專利名稱：利用scar標記鑒定甘蔗抗褐銹病性方法
技術領域：
本發明涉及一種利用分子標記技術鑒定植物抗病性方法，具體涉及利用SCAR標記鑒定甘蔗抗褐銹病性方法，屬于生物技術領域。
背景技術：
免HSaccharum oiTiciaa/ )是禾本科甘鹿屬植物,原產于熱帶、亞熱帶地區， 具有高光效、光飽和點高、二氧化碳補償點低、光呼吸率低和光合強度大的優點。甘蔗是我國最主要的糖料作物和生物量最高的綠色能源作物，其生產不僅關系我國食糖安全，還能為能源酒精的發展提供充足的原料。由黑頂柄銹菌O0WCCiflia引起的甘鹿褐銹病是我國甘鹿生產中最重要的真菌性病害之一，在國外爪哇、古巴、澳大利亞、美國、墨西哥、印度、泰國和毛里求斯等國家普遍發生并多次爆發流行。該病主要由夏孢子傳播，借風力附著在蔗葉表面，經氣孔侵入。甘蔗褐銹病主要發生在葉片上。初次侵染源主要來自甘蔗本身和其他中間寄主。 受褐銹病菌侵染后，侵染初期甘蔗葉片上長出黃色小斑點，色澤呈褐色至橙褐色，周圍有黃色暈環，侵染后期病斑因夏孢子堆呈膿皰狀，最后病斑變黑色，葉組織壞死，使甘蔗葉片失去光合能力，表現早衰，而此時甘蔗正處于大生長期中后期至糖分積累期，因此，不僅造成蔗莖產量損失，還對蔗糖分積累造成嚴重影響，一般減產10-25 %，重的可高達40 %，蔗糖分降低 10-36 %。由于甘蔗褐銹病一般在9月中下旬開始發生，此時甘蔗植株高大，冠層大，化學防治是不可能進行的，成本高，防治效果差。加強田間管理如剝除老葉增加通風等雖然有一定的作用，但是，必然會大幅度增加勞動力成本，蔗農所挽回的損失與人工付出無經濟效益可言，因此，甘蔗生產上根本不可能采用。至于收獲后殘余的蔗葉，目前為了省工節本，一般留在田間，更增加了病害初侵染源。上述原因導致我國蔗區病害脅迫壓力日趨加大，只有培育抗病品種，提高品種對褐銹病的抗性，才能實現對該病害的有效控制，這也是最經濟的甘蔗褐銹病控制策略，而抗病性鑒定的效率和準確性直接影響抗褐銹病育種的進程和效果。目前，國內外都是采用待鑒定甘蔗材料與感褐銹病甘蔗品種隔行種植，利用自然誘發感病品種發病，為待鑒定抗性的甘蔗基因型提供接種源一夏孢子，而后在整個生長季中，調查不同葉片上病原夏孢子堆所占葉片面積的比例來確定抗性的等級。該方法主要存在的問題一是耗時長，每個作物季長達I年，且至少需要2個作物季的鑒定結果進行綜合判斷；二是工作量大、占地面積大、管理和調查成本高，難以對大規模的樣品進行鑒定，這與甘蔗雜交育種是以分離世代(即實生苗)大群體為選擇基礎的甘蔗雜交育種相矛盾。就目前而言，我國年定植100萬實生苗，顯然，目前的褐銹病抗性鑒定技術只能在經過多年產量、品質等性狀鑒定選擇后的不多育種材料上進行，也即只能對十來個，最多幾十個育種材料，才能實施對褐銹病抗性的鑒定，因此，必然失去了很多可供選擇的機會；三是在病原、甘蔗基因型和環境三個因素互作的系統中，只有三個因素都具備，病害才能發生，也就是說， 即便田間有病原、甘蔗基因型也是感病的，要發生病害，還需要合適的環境條件，三者缺一不可，因此，田間基于誘發的抗病性鑒定方法，鑒定結果難以預料。不同地點、不同年份間的鑒定結果有較大的差異，鑒定結果準確性不夠。因此，研究并開發更高效、準確性更高且不受環境影響的抗褐銹病性鑒定方法，是甘蔗抗褐銹病育種最關鍵的技術。
發明內容
本發明的目的是提供一種利用SCAR標記鑒定甘蔗抗褐銹病性的方法。本發明利用SCAR標記鑒定甘蔗抗褐銹病性的方法，包括基因組DNA的提取、 SCAR-PCR標記的檢測體系建立和SCAR-PCR產物的檢測，其特征在于
1、SCAR-PCR標記的檢測使用的檢測引物是甘蔗SCAR-A和SCAR-B，其中，SCAR-A 是 5’-ACTCGGTGTCCTAGTTGTGT-3' ， SCAR-B 是 5’-GGACTCGGTATAGGACATCA-3’ ；
2、SCAR-PCR標記的檢測建立SCAR-PCR擴增體系為總體積25μ I，內含2. 5 μ I 10XPCR 緩沖液，2. 5 μ I 25 mmol/L MgCl2,0. 5 μ I 10 mmol/L dNTP, 10 mmol/L 的檢測引物 SCAR-A 和 SCAR-B 各 1.0 μ I, I. 25 U Taq DNA Polymerase, 20-50 ng 基因組 DNA， ddH20 補足到 25 μ I ;SCAR-PCR 擴增程序如下94 °C 4 min ；94 °C I min, 56 °C I min, 72 0C 2 min，30個循環；72 °C 10 min ;所述 10XPCR緩沖液組成成分為 100 mmol/L pH8. 5 Tris-HCl，500 mmol/L KCl 和 15 mmol/L MgCl2 ；
