通過毛細管電泳法分析試樣的方法

專利名稱：通過毛細管電泳法分析試樣的方法
技術領域：
本發明涉及通過毛細管電泳法分析試樣的方法、用于該方 法的毛細管和毛細管電泳裝置。
背景技術：
毛細管電泳法中，聚集在毛細管內壁的離子因施加電壓而 移動，乂人而產生電滲流，由此試才羊移動而進4亍電泳。作為毛細 管，使用熔融二氧化硅制的毛細管，這有時因試樣的吸附而得 不到良好的電滲流。為此，提出了覆蓋毛細管內壁的技術(專
利文獻l、 2、 3、 4)。另一方面，血液中的血紅蛋白(Hb)與 血液中的葡萄糖反應成為糖化Hb。血液中的糖化Hb由于反映了 生物體內血糖值的過去的經歷，因而被作為糖尿病的診斷和治 療等中的指標，其中，(3鏈N末端的纈氨酸發生糖化的物質被稱 為血紅蛋白Alc ( HbAlc),作為特別重要的指標，在臨床檢查 等中實施其測定。血液中的血紅蛋白的測定方法例如有瓊脂糖 電泳法、毛細管電泳法、HPLC法、免疫法、酶法等。這些當中， 可檢測出血紅蛋白的遺傳變異等微小的變異的是毛細管電泳法 和HPLC法。另一方面，對于血紅蛋白的分析裝置，需要其小型 化。關于這方面，HPLC法難以使裝置整體小型化。相對于此， 毛細管電泳法中，通過微芯片(microchip )化，可使裝置整體 小型化。
但是，前述的現有的毛細管電泳法中，存在無法高精度分 析血紅蛋白的問題。為了解決該問題，有如下技術將毛細管 內壁用蛋白質覆蓋，進而用多糖類覆蓋其上(專利文獻5 )。但 是，該技術中，每當分析時，必需進行用蛋白質覆蓋毛細管內壁的操作，存在分析變復雜的問題。另一方面，有不覆蓋毛細 管內壁而在雙性離子性類型的運行緩沖液中含有脂肪族二胺等 流動阻礙劑來進行毛細管電泳的方法(專利文獻6)。但是，該 方法中，存在雖然能分離變異血紅蛋白但無法分離血紅蛋白
Alc的問題。這些問題是不僅在血紅蛋白、在其他試樣的毛細
管電泳法中也普遍存在的問題。
專利文獻l:日本特開2005 - 291926號7>才艮 專利文獻2:日本特開平4 - 320957號7>才艮 專利文獻3:日本特表平5 - 503989號7>才艮 專利文獻4:日本特表平8 - 504037號公報 專利文獻5:日本特開平9 - 105739號7>才艮 專利文獻6:日本特開2006 - 145537號/>才艮

發明內容
于是，本發明的目的在于提供可使裝置小型化、分析精度 高、可容易實施的通過毛細管電泳法分析試樣的方法、用于該 方法的毛細管和毛細管電泳裝置。
為了實現前述目的，本發明的分析方法，其特征在于，其 為通過毛細管電泳法分析試樣的方法，其包括
準備用于前述毛細管電泳法的毛細管的工序；和，
在前述毛細管中，使試樣與含陰極性基化合物結合而成的 復合物進行電泳的工序，
前述毛細管為如下的毛細管在前述毛細管內壁層疊有下 述A層，在前述A層之上層疊有下述B層。
A層夾層，由選自聚二烯丙基二曱基氯化銨 (Polydiallyldimethylammoniumchloride )、無才及小生聚合4勿禾口含陽 極性基化合物所組成的組中的至少 一種形成、
6包含前述聚二烯丙基二曱基氯化銨時，前述聚二烯丙基二 甲基氯化銨通過物理吸附被固定于前述毛細管內壁、
包含前述無極性聚合物和前述含陽極性基化合物的至少一 個時，前述無極性聚合物和前述含陽極性基化合物的至少一個 通過共價4建被固定于前述毛細管內壁；
B層由含陰極性基化合物形成的陰極性層。 本發明的毛細管，其特征在于，其為用于前述本發明的分
析方法的毛細管電泳用的毛細管，其中，
在前述毛細管內壁層疊有下述A層，在前述A層之上層疊有
下述B層。
A層夾層，由選自聚二烯丙基二曱基氯化銨、無極性聚 合物和含陽極性基化合物所組成的組中的至少 一種形成、
包含前述聚二烯丙基二甲基氯化銨時，前述聚二烯丙基二 甲基氯化銨通過物理吸附被固定于前述毛細管內壁、
包含前述無極性聚合物和前述含陽極性基化合物的至少一 個時，前述無極性聚合物和前述含陽極性基化合物的至少一個 通過共價鍵被固定于前述毛細管內壁；
B層由含陰極性基化合物形成的陰極性層。
本發明的毛細管電泳裝置，其特征在于，該毛細管電泳裝 置用于前述本發明的分析方法，其包含前述本發明的毛細管。 此外，本發明的毛細管電泳裝置如后述那樣，可以為被小型化 (微芯片化)的微芯片電泳裝置。
本發明的分析方法中，由于使用夾著固定于毛細管內壁的 A層形成有B層的毛細管，因而可防止例如血紅蛋白等血液試樣 中的蛋白質等吸附于毛細管內壁，由此分離效率變高。由以上可知，根據本發明的分析方法，可以以
短時間且高精度實施血紅蛋白等試樣的分析。此外，前述A層 由于被牢固固定于毛細管內壁，因而一旦形成，則即便洗滌也 不容易剝離，可反復使用。為此，本發明的分析方法中， 一旦 形成A層，則沒有必要每次分析都形成A層，因此，可容易實施 分析。此外，本發明中，由于采用毛細管電泳法，因而可使分 析裝置小型化。


圖l是顯示本發明的一實施例的血紅蛋白的分析結果的圖表。
圖2是顯示本發明的其他實施例的血紅蛋白的分析結果的 圖表。
圖3是顯示本發明的另 一 其他實施例的血紅蛋白的分析結 果的圖表。
