、搖床轉速200r/min下搖床培養3d后，取樣100μL再重新接種于篩選培養基中培養。重復培養3次后，采用滅菌后的生理食鹽水將培養物分別稀釋到10^-3、10^-4和10^-5后，分別取100μL稀釋液在對應的固體篩選培養基上均勻涂板，然后置于30℃下培養。3d后可以在固體培養基表面觀察到長出的單克隆菌落，用接種針挑取單克隆菌落后重新接種到液體篩選培養基中培養3d，測定培養物中AFB1的濃度變化，經過多次重復，發明人成功篩選出了一株能夠生物降解AFB1的真菌。

發明人經觀察發現該菌株的單克隆菌落特征為白色、蓬松，邊緣不整齊；通過顯微鏡鏡檢(放大1000倍)發現，該菌株的細胞個體形態為長桿狀，細胞長10微米左右，寬2微米左右。經提取基因組DNA，通過PCR擴增和基于18s rDNA測序的分子鑒定，該菌株的分類地位為子囊菌門、糞殼菌綱、肉座菌目、叢赤殼科、鐮刀菌屬(Fusarium)，基于上述，該菌株被鑒定并命名為腐皮鐮刀菌R30株(Fusarium solani strain R30)。該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏(簡稱：CGMCC)進行保藏，保藏編號：CGMCC NO.12250。

本發明第二方面所涉及的用于去除生物質材料中的黃曲霉毒素B1的菌劑為本發明第一方面所述的腐皮鐮刀菌R30菌株的發酵培養物經離心分離處理后獲得的濕菌體，所述發酵培養物的光密度(OD_680nm)≥40；所述發酵培養物的細胞菌落形成單位≥20億CFU/ml。

本發明第三方面所涉及的用于去除生物質材料中的黃曲霉毒素B1的菌劑的制備方法，其包括：

步驟B，將發酵菌種接種至發酵培養基中進行發酵培養，獲得發酵培養物；

步驟C，對發酵培養物濃縮分離后再進行清洗分離處理，獲得鐮刀菌濕菌體(即用于去除生物質材料中的黃曲霉毒素B1的菌劑)；

其中，所述發酵菌種由相應的菌株經過種子培養獲得。

正如本領域技術人員所知，目前，國際上常使用18S Ribosomal RNA(18S rRNA)來進行細菌的分子鑒定，因此在相似性的比較上可以用18S rRNA來進行比對而得到其同源性。所以本發明所使用的發酵菌株并不限定于本發明所使用的野外分離株，18s rRNA基因是細菌染色體上編碼rRNA相對應的DNA序列，存在于所有細菌的染色體基因組中。圖1顯示了本發明的腐皮鐮刀菌R30株基于18S rDNA的分子進化樹。

因此，本發明中，發酵菌種的相應的菌株為與本發明第一方面所述的鐮刀菌菌株(即腐皮鐮刀菌R30株)的18S rDNA的同源性至少為90％的菌株；優選發酵菌種的相應的菌株為與本發明第一方面所述的鐮刀菌菌株(即腐皮鐮刀菌R30株)的18S rDNA的同源性至少為95％的菌株；進一步優選發酵菌種的相應的菌株為如本發明第一方面所述的鐮刀菌菌株(即腐皮鐮刀菌R30株)。即在不改變腐皮鐮刀菌R30株的18S rDNA的前提下，本領域技術人員可以通過簡單的篩選或誘變本發明的腐皮鐮刀菌R30株，獲得與本發明腐皮鐮刀菌R30株18S rDNA高度同源的菌株，并獲得相應地具有相同或相似的生物降解黃曲霉毒素B1的功能的菌株。

上述步驟C中，對發酵培養物濃縮分離包括對發酵培養物進行離心分離處理，倒去上清液獲得鐮刀菌粗濕菌體。

上述步驟C中，所述清洗分離處理包括用磷酸鹽緩沖液(PBS，50mM，pH7.0)將發酵培養物經離心分離處理獲得的沉淀物(即鐮刀菌粗濕菌體)重懸清洗后，再進行離心分離處理獲得鐮刀菌濕菌體。

