專利名稱：：一種高效液相色譜－熒光法同時測定血清色氨酸和酪氨酸的方法
技術領域：
：本發明屬于分析化學領域，涉及一種高效液相色譜-熒光法同時測定血清色氨酸和酪氨酸的方法。
背景技術：
：目前國內外報道的檢測Tyr和Trp的方法較多，包括高效液相色譜法(HPLC)、高效毛細管電泳法(HPCE)、質譜法(MS)等。HPCE分析時間較短，分離能力較強，但檢測限(紫外吸收檢測器)不及HPLC，且重復性較差；質譜技術亦有操作復雜、重復性較差的不足之處；相對來說，HPLC應用較廣泛。色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)具有吲哚結構，自身能產生熒光，故可采用熒光法檢測。國內外已有采用HPLC-熒光法(HPLC-FD)或HPLC-紫外法(HPLC-UV)分別單獨檢測血清中Tyr和Trp的報道，有采用HPLC-UV同時測定Tyr和Trp的報道，也有采用高效液相色譜法測定腦脊液中Tyr和Trp含量的報道，但目前尚未有采用HPLC-FD同時測定血清中的Tyr和Trp的報道。近來，Sanchez-Machado等用HPLC-FD同時測定蝦廢料中的Tyr和Trp含量，但是線性范圍窄，雖能滿足蝦廢料中氨基酸的檢測需要，但不能滿足臨床血清樣本的檢測要求。
發明內容本發明的目的是提供一種高效液相色譜_熒光法同時測定血清色氨酸和酪氨酸的方法，本發明分析時間短，試劑消耗少，靈敏度高，特異性好，能滿足臨床血清樣本的檢測要求。本發明可以通過以下技術方案實現。本發明采用的檢測儀器是510色譜泵、2475型熒光檢測器(Waters公司)、HS2000色譜數據工作站(杭州英譜科技開發有限公司)、Rheodyne7725手動進樣器(帶20iiL進樣環)。0.22iim濾膜及其抽濾器(Millipore公司);Milli-Q純水器(Millipore公司)；TGLL218臺式高速冷凍離心機(湖南湘儀離心機廠)；SB2200型超聲去氣儀(上海必信能有限公司)。本發明的主要試劑有Tyr、Trp、5_羥色胺(5_HT)、犬尿喹啉酸(Kyna)、苯丙氨酸(Phe)、犬尿氨酸(Kyn)和肌酐(Cr)均購自Sigma公司；乙腈、甲醇均為色譜純，購自美國Tedia公司；醋酸鋅、冰醋酸等均為國產分析純，高氯酸為國產優級純。本發明采用的檢測條件是其中色譜柱MegresC18柱(250mmX4.6mmi.d.，5ym，江蘇漢邦科技有限公司);流動相10%(v/v)乙腈；流速1.2mL/min;熒光檢測波長0-5min激發光波長228nm，發射光波長為306nm;5min后激發光波長285nm，發射光波長為353nm;進樣量20y1;室溫下測定。本發明的檢測原理色氨酸和酪氨酸可以產生自然熒光，利用熒光檢測器可調波長的性質選擇色氨酸和酪酸的最佳檢測波長，在最佳色譜條件下使色氨酸和酪氨酸分離，色譜分離后的兩種氨基酸經過熒光檢測器和色譜數據工作站的檢測和處理，作出色譜圖，然后根據色譜圖完成氨基酸的含量分析和測定。本發明包括以下步驟a、采用MegresC18柱250mmX4.6mmi.d.，5um色譜柱；b、流動相的組成:10%(V/V)乙腈;c、流速為1.2ml/min，進樣量20iU，室溫下測定;d、利用熒光檢測器掃描確定色氨酸和酪氨酸的最大激發光波長和發射光波長，進而使得兩種物質均在其最佳波長下得到檢測。可調波長設定為0-5min激發光波長228nm，發射光波長為306nm;5min后激發光波長285nm，發射光波長為353nm;e、對建立方法進行方法學評價混合標準品和血清樣品的檢測、標準曲線和檢測限、精密度的評價、回收率的考察和干擾試驗。與現有技術相比，本發明具有的優點和效果如下1、本發明首次成功建立了一種HPLC-FD同時測定人血清中Tyr和Trp的方法。Tyr和Trp具有自然熒光，本發明利用熒光檢測器自動轉換激發光與發射光波長的優勢，選擇Trp和Tyr的最佳波長，使Trp和Tyr的色譜峰峰面積最大，檢測靈敏度增加；與已報道方法比較，本發明分析時間短，試劑消耗少，靈敏度高，特異性好，能滿足臨床血清樣本的檢測要求。2、本發明原理簡單、操作簡便、快速(9min可完成檢測)、可行性高。