圖4是顯示本發明的另 一其他實施例的血紅蛋白的分析結 果的圖表。
圖5是顯示本發明的另 一 其他實施例的血紅蛋白的分析結 果的圖表。
圖6是顯示本發明的毛細管電泳裝置的 一 例的結構的圖。圖 6(A)是該例的毛細管電泳裝置的俯視圖，圖6(B)是圖6(A) 的I-I剖面圖，圖6 (C)是圖6 ( A)的II-II剖面圖。
圖7是顯示本發明的毛細管電泳裝置的其他例的結構的圖。 圖8是顯示本發明的毛細管電泳裝置的另 一 其他例的結構 的圖。
圖9是顯示本發明的毛細管電泳裝置的另 一其他例的結構 的圖。
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具體實施例方式
本發明中，前述運行緩沖液，是指實際的分離工序中使用
的緩沖液(緩沖液，buffer)。本發明的分析方法中，優選通過 使前述A層與包含前述含陰極性基化合物的液體接觸，從而形 成前述B層。該情況下，優選前述包含含陰極性基化合物的液 體為包含含陰極性基化合物的運行緩沖液。
本發明的分析方法中，優選通過使前述毛細管內壁與包含 聚二烯丙基二甲基氯化銨的液體接觸，從而在前述毛細管內壁 形成聚二烯丙基二曱基氯化銨制的A層。
本發明的分析方法中，優選在前述毛細管中，在包含含陰 極性基化合物的運行緩沖液中添加試樣，接著，對毛細管的兩 端施加電壓，使試樣與含陰極性基化合物的復合物進行電泳。
本發明的分析方法和毛細管中，形成前述B層的前述含陰 極性基化合物、和與前述試樣形成復合物的前述含陰極性基化 合物，可以相同也可以不同。前述含陰才及性基化合物優選含陰 極性基的多糖類。作為前述含陰極性基的多糖類，有例如硫酸 化多糖類、羧酸化多糖類、磺酸化多糖類、磷酸化多糖類，其 中，優選硫酸化多糖類和羧酸化多糖類。作為前述碌u酸化多糖 類，優選硫酸軟骨素、肝素等，更優選硫酸軟骨素。作為前述 羧酸化多糖類，優選藻酸或其鹽(例如，藻酸鈉)。硫酸軟骨素 有A、 B、 C、 D、 E、 H、 K這七種，可使用任一種。
本發明的分析方法和毛細管中，前述無極性聚合物優選硅 酮聚合物，前述陽極性基優選氨基、銨基。
本發明中，前述試樣優選包含血紅蛋白的試樣。
本發明的毛細管電泳裝置中，包括基板、多個液槽和毛細 管，在前述基板上形成有前述多個液槽，前述多個液槽通過前 述毛細管連通，前述毛細管可以為前述本發明的毛細管。此時，
9前述基才反的最大長度為例如10 100mm的范圍，優選30~ 70mm 的范圍，前述基板的最大寬度為例如10 60mm的范圍，前述基 板的最大厚度為例如0.3 5mm的范圍。另外，前述基板的最大 長度，是指前述基板的長度方向的最長部的長度，前述基板的 最大寬度，是指與前述基板的前述長度方向垂直的方向(寬度 方向)的最長部的長度，前述基板的最大厚度，是指與前述基 板的前述長度方向和前述寬度方向的兩方向垂直的方向(厚度 方向)的最長部的長度。這樣，本發明的毛細管電泳裝置可以 為被小型化(微芯片化)的微芯片電泳裝置。 接著，詳細說明本發明。
如前所述，本發明的毛細管在其內壁夾著前述A層形成有 前述B層。
前述毛細管的材質沒有特別限制，可列舉例如玻璃、熔融 二氧化硅、塑料等。玻璃制、熔融二氧化硅制的毛細管的內壁 通常為具有陰性的電荷的狀態。塑料制的毛細管內壁是根據塑 料中的極性基的有無或種類而成為具有陽性或者陰性的電荷的 狀態，或者為無電荷(無極性)的狀態。此外，即使是不帶有 極性基的塑料，通過導入極性基，可使其成為具有電荷的狀態。 作為前述塑料制的毛細管，可使用市售品，可列舉由例如聚甲 基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯 (PTFE)、聚醚醚酮(PEEK)等形成的毛細管。前述毛細管的 內徑為例如10~ 200|a m的范圍、優選25 ~ lOOiam的范圍。前述 毛細管的長度為例如10~ 1000mm的范圍。
前述A層可使用聚二烯丙基二甲基氯化銨、無極性聚合物 和含陽極性基化合物的任一種來形成，也可以將這些組合使用 兩種以上來形成。
使用聚二烯丙基二甲基氯化銨在前述毛細管內壁形成前述
10A層時，例如將聚二烯丙基二曱基氯化銨水溶液通入前述毛細 管內即可。當前述毛細管由玻璃或熔融二氧化硅形成時，聚二
烯丙基二曱基氯化銨牢固吸附于前述毛細管內壁，由此形成A 層。該A層不會容易因洗滌而剝離。前述聚二烯丙基二曱基氯 化銨水溶液的濃度為例如l ~ 20重量％的范圍、優選5 ~ 10重 量％的范圍。優選在通入聚二烯丙基二曱基氯化銨水溶液之前， 向前述毛細管中通入石威性水溶液，接著通入^是純水來洗滌。作 為前述》咸性水溶液，有例如氫氧化鈉水溶液。此外，在通入聚 二烯丙基二甲基氯化銨水溶液之后，為了除去未參與前述A層 的形成中的殘留聚二烯丙基二甲基氯化銨，優選在前述毛細管 中通入提純水。
在前述毛細管內壁形成前述A層的無極性聚合物優選硅酮 聚合物，這如前所述。使用珪酮聚合物形成前述A層時，例如 將含石圭酮聚合物的液體通入前述毛細管內即可。當前述毛細管 由玻璃或熔融二氧化硅形成時，硅酮聚合物以共價鍵被牢固固 定于前述毛細管內壁，由此形成A層。該A層不容易因洗滌而剝 離。
