一種抗體標記信號放大方法

專利名稱：：一種抗體標記信號放大方法
技術領域：
：本發明涉及一種抗體標記信號放大方法，屬于免疫分析
技術領域：
。
背景技術：
：免疫標記技術是將一些既易測定又具有高度敏感性的物質標記到特異性抗原或抗體分子上，通過這些標記物的增強放大效應來顯示反應系統中抗原或抗體的性質與含量。常用的標記物包括熒光素、酶和放射性核素等，用這3種標記物進行標記的免疫檢測技術被稱為3大免疫標記技術。凡無毒性又能呈現有色化學反應的酶，原則上均可作為標記用，但作為標記抗體用的酶應滿足下列要求(1)來源方便，易于純化；(2)比活性高，性質穩定；(3)酶活性和量能用簡單方法測定。由于辣根過氧化物酶(HorseradishPeroxidase,HRP)比活性高，穩定，分子量小，純酶容易制備，所以最常用。目前應用HRP標記抗體技術的檢測方法檢測下限可達l(T"mol/L，但仍無法滿足檢測要求。
發明內容本發明所要解決的技術問題是:提供一種實現可使檢測下限達到10—18moI/L以下的辣根過氧化物酶標記抗體信號放大方法。本發明的技術方案是(1)、稱取低熔點瓊脂糖0.1g，溶于10ml純化水，455(TC水浴溶解后，加入新配0.1MNalO4510ml，5060。C水浴反應45120分鐘后，加入915ml無水乙醇，沉淀析出后，800012000rpm離心520分鐘，去除上清溶液后加入10ml純化水清洗沉淀，重復操作2次，清洗結束后，加入50ml純化水455(TC水浴溶解沉淀，制成溶液A;(2)、量取待標記抗體5mg，用NaOH調pH至8.69.6，加入100500ul溶液A，攪拌均勻后，37'C反應3060分鐘，制成溶液B;(3)、稱取5mg辣根過氧化物酶溶解于lml蒸餾水中，完全溶解后，加入100200ul新配的0.1MNalO4溶液，3037。C避光反應1030分鐘后，加入現配的10%乙二醇1020ul,3037。C避光反應815分鐘后，制成溶液C;(4)、將溶液B與溶液C按體積比1:11:3混合，3037。C避光反應2545分鐘后，加入等體積的醛基封閉液3037'C反應15-30分鐘，然后將混合后溶液裝入透析袋中，用lmMPH8.0的磷酸緩沖液避光透析1224小時，透析結束后將混合后溶液從透析袋中取出。有益效果:本發明的抗體標記信號放大方法，先通過用Nal04將瓊脂糖的羥基氧化成醛基，利用瓊脂糖氧化后含多位點醛基的特點，在堿性條件下將待標記抗體交聯起來，然后再將交聯抗體進行HRP標記，起到了信號放大作用，在同樣抗原濃度條件下，獲得5-10倍的信號放大。本發明提供的信號放大方法，可通過用低熔點瓊脂糖經氧化后交聯標記抗體達到信號放大效果，可將檢測下限提高到10"8mol/L以下。具體實施例方式下面結合實施例進一步說明本發明的具體實施方式。實施例l(1)、稱取低熔點瓊脂糖0.1g，溶于10ml純化水，45。C水浴溶解后，加入新配0.1MNalO45ml，50。C水浴反應45分鐘后，加入9ml無水乙醇，沉淀析出后，8000rpm離心5分鐘，去除上清溶液后加入10ml純化水清洗沉淀，重復操作2次，清洗結束后，加入50ml純化水45'C水浴溶解沉淀，制成溶液A;(2)、量取待標記抗體5mg，用NaOH調pH至8.6，加入100ul溶液A,攪拌均勻后，37'C反應30分鐘，制成溶液B;(3)、稱取5mg辣根過氧化物酶溶解于lml蒸餾水中，完全溶解后，加入100ul現配的0.1MNal04溶液，3(TC避光反應10分鐘后，加入新配10%乙二醇10ul，3(TC避光反應8分鐘后，制成溶液C;(4)、將溶液B與溶液C按體積比1:l混合，3(TC避光反應25分鐘后，加入等體積的醛基封閉液3(TC反應15分鐘，然后將混合后溶液裝入透析袋中，用lmMPH8.0的磷酸緩沖液避光透析12小時，透析結束后將混合后溶液從透析袋中取出。實施例2(1)、稱取低熔點瓊脂糖0.1g，溶于10ml純化7K，45'C水浴溶解后，加入新配0.1MNalO46ml,5(TC水浴反應65分鐘后，加入10ml無水乙醇，沉淀析出后，9000ipm離心8分鐘，去除上清溶液后加入10ml純化水清洗沉淀，重復操作2次，清洗結束后，加入50ml純化水45'C水浴溶解沉淀，制成溶液A;(2)、量取待標記抗體5mg，用NaOH調pH至8.8，加入180ul溶液A,攪拌均勻后，37X:反應34分鐘，制成溶液B;(3)、稱取5mg辣根過氧化物酶溶解于lml蒸餾水中，完全溶解后，加入128ul現配的0.1MNal04溶液，32。