在上述步驟C中，一般對發酵培養物經離心分離處理獲得的沉淀物(即鐮刀菌粗濕菌體)進行至少1次清洗分離處理，優選對發酵培養物經離心分離處理獲得的沉淀物(即鐮刀菌粗濕菌體)進行至少2次清洗分離處理，進一步優選對發酵培養物經離心分離處理獲得的沉淀物(即鐮刀菌粗濕菌體)進行3次清洗分離處理。

本發明對上述步驟C中的離心分離的條件沒有特別的限制，在本發明的一些實施例中，例如，可以在8000r/min條件下對帶分離物離心處理10min。

根據本發明方法，所述發酵培養為菌種游離的搖床發酵培養，發酵菌種以種子液的形式接種到發酵培養基。所述種子液的接種量為0.1％-1％(v/v)；優選所述種子液的接種量為0.2％-0.5％(v/v)；進一步優選所述種子液的接種量為0.2％(v/v)。

在本發明的一些實施例中，在所述種子液中，菌種的菌落形成單位(CFU)為(10-30)×10⁸/mL。

根據本發明的一些實施方式，在上述制備方法中，所述發酵培養基以1L水計，包括在1L水中的以下組分：

為獲得較高的腐皮鐮刀菌R30株濕菌體的產率，本發明人對發酵培養基進行了優化研究，結果表明發酵培養基按照以下組成配制有利于發酵培養，所述發酵培養基以1L水計，包括在1L水中的以下組分：

在本發明的一些實施例中，采用40％(wt/v)的氫氧化鈉溶液和36％(v/v)鹽酸溶液調整發酵培養基的初始pH值，所述發酵培養基的pH值為6.5-8.0；優選所述發酵培養基的pH值為6.5-7.2；進一步優選所述發酵培養基的pH值為7.2。

根據本發明的一些實施方式，本發明所涉及的用于去除生物質材料中的黃曲霉毒素B1的菌劑的制備方法還包括在步驟B之前種子培養的步驟A：挑取本發明所提供的腐皮鐮刀菌R30株單克隆菌落接種到100ml發酵液體培養基中，在溫度30℃、轉速200r/min下搖床培養3d后，制得發酵菌種(種子液)。

在本發明的一些具體實施例中，制備用于去除生物質材料中的黃曲霉毒素B1的菌劑，包括以下步驟：

(1)制備發酵培養基，用500ml三角瓶裝入配制好的液體發酵培養基100ml，瓶口用通空氣膜封口后在高溫(121℃)高壓(0.15MPa)下滅菌20min，然后在潔凈工作臺內紫外線照射滅菌20min后使用。

(2)種子培養，挑取本發明所提供的腐皮鐮刀菌R30株單克隆菌落接種到100ml三角瓶含10ml發酵液體培養基中，在溫度30℃、轉速200r/min下搖床培養3d后，制得發酵菌種(種子液)。