作為前述硅酮聚合物，可列舉例如聚硅氧烷和聚硅氮烷。 作為前述聚硅氧烷和前述聚硅氮烷，包括例如聚二有機硅氧烷、 聚二有機硅氮烷、聚有機氫硅氧烷。作為前述聚硅氧烷和前述 聚硅氮烷的具體例，可列舉聚二烷基硅氧烷、聚二烷基硅氮烷、 聚芳基硅氧烷、聚芳基硅氮烷、聚烷基芳基硅氧垸、聚二芳基 硅氧烷、環狀硅氧烷以及環狀硅氮烷。
包含前述硅酮聚合物的液體，為例如在溶劑中分散或溶解 硅酮聚合物而得到的分散液或者溶解液。通入前述硅酮聚合物 的分散液或者溶解液之后，通過干燥等蒸發除去溶劑時，在前 述毛細管內壁形成前述硅酮聚合物的皮膜層。對其加熱時，前述硅酮聚合物通過共價鍵與玻璃制或者熔融二氧化硅制的毛細 管內壁結合。前述加熱處理優選例如如下那樣實施。首先，在 形成有前述硅酮聚合物的皮膜層的毛細管內部通入惰性氣體以 除去氧氣。在該狀態下，通過加熱等將前述毛細管的兩端密封
以成為密閉狀態。將該毛細管在例如2 00 ~ 4 5 (TC下加熱處理10 分鐘~ 12小時時，前述硅酮聚合物通過共價4建與前述毛細管內 壁結合。接著，冷卻前述毛細管，通過切斷等而開放兩端，用 溶劑將內部洗滌以除去未反應的硅酮聚合物。如此操作，可在 毛細管內壁形成硅酮聚合物制的前述A層。前述硅酮聚合物制 的A層的厚度為例如50 400nm的范圍、優選100~ 400nm的范 圍。通過硅酮聚合物形成有A層的毛細管可以使用市售品。
通過前述含陽極性基化合物在前述毛細管內壁形成A層 時，例如〗吏用包含前述陽極性基和反應基的化合物即可。當前 述毛細管為玻璃制或者熔融二氧化硅制時，可使用具有陽極性 基和硅的化合物(曱硅烷基化劑)。作為前述陽極性基，優選氨 基、銨基。作為前述含陽極性基化合物優選的是具有氨基和銨 基的至少一個陽極性基的甲硅烷基化劑。氨基可以為伯氨、仲
氨、叔氨。
前述曱硅烷基化劑可列舉例如N- (2-二氨基乙基)-3 -丙基三曱氧基硅烷、氨基苯氧基二曱基乙烯基硅烷、3 -氨基 丙基二異丙基乙氧基硅烷、3 -氨基丙基曱基雙(三曱基甲硅烷 氧基)硅烷、3-氨基丙基五曱基二硅氧烷、3-氨基丙基硅烷 三醇、雙(P-氨基苯氧基)二甲基硅烷、1,3-雙(3-氨基丙 基)四甲基二硅氧烷、雙(二甲基氨基)二甲基硅烷、雙(二 曱基氨基)乙烯基甲基硅烷、雙(2-羥乙基)_3-氨基丙基 三乙氧基硅烷、3 -氰基丙基(二異丙基)二曱基氨基硅烷、(氨 基乙基氨基曱基)苯乙基三曱氧基硅烷、N-曱基氨基丙基三
12乙氧基硅烷、四(二乙基氨基)硅烷、三(二甲基氨基)氯硅 烷、三(二曱基氨基)硅烷等。
前述曱硅烷基化劑中，可使用將硅原子置換成鈦或者鋯的 物質。前述曱硅烷基化劑可使用單獨一種，也可組合使用二種 以上。
使用前述曱硅烷基化劑的A層的形成，通過例如如下實施。 首先，將曱硅烷基化劑溶解或分散到有機溶劑來調制處理液。 作為前述處理液的調制中所4吏用的前述有才幾溶劑，可4吏用例如 二氯曱烷、曱苯等。前述處理液的曱硅烷基化劑的濃度沒有特 別限制。將該處理液通入到玻璃制或者熔融二氧化硅制的毛細 管中、加熱。通過該加熱，前述曱硅烷基化劑通過共價鍵結合 于前述毛細管內壁，其結果，陽極性基被配置于前述毛細管內 壁。其后，用有機溶劑(二氯曱烷、甲醇、丙酮等)、酸性溶液 (磷酸等)、堿性溶液和表面活性劑溶液的至少一種洗滌(后處 理)。另外，該洗滌是任意的，但優選實施。形成有使用前述曱
硅烷基化劑的A層的毛細管可使用市售品。
接著，在前述A層之上通過含陰極性基化合物形成B層。通 過將前述包含含陰極性基化合物的液體與前述A層接觸，可形 成前述B層。該情況下，可另行調制用于形成B層的液體，從操 作效率方面考慮，優選調制包含含陰極性基化合物的運行緩沖 液，并將其通入具有前述A層的毛細管中。
前述運行緩沖液沒有特別限制，優選為使用酸的緩沖液。 前述酸有例如馬來酸、酒石酸、琥珀酸、富馬酸、鄰苯二甲酸、 丙二酸、蘋果酸。此外，前述運行緩沖液優選包含弱堿。作為 前述弱堿，有例如精氨酸、賴氨酸、組氨酸、三羥甲基氨基曱 烷等。前述運行緩沖液的pH為例如pH4.5 6的范圍。前述運行 緩沖液的緩沖液的種類有MES、 ADA、 ACES、 BES、 MOPS、TES、 HEPES等。前述運行緩沖液中，前述含陰才及性基化合物
的濃度為例如O.Ol ~ 5重量％的范圍。
接著，本發明的分析方法例如可對包含血紅蛋白的試樣按 如下操作實施。
首先，對使用通過聚二烯丙基二甲基氯化銨形成前述A層 的毛細管進行的分析方法進行說明。首先，準備玻璃制或者熔 融二氧化硅制的毛細管。使用泵等施加壓力向其中通入氫氧化 鈉水溶液等堿性溶液，接著，通入提純水洗滌。前述堿性溶液 和前述l是純水的各通液時間為例如l ~ IO分鐘，前述通液時的各 壓力為例如0.05 ~ O.lMPa。接著，通過泵等施加壓力向前述毛 細管中通入聚二烯丙基二曱基氯化銨水溶液。該通液的時間為 例如5 ~ 30分鐘，前述通液時的壓力為例如0.05 ~ O.lMPa。接著， 通過泵等施加壓力向前述毛細管中通入提純水，除去殘留的聚 二烯丙基二甲基氯化銨。該通液時的時間和壓力與前述洗滌的