C避光反應14分鐘后，加入新配10%乙二醇12ul，32'C避光反應IO分鐘后，制成溶液C;(4)、將溶液B與溶液C按體積比1:l混合，32'C避光反應31分鐘后，加入等體積的醛基封閉液32'C反應18分鐘，然后將混合后溶液裝入透析袋中，用lmMPH8.0的磷酸緩沖液避光透析15小時，透析結束后將混合后溶液從透析袋中取出。實施例3(1)、稱取低熔點瓊脂糖O.lg，溶于10ml純化水，48'C水浴溶解后，加入新配O,IMNaI047ml，54。C水浴反應82分鐘后，加入llml無水乙醇，沉淀析出后，9800rpm離心12分鐘，去除上清溶液后加入10ml純化水清洗沉淀，重復操作2次，清洗結束后，加入50ml純化水48'C水浴溶解沉淀，制成溶液A;(2)、量取待標記抗體5mg，用NaOH調pH至9.0，加入280ul溶液A，攪拌均勻后，37'C反應40分鐘，制成溶液B;(3)、稱取5mg辣根過氧化物酶溶解于lml蒸餾水中，完全溶解后，加入144ul現配的0.1MNal04溶液，34。C避光反應18分鐘后，加入新配10%乙二醇14ul，34'C避光反應IO分鐘后，制成溶液C;(4)、將溶液B與溶液C按體積比1:2混合，34。C避光反應35分鐘后，加入等體積的醛基封閉液3fC反應20分鐘，然后將混合后溶液裝入透析袋中，用lmMPH8.0的磷酸緩沖液避光透析18小時，透析結束后將混合后溶液從透析袋中取出。實施例4(1)、稱取低熔點瓊脂糖0.1g，溶于10ml純化水，48'C水浴溶解后，加入新配0.1MNalO48ml，54。C水浴反應90分鐘后，加入12ml無水乙醇，沉淀析出后，10800rpm離心16分鐘，去除上清溶液后加入10ml純化水清洗沉淀，重復操作2次，清洗結束后，加入50ml純化水48'C水浴溶解沉淀，制成溶液A;(2)、量取待標記抗體5mg，用NaOH調pH至9.2，加入320ul溶液A，攪拌均勻后，37'C反應44分鐘，制成溶液B;(3)、稱取5mg辣根過氧化物酶溶解于lml蒸餾水中，完全溶解后，加入168ul新配的0.1MNal04溶液，37。C避光反應22分鐘后，加入新配10%乙二醇16ul，37i:避光反應12分鐘后，制成溶液C;(4)、將溶液B與溶液C按體積比1:2混合，37。C避光反應38分鐘后，加入等體積的醛基封閉液37'C反應23分鐘，然后將混合后溶液裝入透析袋中，用lmMPH8.0的磷酸緩沖液避光透析20小時，透析結束后將混合后溶液從透析袋中取出。實施例5(1)、稱取低熔點瓊脂糖0.1g，溶于10ml純化水，50。C水浴溶解后，加入新配0.1MNalO49ml60。C水浴反應106分鐘后，加入14ml無水乙醇，沉淀析出后，11200rpm離心18分鐘，去除上清溶液后加入10ml純化水清洗沉淀，重復操作2次，清洗結束后，加入50ml純化水5(TC水浴溶解沉淀，制成溶液A;(2)、量取待標記抗體5mg，用NaOH調pH至9.4，加入440ul溶液A，攪拌均勻后，37"C反應52分鐘，制成溶液B;(3)、稱取5mg辣根過氧化物酶溶解于lml蒸餾水中，完全溶解后，加入188ul現配的0.1MNal04溶液，37。C避光反應26分鐘后，加入新配10%乙二醇18ul，37'C避光反應15分鐘后，制成溶液C;(4)、將溶液B與溶液C按體積比1:3混合，37'C避光反應42分鐘后，加入等體積的醛基封閉液37'C反應26分鐘，然后將混合后溶液裝入透析袋中，用lmMPH8.0的磷酸緩沖液避光透析22小時，透析結束后將混合后溶液從透析袋中取出。實施例6(1)、稱取低熔點瓊脂糖0.1g，溶于10ml純化水，5(TC水浴溶解后，加入新配0.1MNa10410ml60。C水浴反應120分鐘后，加入15ml無水乙醇，沉淀析出后，12000rpm離心20分鐘，去除上清溶液后加入10ml純化水清洗沉淀，重復操作2次，清洗結束后，加入50ml純化水5(TC水浴溶解沉淀，制成溶液A;(2)、量取待標記抗體5mg，用NaOH調pH至9.6，加入500ul溶液A，攪拌均勻后，37。