(3)發酵培養，將發酵菌種(種子液)轉接到5瓶500ml三角瓶含100ml發酵用液體培養基，在步驟(1)相同的條件下培養3d，獲得發酵培養物。

(4)清洗分離濕菌體，對發酵培養物濃縮分離后再進行清洗分離處理，獲得鐮刀菌濕菌體(即用于去除生物質材料中的黃曲霉毒素B1的菌劑)。

在上述步驟(3)中經過48h的發酵培養，所獲得的培養物的OD_680nm值可達到40以上，細胞菌落形成單位可以達到20億/ml。

本發明第四方面所涉及的鐮刀菌酶制劑由本發明第一方面所述的菌株經發酵培養后產生，所述酶制劑能夠降解黃曲霉毒素B1。

本發明第五方面所涉及的上述酶制劑的制備方法，其包括將本發明第二方面所述的菌劑或本發明第三方面所述的方法制得的菌劑進行重懸、細胞破碎處理和離心分離處理獲得酶制劑。

在本發明的一些實施例中，采用磷酸鹽緩沖液(PBS)(50mM，pH 7.0)對菌劑進行重懸。

根據本發明的一些事實方式，細胞破碎處理包括在冰浴條件下超聲破碎細胞。在一些實施例中，所述超聲破碎細胞的時間為50min。

本發明對上述制備酶制劑過程中的離心分離的條件沒有特別的限制，在本發明的一些實施例中，例如，可以在15000r/min條件下對帶分離物離心處理30min。

本發明第六方面所涉及的去除生物質材料中的黃曲霉毒素B1的方法，其包括：將本發明第二方面所述的菌劑或本發明第三方面所述的方法制得的菌劑或本發明第四方面所述的酶制劑或本發明第五方面所述的方法制得的酶制劑與含有黃曲霉毒素B1的生物質材料混合后，在密封條件下靜置，生物降解去除生物質材料中的黃曲霉毒素B1，其中所述生物質材料為飼料或糧食。

本發明中，所述飼料包括但不限于玉米、花生、小麥、大米和全價配合飼料等。

本發明中，所述糧食包括但不限于玉米、花生、小麥和大米等。

根據本發明方法，所述生物材料中黃曲霉毒素B1的含量為20μg/kg-20mg/kg，優選所述生物材料中黃曲霉毒素B1的含量為20mg/kg。

本發明中，所述生物材料中水的質量含量為1％-20％，優選所述生物材料中水的質量含量為16.7％-20％，進一步優選所述生物材料中水的質量含量為16.7％。

在本發明的一些實施例中，所述生物降解的溫度為20-35℃，優選所述生物降解的溫度為25-30℃，進一步優選所述生物降解的溫度為30℃。

在本發明的另一些實施例中，所述菌劑的用量為0.1％-1％(菌劑濕重/生物材料重量)，優選所述菌劑的用量為0.2％-0.5％(菌劑濕重/生物材料重量)，進一步優選所述菌劑的用量為0.2％(菌劑濕重/生物材料重量)。

在本發明的又一些實施例中，所述酶制劑的用量為0.5％-5％(酶制劑體積/生物材料重量)，優選所述酶制劑的用量為0.5％-2％(酶制劑體積/生物材料重量)，進一步優選所述酶制劑的用量為2％(酶制劑體積/生物材料重量)。

本發明中，所述酶制劑的濃度為400-500mg/L，優選所述酶制劑的蛋白濃度為500mg/L。

發明用于培養基或發酵培養過程中的“水”，在沒有特別指定的情況下，是指經0.45μ濾膜過濾獲得的去離子水。

本發明中，所述離心分離處理，是指將待分離物裝入離心管中，在一定轉速下進行離心分離，然后將上清液與沉淀物分離的過程。

本發明中所述用語“鐮刀菌粗濕菌體”是指發酵培養物濃縮分離，亦即對發酵培養物進行離心分離處理獲得鐮刀菌菌體。

本發明中所述用語“鐮刀菌粗菌體”是指發酵培養物經離心分離處理獲得的沉淀物(即鐮刀菌粗濕菌體)經清洗分離處理后獲得的鐮刀菌菌體，亦即用緩沖液將發酵培養物經離心分離處理獲得的沉淀物(即鐮刀菌粗濕菌體)重懸清洗后，再進行離心分離處理獲得鐮刀菌菌體。

如前所述，傳統的物理化學法很難高效去除AFB1。本發明從長期污染了黃曲霉毒素的玉米中成功篩選出一株能夠生物降解AFB1的真菌，該菌株為經過涂板篩選分離獲得純菌種，經18S rDNA分子鑒定并命名為腐皮鐮刀菌R30株(Fusarium solani strain R30)，本發明中亦稱為腐皮鐮刀菌R30(Fusarium solani R30)。通過優化培養控制獲得的超高細胞濃度腐皮鐮刀菌R30發酵培養液再經離心分離處理獲得的腐皮鐮刀菌R30濕菌體(腐皮鐮刀菌R30菌劑)，以及通過超聲波破碎腐皮鐮刀菌R30濕菌體細胞所獲得的粗酶液(腐皮鐮刀菌R30酶制劑)均能夠對生物材料中的AFB1進行高效降解。本發明方法對AFB1的降解條件溫和，最適反應溫度為30℃，不會對產品品質造成破壞。采用本發明的腐皮鐮刀菌R30菌劑以及酶制劑可以達到快速、安全和高效生物降解去除生物材料中AFB1的目的。