情況相同。如此操作，通過聚二烯丙基二甲基氯化銨在毛細管 內壁形成A層。另外，通液時間和通液壓力由毛細管的內徑和 長度來適當決定，前述各通液時間和各通液壓力在例如內徑50 pm、長320mm的毛細管中是優選的例子。以下也同樣。
接著，通過泵等施加壓力，將包含硫酸軟骨素等含陰極性 基化合物的運行緩沖液通入前述毛細管。該通液的時間為例如 10~60分鐘，通液的壓力為例如0.05 ~ O.lMPa。通過該通液， 在前述A層之上層疊由硫酸軟骨素等形成的B層。在該狀態下， 將含血紅蛋白的試樣導入前述毛細管，對前述毛細管的兩端施 加電壓、進行電泳。前述含血紅蛋白的試樣沒有特別限制，可 列舉例如對全血進行溶血處理的試樣，此外，還可用提純水、 運行緩沖液稀釋該試樣。前述含血紅蛋白的試樣的導入從前述 毛細管的陽極側進行。被導入的血紅蛋白與前述運行緩沖液中的含陰極性基化合物結合而形成復合物。通過施加電壓，前述 毛細管內的運行緩沖液中產生電滲流，前述復合物向毛細管的
陰極側移動。前述施加電壓的程度為例如5 ~ 30kV。該移動通 過光學方法檢測出。借助光學方法的檢測沒有特別限制，優選 在415nm的波長下進行。
接著，使用通過無極性聚合物和含陽極性基化合物的至少 一個形成A層的毛細管進行的分析方法，除了如前所述準備形 成有A層的毛細管來使用以外，可與前述同樣地實施。
本發明中，作為分析對象的血紅蛋白沒有特別限制，有例 如正常血紅蛋白、糖化血紅蛋白(例如，HbAlc、不穩定型 HbAlc、 GHbLys等)、遺傳變異型血紅蛋白等。本發明中，可 將HbAlc與其以外的血紅蛋白分離來分析。
接著，舉例對本發明的毛細管電泳裝置進行說明。這里， 本發明的毛細管電泳裝置并不限于下述的例子。
圖6是表示本發明的毛細管電泳裝置的一例。圖6 (A)是 該例的毛細管電泳裝置的俯視圖，圖6 (B)是圖6 (A)的1-I 剖視圖，圖6 ( C)是圖6 ( A)的II- II剖視圖。此外，該圖中， 為了容易理解，各結構要素的大小和比率等與實際不同。該例 的毛細管電泳裝置為被小型化(微芯片化)的微芯片電泳裝置。 如圖所示，該孩么芯片電泳裝置包括基板l、多個(該例中為4 個)液才曹2a d、 4才艮毛細管3xl、 3x2、 3yl和3y2。前述4才艮毛細 管全部為前述本發明的毛細管。前述4個液槽2a d包括第l 導入槽2a、第l回收槽2b、第2導入槽2c和第2回收槽2d。前述4 根毛細管其各自一端在中心部c聚集，十字狀連結。其結果，前 述4根毛細管其內部被連通。前述基板l設置有用于嵌入前述4 根毛細管的孔洞(未圖示)。前述毛細管3xl按照其另 一端位于 前述第l導入槽2a的底面的方式嵌入到前述基4反1中。前述毛細
15管3 x 2按照其 一 端位于前述第1回收槽2 b的底面的方式嵌入到前 述基板l中。前述毛細管3xl和3x2構成試樣分析用的毛細管流路 3x。前述毛細管3yl按照其另 一端位于前述第2導入槽2c的底面 的方式嵌入到前述基板l中。前述毛細管3y2按照其另 一端位于 前述第2回收槽2d的底面的方式嵌入到前述基才反l中。前述毛細 管3yl和3y2構成試樣導入用的毛細管流-各3y。前述多個液槽 2a~ d各自在前述基^反1上以凹部形式形成。前述基^反1在前述試 樣導入用的毛細管流路3y的第l回收槽2b側具有長方體狀的開 口部(窗)9。另外，該例的微芯片電泳裝置為長方體狀。但本 發明并不限于此。本發明的微芯片電泳裝置只要對電泳分析不 帶來妨礙，則可以為任何形狀。此外，該例的微芯片電泳裝置 的平面形狀為長方形。但本發明并不限于此。本發明的微芯片 電泳裝置的平面形狀可以為例如正方形或其他形狀。并且，該 例的微芯片電泳裝置中，前述試樣分析用的毛細管流路3x與前 述試樣導入用的毛細管流路3y的最大長度不同。但本發明并不 限于此。本發明的微芯片電泳裝置中，前述試樣分析用的毛細 管流路3x與前述試樣導入用的毛細管流路3y的最大長度可以相 同。這些以外的結構中，本發明的微芯片電泳裝置的結構也不 限于該例子。
接著，對該例子的微芯片電泳裝置的制造方法進行說明。 其中，前述微芯片電泳芯片也可通過下述的制造方法以外的方 法制造。
該例的微芯片電泳裝置中，作為前述基板l，可使用由例如 玻璃、聚合物材料等形成的基板。作為前述玻璃材料，可列舉 例如合成石英玻璃、硼硅酸玻璃等。作為前述聚合物材料，可 列舉例如聚曱基丙烯酸甲酯(PMMA)、環烯烴聚合物(COP)、 聚碳酸酯(PC)、聚二曱基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯(PS)、聚乳酸等。
該例的微芯片電泳裝置中，前述基板l的最大長度、最大寬 度和最大厚度如前所述。
前述4根毛細管的內徑各自如前述本發明的毛細管的內徑。
前述試樣分析用的毛細管流路3x和前述試樣導入用的毛細管流 路3y的最大長度為例如0.5 ~ 15cm的范圍。前述4根毛細管的長 度各自根據前述試樣分析用的毛細管流路3x和前述試樣導入用 的毛細管流路3y的最大長度來決定。