3、本發明靈敏度高、特異性好、能滿足血清標本酪氨酸和色氨酸含量測定要求，適合于臨床和科研應用。方法學評價顯示，在一定范圍內，兩種物質的標準曲線的線性關系良好(rX).990)，線性范圍寬；在該方法下兩種物質的檢測限低。色氨酸為回收率為88.8%-97.2%，酪氨酸回收率為90.5%-108.8%，色氨酸和酪氨酸的日內和日間精密度均小于5%，苯丙氨酸(Phe)、犬尿氨酸(Kyn)、犬尿喹啉酸(Kyna)、5_羥色胺(5-HT)和肌酐(Cr)對測定無干擾。圖1為混合標準品的色譜圖；峰序號Trp-色氨酸，Tyr-酪氨酸；圖2為本發明測定的血清樣本的色譜圖；峰序號Trp-色氨酸，Tyr-酪氨酸。具體實施例方式以下實施例旨在進一步說明本發明，而非限制本發明。實施例l，試劑的配制和血清樣本的收集處理1.標準溶液的配制準確稱取TrplO.Omg、TyrlO.Omg用2.5%(v/v)的高氯酸溶液溶解并稀釋至10.OmL，混勻，分別制成4900ymol/LTrp標準儲備液和5500ymol/LTyr標準儲備液，分裝后置于-3(TC冰箱中備用。使用前分別取2種標準儲備液加2.5%的高氯酸配成標準工作液(含Trp24.5umol/L，Tyr55umol/L)。2.蛋白質沉淀劑用超純水配制5%(v/v)的高氯酸溶液作血清蛋白質沉淀劑。3.流動相的配制用超純水配制10%(v/v)的乙腈溶液，再用0.22m微孔濾膜過濾，使用前超聲脫氣20min。4.干擾試驗用樣本溶液用2.5%(v/v)的高氯酸溶液分別配制一定濃度Phe(610ymol/L)、5-HT(114iimol/L)、Kyn(1.96iimol/L)、Kyna(26.17nmol/L)禾PCr(88.14iimol/L)的標準液。5.血清樣本的收集處理將受試者空腹靜脈血2mL置于潔凈促凝管內，3000g離心分離血清，取100y1血清于Eppendorf管內，加入等體積5%(v/v)高氯酸溶液，加蓋后于旋渦混勻器上混勻，室溫下放置10min以充分沉淀血清中的蛋白質，10000g離心10min(4°C)后將上清液轉入另一Enpendorf管內，相同條件下再離心lOmin，取上清液20yL進樣分析。實施例2，色譜條件的優化1.檢測波長的選擇用流動相稀釋一定濃度的Tyr和Trp標準溶液，以流動相空白調零，在2475型熒光檢測器上，通過對Tyr和Trp的激發光譜和發射光譜掃描，分別得到最大激發光波長入exTyr=228nm、入exTrp=285nm;最大發身寸光波長入emTyr=306nm、入emTrp=353nm。2.流動相中有機物的比例對保留時間的影響配制不同乙腈含量(5%、8%、10%、12%)的流動相，以標準液作為樣本進行分析。隨著乙腈含量的增加，Tyr和Trp的峰保留時間相應縮短，且Tyr和Trp峰面積響應值也相應的增大；當乙腈含量為5%、8%時，單個樣本的分析時間太長；但當乙腈含量為12%時，血清樣本Tyr峰與前面的雜峰相融合，影響定量的準確性。綜合考慮以上因素，本研究采用乙睛含量為10%的流動相。3.流速對分離效果的影響分別選用流速O.8、1.0、1.2、1.5mL/min進行實驗。當流速為1.5mL/min時，Tyr和Trp的保留時間雖縮短，但峰面積響應值相應的減小，色譜系統的后壓加大；流速為0.8、1.OmL/min時，分析時間太長，色譜峰變寬。為了使柱效達到最高，使Tyr和Trp兩峰達到完全分離，本研究采用流速為1.2mL/min。實施例3，標準品及血清樣本的檢測1.標準品和血清樣本的色譜分離圖混合標準品(含Trp24.5iimol/L，Tyr55iimol/L)、混合血清樣本去蛋白上清液20iiL進樣測定。檢測條件是其中色譜柱MegresC18柱(250mmX4.6mmi.d.，5ym);流動相10%(v/v)乙腈；流速1.2mL/min;熒光檢測波長0-5min激發光波長228nm，發射光波長為306nm;5min后激發光波長285nm，發射光波長為353nm;進樣量20y1;室溫下測定。圖1、圖2分別是混合標準品和正常人血清樣本的色譜分離圖。Tyr和Trp保留時間分別為3.4min、7.6min左右，峰型穩定，基線平穩，無雜質干擾峰，二者分離效果良好，9min內即可完成測定。