C反應60分鐘，制成溶液B;(3)、稱取5mg辣根過氧化物酶溶解于lml蒸餾水中，完全溶解后，加入200ul現配的0.1MNaICX溶液，37。C避光反應30分鐘后，加入新配10%乙二醇20ul，37'C避光反應15分鐘后，制成溶液C;(4)、將溶液B與溶液C按體積比1:3混合，37'C避光反應45分鐘后，加入等體積的醛基封閉液37'C反應30分鐘，然后將混合后溶液裝入透析袋中，用lmMPH8.0的磷酸緩沖液避光透析24小時，透析結束后將混合后溶液從透析袋中取出。表1是本發明實施例1-6和常規標記方法的測試部分結果表l中用于測試的原料分別為固定蛋白AFP(Alpha-Fetoprotein)抗體(河南博賽生物生產)；標記抗體AFP第二抗體(河南博賽生物生產)；HorseradishPeroxidase(HRP):pierce公司生產；所用的一般化學試劑均為分析純級別；反應洗液0.lmol/1Tris-Hcl(上海美季生物生產)；發光底物SuperSignalELISAFemtoMaximumSensitivitySubstrate(美國pierce生產)；離心干燥器為我公司自行設計自行生產。測試時用美國biodot公司的噴點點樣機器人將固定蛋白點于玻片表面后，用實施例中標記的抗體和常規標記方法分別與芯片反應讀取信號，進行分析。實施例<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權利要求1、一種抗體標記信號放大方法，其特征在于，包括如下步驟(1)、稱取低熔點瓊脂糖0.1g，溶于10mminl.gif純化水，45～50℃水浴溶解后，加入新配0.1MNaIO45～10mminl.gif，50～60℃水浴反應45～120分鐘后，加入9～15mminl.gif無水乙醇，沉淀析出后，8000～12000rpm離心5～20分鐘，去除上清溶液后加入10mminl.gif純化水清洗沉淀，重復操作2次，清洗結束后，加入50mminl.gif純化水45～50℃水浴溶解沉淀，制成溶液A；(2)、量取待標記抗體5mg，用NaOH調pH至8.6～9.6，加入100～500uminl.gif溶液A，攪拌均勻后，37℃反應30～60分鐘，制成溶液B；(3)、稱取5mg辣根過氧化物酶溶解于1mminl.gif蒸餾水中，完全溶解后，加入100～200uminl.gif新配的0.1MNaIO4溶液，30～37℃避光反應10～30分鐘后，加入新配10％乙二醇10～20uminl.gif，30～37℃避光反應8～15分鐘后，制成溶液C；(4)、將溶液B與溶液C按體積比1∶1～1∶3混合，30～37℃避光反應25～45分鐘后，加入等體積的醛基封閉液30～37℃反應15-30分鐘，然后將混合后溶液裝入透析袋中，用1mMPH8.0的磷酸緩沖液避光透析12～24小時，透析結束后將混合后溶液從透析袋中取出。全文摘要本發明公開了一種抗體標記信號放大方法，技術方案是(1)稱取低熔點瓊脂糖0.1g，溶于純化水，水浴溶解后，加入新配0.1MNaIO₄水浴反應45～120分鐘后，加入9～15ml無水乙醇，沉淀析出后，離心5～20分鐘，去上清后加入純化水清洗沉淀，重復操作2次，清洗結束后，加入純化水水浴溶解沉淀，制成溶液A；(2)量取待標記抗體，用NaOH調pH至8.6～9.6，加入100～500ul溶液A，攪拌均勻后，37℃反應30～60分鐘，制成溶液B；(3)稱取HorseradishPeroxidase(HRP)溶解于蒸餾水中，溶解后，加入1新配的0.1MNaIO₄溶液，避光反應10～30分鐘后，加入新配乙二醇避光反應8～15分鐘后，制成溶液C；(4)將溶液B與溶液C按體積比1∶1～1∶3混合，避光反應25～45分鐘后，加入等體積的醛基封閉液反應15-30分鐘，然后將所有溶液裝入透析袋中，用1mMpH8.0的磷酸緩沖液避光透析12～24小時，透析結束后將標記抗體從透析袋中取出。可將檢測下限提高到10^-18mol/L以下。文檔編號G01N33/58GK101441221SQ20081024347公開日2009年5月27日申請日期2008年12月19日優先權日2008年12月19日發明者吳堂明,潘能科,陸冬雷申請人:江蘇三聯生物工程有限公司