前述多個液槽2a d的容積沒有特別限制，例如分別為1 ~ 1000mm3的范圍，優選50 ~ 100mn^的范圍。圖6中，前述多個 液槽2a d的形狀為圓柱狀。但本發明并不限于此。本發明的微 芯片電泳裝置中，前述多個液槽的形狀只要對后述試樣的導入 和回收沒有妨礙則沒有特別限制，可以制成例如四棱柱狀、四 棱錐狀、圓錐狀、將這些組合的形狀等任意的形狀。此外，前
述多個液槽的容積和形狀可全部相同、也可各自不同。
該例的微芯片電泳裝置的制造工序的一例如下所示。其中， 前述孩i芯片電泳裝置也可以用下述的制造工序以外的工序制 造。
首先，制作前述基板l。對前述基板l的前述4個液槽2a d 和前述開口部(窗)9的形成方法沒有特別限制。例如，前述基 板l的材質為前述玻璃時，作為前述形成方法，可列舉例如超聲 波加工等。例如，前述基板l的材質為前述聚合物材料時，作為 前述形成方法，可列舉例如使用模具的注射成型、注入成型、 擠壓成型等成型法、切削加工法等。前述4個液槽2a d和前述 開口部(窗)9可各自單獨形成，也可將全部同時形成。單獨形 成前述4個液槽2a d和前述開口部(窗)9時，可以以任何順序 形成。通過前述使用才莫具的方法等，同時形成前述4個液槽2a
17d和前述開口部(窗)9全部時，工序少，此為優選。
接著，將前述4根毛細管嵌入前述基板1。這樣操作，可得 到該例的微芯片電泳裝置。
前述微芯片電泳裝置還可具有多個電極。圖7顯示具有前述 多個電極的該例的微芯片電泳裝置。該圖中，在與圖6同 一部分 標有同一符號。如圖所示，該微芯片電泳裝置具有4根電極6a d。前述4才艮電才及6a d各自按照其一端位于前述多個液槽2a d 內的方式嵌入前述基板l。前述4根電極6a d可以在例如制造前 述基板l時通過預先在形成于前述基;f反1側面形成前述4根電極 6a~ d的導入孔而容易地配置。另外，前述微芯片電泳裝置中， 前述多個電才及為任意的結構部件。前述多個電才及還可以在例如 使用前述微芯片電泳裝置時插入到前述多個液槽內。
前述多個電才及6a d只要可用于電泳法則可以是任何電才及。 前述多個電極6a d為例如各自為不銹鋼(SUS )制電極、鉑(Pt) 電極、金(Au)電極等。
前述微芯片電泳裝置可以進一步包含用于將含血紅蛋白等 的試樣溶血、且稀釋的前處理槽。前述含血紅蛋白的試樣的溶 血處理沒有特別限制，可以為例如用溶血劑將前述含血紅蛋白 的試樣溶血的處理。前述溶血劑破壞例如前述含血紅蛋白的試 樣中的血球成分的血球膜。作為前述溶血劑，可列舉例如前述 運行緩沖液、皂戒、NACALAI TESQUE，INC.制的商品名 "TritonX - 100"等，特別優選前述運4亍緩沖液。前述前處理 槽優選例如與前述導入槽連通。前述前處理槽形成于其被連通 的液槽、例如前述第2導入槽2c的附近等適當的位置即可。有前 述前處理槽的情形中，前述含血紅蛋白的試樣^皮導入到前述前 處理槽。由此，#:前處理的前述含血紅蛋白的試才羊通過連結前 述前處理槽和與其連通的液槽例如前述第2導入槽2c的流^各而
18被導入到前述第2導入槽2C。前述前處理槽可以為用于將前述含 血紅蛋白的試樣溶血的槽與用于稀釋前述含血紅蛋白的試樣的
槽這2個槽連通的結構。
前述微芯片電泳裝置可以進一步具有分析部。圖8是顯示具 有前述分析部的該例的微芯片電泳裝置。該圖中，在與圖6和圖 7相同的部分標記有同一符號。如圖所示，該微芯片電泳裝置具 有分析部7。該例的微芯片電泳裝置中，前述分析部7為檢測器
(線檢測器)。前述線檢測器直接配置于前述毛細管3x2之上， 其配置方式為位于前述試樣分析用的毛細管流路3x與前述試 樣導入用的毛細管流路3 y的交差部分的前述第1的回收槽2 b側。 該微芯片電泳裝置中，基板l除了設有用于嵌入前述4根毛細管 的孔洞以外，還設有用于嵌入前述分析部(線;險測器)7的孔洞
(未圖示)。前述線4企測器內設光源和4企測部。前述線檢測器從 前述光源向試樣發光并通過前述4企測部4全測來自試樣的反射 光，從而測定吸光度。前述分析部7并不限于前述線檢測器，只 要可進4亍例如包含血紅蛋白的試樣的分析，則可以為任何的枱r 測器。例如，前述分析部7可以由配置于前述孩i芯片電泳裝置的 下方的光源、和配置于對應于前述線檢測器的配置處的位置的 才全測部構成。該情況下，通過從前述光源向試樣發光并通過前 述檢測部檢測來自試樣的透過光，從而測定吸光度。
圖9是顯示本發明的微芯片電泳裝置的另一其他例。該圖 中，在與圖8相同的部分標記有同一符號。如圖所示，該例的微 芯片電泳裝置除了分析部7不同以外，具有與圖8所示的微芯片 電泳裝置同樣的結構。如該例那樣，前述分析部7可以在1點測 定吸光度。
使用圖8和9所示的微芯片電泳裝置的本發明的分析方法， 例如對包含血紅蛋白的試樣可通過如下才喿作實施。
19首先，對前述4根毛細管使用由聚二烯丙基二甲基氯化銨形