實施例

為使本發明更加容易理解，下面將結合附圖和實施例來進一步詳細說明本發明，這些實施例僅起說明性作用，并不局限于本發明的應用范圍。本發明中所使用的原料或組分若無特殊說明均可以通過商業途徑或常規方法制得。

本發明采用高效液相色譜測定樣品中AFB1的含量，具體方法如下：

準確稱取5mg AFB1標準品，溶解到裝有10ml無水乙醇的20ml容量瓶中，配制成500mg/L AFB1標準原液。用無水乙醇稀釋可獲得5mg/L、10mg/L、20mg/L和50mg/L的AFB1標準溶液，采用高效液相色譜(HPLC)法分別繪制AFB1濃度和出峰面積與峰高關系的線性關系的標準曲線，并基于此定量測定樣品中AFB1的含量。

色普條件如下：

檢測器：紫外檢測器，檢測波長為360nm；

色譜柱：Diamonsil C18 5μm(250×4.6mm)色譜柱；

流動相：超純水:乙腈＝55:45(v/v)；

流速：1.0ml/min；

進樣量：20μL。

以下實施例以玉米作為生物材料進行試驗，玉米含水量和AFB1含量的調節方法如下：

稱取100g經130℃烘干2小時的玉米粉，加入20ml超純水并攪拌均勻后獲得含水量16.7％的玉米粉。再添加2mg AFB1并充分混合均勻，得到AFB1含量為20mg/kg、含水量16.7％的玉米粉。

實施例1：制備用于去除生物質材料中的黃曲霉毒素B1的菌劑

(1)制備發酵培養基，用500ml三角瓶裝入配制好的液體發酵培養基100ml，瓶口用封口膜封口后在高溫(121℃)高壓(0.15MPa)下滅菌20min，然后在潔凈工作臺內紫外線照射滅菌20min后使用。

所述發酵培養基以1L水計，包括在1L水中的以下組分：

在本發明的一些實施例中，采用40％(重量)氫氧化鈉和36％(v/v)鹽酸溶液調整發酵培養基的初始pH值至7.2。

(2)種子培養，挑取本發明所提供的腐皮鐮刀菌R30株單克隆菌落接種到10ml發酵液體培養基中，在溫度30℃、轉速200r/min下搖床培養3d后，制得發酵菌種(種子液)。

(3)發酵培養，將發酵菌種(種子液)轉接到5瓶100ml發酵用液體培養基，在步驟(1)相同的條件下培養3d，獲得發酵培養物。

腐皮鐮刀菌R30在初始pH 7.2和溫度30℃時液體發酵培養生長曲線如圖2所示。

經過48h的發酵培養，所獲得的培養物的OD_680nm值達到40以上，細胞菌落形成單位達到20億CFU/mL以上。

(4)清洗分離濕菌體，對發酵培養物濃縮分離后再進行清洗分離處理，獲得鐮刀菌濕菌體(即腐皮鐮刀菌R30濕菌體)。

取發酵培養得到的培養物500ml，在常溫下8000r/min離心10min，去掉上清液，再用PBS緩沖液(50mM，pH 7.0)重懸，相同條件下離心去上清，重復兩次后收集并獲得鐮刀菌濕菌體(即腐皮鐮刀菌R30濕菌體)。

實施例2：采用腐皮鐮刀菌R30去除玉米中的黃曲霉毒素B1

稱取50g初始AFB1含量為20mg/kg，含水量為16.7％的玉米粉，將0.1g實施例1中制得的濕菌體加入玉米粉中，充分混勻后放入密閉的塑料帶中，在溫度30℃靜置培養。