2.Tyr、Trp定性定量分析Tyr和Trp均采用峰保留值比較法和疊加法進行定性分析，即比對混合標準液和血清樣品在相同條件下的色譜峰和相對保留時間；在血清樣品中分別加入適量的各種標準物質，比較相同色譜條件下不加標準品及加標準品的色譜圖。試驗結果表明，在血清樣品中加入標準品前后，Tyr和Trp的出峰位置是一致的。用外標法測定峰面積進行定量分析。即在相同色譜條件下測定混合標準品和血清樣品，把混合標準品中Tyr和Trp的色譜峰面積和血清樣品中Tyr和Trp色譜峰面積進行比較求得血清樣品中三種物質的含量。用公式表示為丁xC"2血清Tyr(Trp)濃度=^;注Au=血清中Tyr(Trp)峰面積；As=混合標準液中Tyr(Trp)峰面積；Cs=混合標準液中Tyr(Trp)濃度。3.標準曲線和檢測限取Tyr和Trp標準儲存液，用2.5%的高氯酸溶液配制一系列濃度的標準混合液，每個樣本進樣3次，取其平均值用最小二乘法進行相關與回歸分析。二者回歸分析結果見表l。其中，Y代表峰面積(yVXs)，X代表被分析物的進樣濃度(ymol/L)。以流動相為空白，按信噪比為3求出檢測限。二者的峰面積與進樣濃度線性關系良好，線性范圍寬，最低檢測限低，靈敏度高。表1Tyr和Trp的回歸分析結果及最低檢測限項目HI線性范圍(|imol/L")謂艮Y=121937X+4619S0.99920.275-275O細T。Y=130731X+45149O養，0.0054.精密度的考察上述的色譜條件下，取混合血清進行日間和日內測定精密度的試驗，結果見表2。Tyr和Trp日內(20次)和日間(20d)測定值的標準偏差(RSD)均低于5%，可以滿足常規血清樣本分析要求。表2Tyr和Trp的日間和日內測定的精密度測娜質日內測定值(jimol/L)日間測定值5S.0S±0.991.7157.91±1.S33.16Tip44.93±1.513.3743.95±2.074.705.回收率的考察取混合血清樣品1.6mL平均分為4組，第1組加入0.lmL超純水作為基礎樣品，第2、3、4組分別加入高、中、低3種濃度的混合標準液0.lmL;按照上述方法對樣品進行處理和分析測定，每組平行測定3次，取其平均值計算回收率。結果見表3。表3Tyr和Trp的回收率<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>6.干擾實驗為探討人體內一些物質是否干擾Tyr、Trp的測定，取Phe、Kyna、Kyn、5_HT、Cr干擾試驗用樣本溶液，先分別進樣分析，再混合制成混合樣本進樣分析。結果表明以上幾種物質均對本法無干擾。表4干擾試驗檢測結果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注-代表未檢測出。權利要求一種高效液相色譜-熒光法同時測定血清色氨酸和酪氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟a、采用MegresC18柱250mm×4.6mmi.d.，5μm色譜柱；b、流動相10％(v/v)乙腈；c、流速為1.2ml/min，進樣量20μl，室溫下測定；d、熒光檢測波長設定為0-5min激發光波長228nm，發射光波長為306nm，5min后激發光波長285nm，發射光波長為353nm。全文摘要本發明涉及一種高效液相色譜-熒光法同時測定血清色氨酸和酪氨酸的方法，本方法包括以下步驟采用MegresC18柱250mm×4.6mmi.d.，5μm色譜柱；10％(v/v)乙腈作為色譜流動相；流速為1.2ml/min；熒光檢測波長0-5min激發光波長228nm，發射光波長為306nm；5min后激發光波長285nm，發射光波長為353nm；進樣量20μl；室溫下測定。本發明方法簡單快速、準確、靈敏度高、可行性高，能滿足臨床血清樣本的檢測要求。文檔編號G01N21/64GK101750459SQ20101030044公開日2010年6月23日申請日期2010年1月19日優先權日2010年1月19日發明者任亞萍,周前選,唐愛國,項忠元申請人:中南大學湘雅二醫院