成前述A層的毛細管時的分析方法進行說明。首先，通過泵等 施加壓力，將氫氧化鈉水溶液等^5成性水溶液通入前述試樣分析 用的毛細管流路3x和前述試樣導入用的毛細管流路3y，接著， 通入才是純水洗滌。前述石威性水溶液和前述才是純水的各通液時間 和前述通液時的壓力為例如如前所述。接著，通過泵等施加壓 力，將聚二烯丙基二曱基氯化銨水溶液通入前述試樣分析用的 毛細管流^各3x和前述試樣導入用的毛細管流^各3y。該通液的時 間和通液的壓力為例如如前所述。接著，通過泵等施加壓力， 將提純水通入前述試樣分析用的毛細管流-各3x和前述試樣導入 用的毛細管流路3y,除去殘留的聚二烯丙基二曱基氯化銨。該 通液的時間和通液的壓力為例如如前所述。這樣才喿作，由聚二 烯丙基二曱基氯化銨在前述試樣分析用的毛細管流路3x和前述 試樣導入用的毛細管流路3 y的內壁形成A層。
接著，通過泵等施加壓力，將包含硫酸軟骨素等含陰極性 基的多糖類的運行緩沖液通入前述試樣分析用的毛細管流路3 x 和前述試樣導入用的毛細管流^各3y。該通液的時間和通液的壓 力為例如如前所述。通過該通液，在前述A層之上層疊由石危酸 軟骨素等形成的B層。接著，通過壓力或毛細管作用，將前述 運行緩沖液填充到前述試樣分析用的毛細管流^各3 x和前述試樣 導入用的毛細管流-各3y。
另外，在微芯片電泳裝置非使用時(非分析時)，如果預先 完成至前述運行緩沖液的填充工序，則可省略前述各工序并直 接進入以下的工序，故優選。
接著，在前述第2導入槽2c中導入含血紅蛋白的試樣。作為 前述含血紅蛋白的試樣，如前所述。微芯片電泳裝置具有前述 前處理槽(未圖示)時，將前述含血紅蛋白的試樣導入前述前處理槽，在其中進行前處理。接著，對前述電極6c和前述電極 6d施加電壓，4吏前述試樣導入用的毛細管流^各3y的兩端產生電 位差。由此，將前述含血紅蛋白的試樣導入前述試樣導入用的 毛細管流路3y。 一皮導入的血紅蛋白與前述運行緩沖液中的含陰 極性基的多糖類結合形成復合物。通過施加電壓，前述試樣導 入用的毛細管流路3y內的運行緩沖液中產生電滲流，前述復合 物移動至前述試樣分析用的毛細管流路3x與前述試樣導入用的 毛細管流^各3y的交差部分。
前述電極6c與前述電極6d之間的電位差為例如0.5 ~ 5kV的 范圍。
接著，對前述電才及6a和前述電極6b施加電壓，使前述試樣 分析用的毛細管流路3x的兩端產生電位差。這樣，將在兩端具 有電位差的毛細管流^各瞬間從前述試樣導入用的毛細管流^各3 y 切換到前述試樣分析用的毛細管流^各3x, 乂人而如圖8和9的箭頭 所示那樣，使前述試樣8從前述試樣分析用的毛細管流路3 x與前 述試樣導入用的毛細管流^各3y的交差部分移動至前述第l的回 收槽2b側。
前述電極6a與前述電才及6b之間的電位差為例如0.5 ~ 5kV的 范圍。
接著，通過前述檢測器7，檢測出根據移動速度的差而分離 的前述含血紅蛋白的試樣中的各成分。由此，可分離前述含血 紅蛋白的試樣中的各成分來分析。
接著，在前述4根毛細管中使用由無極性聚合物和含陽極性 基化合物的至少 一 個形成A層的毛細管時的分析方法如前所 述，除了使用形成有A層的毛細管以外，可以與前述同樣操作 來實施。
實施例接著，對本發明的實施例進行說明。 (實施例l )
準備熔融二氧化硅制的毛細管(全長32cm、有效長8.5cm、 內徑50iLim)。在該毛細管中以壓力0.1MPa ( 1000mbar)通入氫 氧化鈉水溶液(lmol/L) IO分鐘，4妄著，在與前述相同的壓 力下通入提純水20分鐘、洗滌。接著，在與前述相同的壓力下 通入聚二烯丙基二曱基氯化銨水溶液(IO重量％ ) 30分鐘，接 著，在與前述相同的壓力下通入提純水20分鐘，從而在前述毛 細管的內壁形成聚二烯丙基二曱基氯化銨制的A層。接著，準 備在100mM蘋果酸和精氨酸水溶液中添加0.5重量％的比例的 硫酸軟骨素而得到的運行緩沖液(pH5.5)。在與前述相同的壓 力下將該運行緩沖液通入形成有前述A層的毛細管，在前述A 層之上形成前述B層。在前述毛細管內填充有運行緩沖液的狀 態下，將由血紅蛋白溶解于提純水而成的試樣注入前述毛細管 內，對前述毛細管的兩端施加10kV電壓，進行電泳。前述含血 紅蛋白的試樣的注入是從前述毛細管的陽極側進行。在415nm 的吸光度下檢測出移動的血紅蛋白。將該結果示于圖l的圖表 中。如圖所示，本實施例中，可將正常血紅蛋白(HbA0)與糖 化血紅蛋白(HbAlc)分離來檢測。此外，本實施例中使用的 毛細管在洗滌之后僅如前所述那樣通入運行緩沖液就形成前述 B層，可馬上進行分析。 (實施例2)
準備在內壁具有由具有氨基的曱硅烷基化劑以共價鍵固定 形成的A層的熔融二氧化硅制的毛細管(全長32cm、有效長 8.5cm、內徑50ium)。在該毛細管中以壓力0. lMPa ( 1000mbar ) 通入提純水20分鐘、洗滌。接著，準備在100mM蘋果酸和精氨 酸水溶液中以0.5重量％的比例添加硫酸軟骨素而得到的運行
22緩沖液(pH5.5)。在與前述相同的壓力下將該運行緩沖液通入 前述毛細管，在前述A層之上形成前述B層。在前述毛細管內填 充有運行緩沖液的狀態下，將由血紅蛋白溶解于提純水而成的 試樣注入前述毛細管內，對前述毛細管的兩端施加10kV電壓， 進行電泳。前述含血紅蛋白的試樣的注入是從前述毛細管的陽 極側進行。在415nm的吸光度下4企測出移動的血紅蛋白。該結 果如圖2的圖表所示。如圖所示，本實施例中，可將正常血紅蛋 白(HbA0)與糖化血紅蛋白(HbAlc)分離來4全測。此外，本 實施例中使用的毛細管在洗滌之后僅如前所述那樣通入運行緩 沖液就形成前述B層，可馬上進行分析。于是，用與前述同樣 的試樣實施10次相同的分析，評價再現性。該結果示于下述表1 。 下述表l中，相對面積(％ )為相對于總峰面積的正常血紅蛋白