在第0、2、4、6、8和15d分別取樣4克，其中2g玉米粉置于50mL三角瓶中，加入10mL乙醇振蕩提取1h，經0.22u無機濾膜過濾后，在60℃下氮氣吹干至2ml用于HPLC測定AFB1濃度。另外2g樣品采用130℃定時烘干法測定含水量，用于最終玉米中AFB1濃度的換算。

腐皮鐮刀菌R30生物降解玉米中AFB1的動力學過程如圖3所示。

從圖3可以看出，利用發酵得到的腐皮鐮刀菌R30菌體，經過濃縮清洗后，應用于受AFB1污染的的玉米粉，經過15d的生物降解，玉米粉中AFB1的濃度從初始的20mg/kg降解到2.8mg/kg，降解率達到85.7％。

實施例3：制備腐皮鐮刀菌R30酶制劑

采用與實施例1相同的方法制備發酵培養物和濕菌體。

取發酵培養得到的菌液500ml，在常溫下8000r/min離心10min，去掉上清液，再用磷酸鹽緩沖液(PBS)(50mM,pH 7.0)重懸，相同條件下離心去上清，重復兩次后收集菌體，用50ml PBS緩沖液重懸，在冰浴條件下超聲破碎細胞50min，再經過離心(15000r/min，30min)后取上清液得到腐皮鐮刀菌R30粗酶液。

實施例4：采用腐皮鐮刀菌R30酶制劑對玉米中黃曲霉毒素的降解

稱取AFB1含量為20mg/kg，含水量為16.7％的50g玉米粉，加入1ml實施例3中制得的蛋白含量為500mg/L粗酶液作為腐皮鐮刀菌R30酶制劑，充分混合均勻后放置于密閉的塑料袋中，在溫度30℃下靜置培養。分別在第0、1、4、12、24和48h各取樣4克，其中2g玉米粉置于50mL三角瓶中，加入10mL乙醇振蕩提取1h，經0.22u無機濾膜過濾后，在60℃下氮氣吹干至2ml用于HPLC測定AFB1濃度。另外2g樣品采用130℃定時烘干法測定含水量，用于最終玉米中AFB1濃度的換算。

圖4顯示了腐皮鐮刀菌R30粗酶生物降解玉米中AFB1的動力學過程。

從圖4可以看出，利用發酵得到的腐皮鐮刀菌R30菌體，經過濃縮清洗后，對細胞進行破壁處理，得到粗酶液，應用于受AFB1污染的玉米粉，經過48h的生物降解，玉米粉中初始含量為20mg/kg的AFB1降解至1.25mg/kg，降解率達到93.8％。

從上述實施例可以看出，本發明采用微生物細胞和酶高效生物降解AFB1的生物技術，具有效率高和成本低等優點，通過發酵培養獲得超高濃度的腐皮鐮刀菌R30細胞，通過細胞破碎獲得其粗酶液，可以直接應用于AFB1的生物降解去除。腐皮鐮刀菌R30在15d時間內對玉米粉中AFB1的降解率達到85.7％，相應的粗酶在48h內對玉米粉中AFB1的降解率達到93.8％。同時，本發明方法對AFB1的降解條件溫和，最適反應溫度為30℃，不會對產品品質造成破壞。

應當注意的是，以上所述的實施例僅用于解釋本發明，并不構成對本發明的任何限制。通過參照典型實施例對本發明進行了描述，但應當理解為其中所用的詞語為描述性和解釋性詞匯，而不是限定性詞匯。可以按規定在本發明權利要求的范圍內對本發明作出修改，以及在不背離本發明的范圍和精神內對本發明進行修訂。盡管其中描述的本發明涉及特定的方法、材料和實施例，但是并不意味著本發明限于其中公開的特定例，相反，本發明可擴展至其他所有具有相同功能的方法和應用。