(HbA0)和糖化血紅蛋白(HbAlc)的各峰面積的比率(％ )。 如下述表l所示，在正常血紅蛋白(HbAO )和糖化血紅蛋白
(HbAlc)的各個中，變差系數(CV)的值小，由此，本發明 的分析方法可以說再現性優異。 表l相對面積(0/b)No.HbA1cHbAO
110.0889.92
210.3789.63
310,1889.82
410,4989,51
510.3489.66
610.3089.70
79.8990.11
810.17訓3
910.2489,76
1010.3289.68
平均10.2489.76
變差系數(CV)1.70,2
(實施例3 )
準備在內壁具有由具有氨基的曱硅烷基化劑以共價鍵固定 形成的A層的熔融二氧化硅制的毛細管(全長32cm、有效長 8.5cm、內徑50jam)。在該毛細管中以壓力O.lMPa ( 1000mbar ) 通入提純水20分鐘、洗滌。接著，準備在100mM蘋果酸和精氨 酸水溶液中以0.8重量％的比例添加藻酸鈉而得到的運行緩沖 液(pH5.5)。在與前述相同的壓力下將該運4亍纟爰沖液通入前述 毛細管，在前述A層之上形成前述B層。在前述毛細管內填充有 運行緩沖液的狀態下，將由血紅蛋白溶解于提純水而成的試樣 注入前述毛細管內，對前述毛細管的兩端施加10kV電壓，進行 電泳。前述含血紅蛋白的試樣的注入是從前述毛細管的陽極側 進行。在415nm的吸光度下檢測出移動的血紅蛋白。該結果示 于圖3的圖表。如圖所示，本實施例中，可將正常血紅蛋白 (HbA0)與糖化血紅蛋白(HbAlc)分離來4全測。此外，本實 施例中使用的毛細管在洗滌之后僅如前所述那樣通入運行緩沖
24液就形成前述B層，可馬上進行分析。
(實施例4 )
準備在內壁具有由具有氨基的曱硅烷基化劑以共價鍵固定
形成的A層的熔融二氧化硅制的毛細管(全長32cm、有效長 8.5cm、內徑50jum)。在該毛細管中以壓力O.lMPa ( 1000mbar ) 通入提純水20分鐘、洗滌。接著，準備在100mM蘋果酸和精氨 酸水溶液中添加0.5重量％的比例的肝磷酯鈉的運行緩沖液 (pH5.5 )。在與前述相同的壓力下將該運行緩沖液通入前述毛 細管，在前述A層之上形成前述B層。在前述毛細管內填充有運 行緩沖液的狀態下，將由血紅蛋白溶解于提純水而成的試樣注 入前述毛細管內，對前述毛細管的兩端施加10kV電壓，進行電 泳。前述含血紅蛋白的試樣的注入是從前述毛細管的陽極側進 行。在415nm的吸光度下4企測出移動的血紅蛋白。該結果示于 圖4的圖表。如圖所示，本實施例中，可將正常血紅蛋白(HbAO) 與糖化血紅蛋白(HbAlc)分離來4企測。此外，本實施例中使 用的毛細管在洗滌之后僅如前所述那樣通入運行緩沖液就形成 前述B層，可馬上進行分析。 (實施例5 )
準備在內壁具有由聚(二曱基硅氧烷)以共價鍵固定形成 的A層的熔融二氧化硅制的毛細管(全長32cm、有效長8.5cm、 內徑50idm)。在該毛細管中以壓力0.1MPa ( 1000mbar)通入提 純水20分鐘、洗滌。接著，準備在100mM蘋果酸和精氨酸水溶 液中添加1.0重量％的比例的硫酸軟骨素得到的運行緩沖液 (pH5.5 )。在與前述相同的壓力下將該運行緩沖液通入前述毛 細管，在前述A層之上形成前述B層。在前述毛細管內填充有運 行緩沖液的狀態下，將由血紅蛋白溶解于提純水而成的試樣注 入前述毛細管內，對前述毛細管的兩端施加10kV電壓，進行電泳。前述含血紅蛋白的試樣的注入是從前述毛細管的陽極側進
行。在415nm的吸光度下檢測出移動的血紅蛋白。該結果示于 圖5的圖表。如圖所示，本實施例中，可將正常血紅蛋白(HbA0 ) 與糖化血紅蛋白(HbAlc)分離來檢測。此外，本實施例中使 用的毛細管在洗滌之后僅如前所述那樣通入運行緩沖液就形成 前述B層，可馬上進行分析。于是，用與前述同樣的試樣實施 IO次相同的分析，評價再現性。該結果示于下述表2。下述表2 中，與前述表l同樣，相對面積(％ )為相對于總峰面積的正常 血紅蛋白(HbA0)和糖化血紅蛋白(HbAlc)的各峰面積的比 率(％ )。如下述表2所示，在正常血紅蛋白(HbA0)和糖化血 紅蛋白(HbAlc)的各個中，變差系數(CV)的值小，由此， 本發明的分析方法可以說再現性優異。 表2
相對面積(0/0)No.HbA1cHbAO
110.0689.94
210.8789.13
39.6890,32
4訓889.92
59.4590.55
610.4889.52
710.8789.13
810.8889.12
99.2090,80
1010.1789.83
平均10,17訓3
變差系數(CV)5.90.7
工業上的可利用性
如以上所示，根據本發明，可通過毛細管電泳法容易且高
26精度實施血紅蛋白等試樣的分析。而且，本發明由于采用毛細 管電泳法，因而還可使分析裝置小型化。本發明可適用于臨床 檢查、生化檢查、醫學研究等對血紅蛋白等試樣分析的所有領 域，其用途沒有限定，可適用于廣泛的領域。
權利要求
1. 一種通過毛細管電泳法分析試樣的方法，其特征在于，該分析方法包括準備用于前述毛細管電泳法的毛細管的工序；和，在前述毛細管中，使試樣與含陰極性基化合物結合而成的復合物進行電泳的工序，前述毛細管為如下的毛細管在前述毛細管內壁層疊有下述A層，在前述A層之上層疊有下述B層，A層夾層，由選自聚二烯丙基二甲基氯化銨、無極性聚合物和含陽極性基化合物所組成的組中的至少一種形成、包含前述聚二烯丙基二甲基氯化銨時，前述聚二烯丙基二甲基氯化銨通過物理吸附被固定于前述毛細管內壁、包含前述無極性聚合物和前述含陽極性基化合物的至少一個時，前述無極性聚合物和前述含陽極性基化合物的至少一個通過共價鍵被固定于前述毛細管內壁；B層陰極性層，由含陰極性基化合物形成。
2. 根據權利要求l所述的分析方法，通過使前述A層與包 含前述含陰極性基化合物的液體接觸，從而形成前述B層。
3. 根據權利要求2所述的分析方法，前述包含含陰極性基 化合物的液體為包含含陰極性基化合物的運行緩沖液。
4. 根據權利要求l所述的分析方法，通過使前述毛細管內 壁與包含聚二烯丙基二甲基氯化銨的液體接觸，從而在前述毛 細管內壁形成聚二烯丙基二曱基氯化銨制的A層。
5. 根據權利要求l所述的分析方法，在前述毛細管中，在 包含含陰極性基化合物的運行緩沖液中添加試樣，接著，在前 述毛細管的兩端施加電壓，使前述試樣與含陰極性基化合物的 復合物進4亍電;永。
6. 根據權利要求l所述的分析方法，前述含陰極性基化合物為含陰極性基的多糖類。
7. 根據權利要求6所述的分析方法，前述含陰極性基的多糖類為選自硫酸化多糖類、羧酸化多糖類、磺酸化多糖類和磷酸化多糖類所組成的組中的至少 一種多糖類。
8. 根據權利要求7所述的分析方法，前述石危酸化多糖類為硫酸軟骨素。
9. 根據權利要求l所述的分析方法，前述無極性聚合物為硅酮聚合物，前述含陽極性基化合物為具有氨基和銨基中至少一個陽極性基的曱硅烷基化劑。
10. 根據權利要求l所述的分析方法，前述試樣為包含血紅蛋白的試樣。
11. 一種毛細管，其特征在于，其為用于權利要求l所述的分析方法的毛細管電泳用的毛細管，其中，在前述毛細管內壁層疊有下述A層，在前述A層之上層疊有下述B層，A層夾層，由選自聚二烯丙基二曱基氯化銨、無極性聚合物和含陽極性基化合物所組成的組中的至少 一種形成、包含前述聚二烯丙基二甲基氯化銨時，前述聚二烯丙基二甲基氯化銨通過物理吸附被固定于前述毛細管內壁、包含前述無極性聚合物和前述含陽極性基化合物的至少一個時，前述無極性聚合物和前述含陽極性基化合物的至少 一 個通過共價鍵被固定于前述毛細管內壁；B層陰極性層，由含陰極性基化合物形成。
12. 根據權利要求ll所述的毛細管，前述含陰極性基化合物為含陰極性基的多糖類。
13. 根據權利要求12所述的毛細管，前述含陰極性基的多糖類為選自硫酸化多糖類、羧酸化多糖類、磺酸化多糖類和磷酸化多糖類所組成的組中的至少 一種多糖類。
14. 根據權利要求13所述的毛細管，前述硫酸化多糖類為硫酸軟骨素。
15. 根據權利要求ll所述的毛細管，前述無極性聚合物為硅酮聚合物，前述含陽極性基化合物為具有氨基和銨基中至少一個陽極性基的甲硅烷基化劑。
16. —種毛細管電泳裝置，其特征在于，該毛細管電泳裝置用于權利要求l所述的分析方法，其中，包括權利要求ll所述的毛細管。
17. 根據權利要求16所述的毛細管電泳裝置，其包括基板、多個液槽和毛細管，在前述基板上形成有前述多個液槽，前述多個液槽通過前述毛細管連通，前述毛細管為權利要求ll所述的毛細管。
18. 根據權利要求17所述的毛細管電泳裝置，前述基板的最大長度為10 ~ 100mm的范圍，前述基板的最大寬度為10 ~60mm的范圍，前述基板的最大厚度為0.3 ~ 5mm的范圍。
全文摘要
本發明提供通過毛細管電泳法進行分析的方法，該方法可使裝置小型化、分析精度高、可容易實施。一種通過毛細管電泳法分析試樣的方法，其特征在于，其包括準備用于前述毛細管電泳法的毛細管的工序；和，在前述毛細管中，使試樣與含陰極性基化合物結合而成的復合物進行電泳的工序。其中，前述毛細管為如下的毛細管在其內壁層疊有下述A層，在前述A層之上層疊有下述B層。A層夾層，其由選自聚二烯丙基二甲基氯化銨、無極性聚合物和含陽極性基化合物所組成的組中的至少一種形成、前述聚二烯丙基二甲基氯化銨通過物理吸附被固定于前述內壁，前述無極性聚合物和前述含陽極性基化合物的至少一個通過共價鍵被固定于前述內壁；B層陰極性層，由含陰極性基化合物形成。
文檔編號G01N27/447GK101501484SQ20078002919
公開日2009年8月5日 申請日期2007年8月29日 優先權日2006年9月4日
發明者中山雄介, 田中喜秀, 米原聰, 脅田慎一 申請人:獨立行政法人產業技術綜合研究所;愛科來株式會社