3、SCAR-PCR產物的檢測電泳檢測的SCAR-PCR擴增圖譜中，在分子量為680bp的位置出現DNA條帶,為甘鹿抗褐銹病的標志。本發明具有以下優點
本發明的利用SCAR標記鑒定甘蔗抗褐銹病性的方法，具有靈敏度高，所需要的DNA用量少的特點；與常規的抗性鑒定相比，具有操作簡便、檢測時間短、準確性高、容易判斷、重復性好和不受環境條件影響等優點。I、操作簡便該檢測方法得到的顯性標記可顯著減少甘蔗抗褐銹病性鑒定的工作量，檢測時只需要SCAR-PCR擴增和產物檢測即可快速鑒定甘蔗抗褐銹病性；而常規的抗性鑒定則需要大量的人力和物力開展田間種植和數據收集處理，當品種多時鑒定工作難以進行。2、檢測時間短該檢測方法所需時間為1-2天，而常規的抗性鑒定試驗所需時間為2年以上。3、準確性高、容易判斷、重復性好，而且不受環境因素的影響該檢測方法以基因組DNA為材料，DNA是穩定的遺傳物質，不受環境因素等的影響，同時它的680 bp條帶的顯性判斷一目了然，減少了環境條件的影響和人為判斷的偏差，大大提高了準確性；而常規的抗性鑒定試驗中，受田間抗性鑒定數據收集時間和種植環境以及人工判讀的影響，給準確判斷造成困難。本發明為甘蔗種質資源的評價和新品種的審定工作，提供了更為簡便有效的抗褐銹病性鑒定體系，對加強我國抗褐銹病甘蔗育種和抗褐銹病甘蔗種質資源的保護工作具有
重要意義。
圖I為使用甘蔗SCAR-A和SCAR-B檢測引物鑒定8個甘蔗品種抗褐銹病性的SCAR-PCR擴增圖譜。其中各泳道中，M代表分子量標準；C代表空白對照；R代表經本發明鑒定為抗褐銹病的對應甘蔗品種，經田間抗性鑒定證實為抗褐銹病；S代表經本發明鑒定為感褐銹病的對應甘蔗品種，經田間抗性鑒定證實為感褐銹病；1_8代表8個甘蔗品種，具體為 l,CP72-356 ;2，MT70_611 ;3，R0C5 ；4,ROClO ;5，MX703 ;6，MT79_83 ;7，GT11 ;8，YT93_159。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明做進一步的闡述。實施例I 一種利用SCAR標記鑒定甘蔗抗褐銹病性的方法一種利用SCAR標記鑒定甘蔗抗褐銹病性的方法，包括以下步驟
I、基因組DNA的提取
(1)取5克待檢測甘蔗植株的嫩葉，置研缽，加入液氮磨粹成粉末，并在解凍前轉入50 ml的離心管中；
(2)加入15ml,65 °C預熱的SDS提取液，混勻后在65 1水浴保溫40 min ；
(3)加8 ml 3 mo I/L KAC 混勻后，冰浴 30 min ；
(4)25000 g，4 °C離心，20 min ;收集上清液，并加入12 ml于4 1預冷的異丙醇；
(5)-20°C放置30 min后，鉤出漂浮在液面的DNA，置于一干凈的I. 5 ml離心管中，晾干后加入750 μ I TE溶液；加等體積的平衡飽和酚，搖勻，12000 g，4 °C離心，10 min ；
(6)轉移上清至另一干凈的I.5 ml離心管中，加等體積的氯仿，12000 g，4 °C，離心10 min后移出上層水相；
(7)在水相中加2倍體積的無水乙醇，12000g，4 °C離心10 min，留沉淀，用體積濃度為70 %的乙醇清洗2次，并晾干；
(8)加滅菌后的TE溶液200μ I溶解后，置-20 °C冰箱中保存備用。2、SCAR-PCR標記的檢測建立
SCAR-PCR擴增體系為總體積25 μ 1，內含2. 5 μ I 10XPCR緩沖液，2. 5 μ I 25 mmol/ L MgCl2,0. 5 μ I 10 mmol/L dNTP, 10 mmol/L 的檢測引物 SCAR-A 和 SCAR-B 各 I. 0 μ I,
I.25 U Taq DNA Polymerase, 20-50 ng 基因組 DNA，ddH20 補足到 25 μ I。
SCAR-PCR擴增程序如下94 °C 4 min ；94 °C I min, 56 °C I min, 72 °C 2 min, 30 個循環；72 0C 10 min。所述專用檢測弓I物SCAR-A和SCAR-B，是采用RAPD-PCR技術，經過大量的篩選試驗，獲得了抗褐銹病甘蔗的特異DNA片段，以此片段的DNA序列為基礎，設計甘蔗抗褐銹病性鑒定的檢測引物。所述檢測引物SCAR-A和SCAR-B的具體內容為
SCAR-A :5’-ACTCGGTGTCCTAGTTGTGT-3'，
SCAR-B :5，-GGACTCGGTATAGGACATCA-3，。3、SCAR-PCR擴增產物的檢測
具體的檢測方法為，取SCAR-PCR擴增產物10 μ ，加5 μ I含有溴酚藍的上樣緩沖液， 混勻后點樣于含有0. 5 μ g/ml溴化乙錠的I. 5 %瓊脂糖凝膠上，于0. 5 X TBE緩沖液中，10 V/cm恒定電壓下電泳1.5 h，結束后在凝膠成像系統上成像并進行凝膠分析。SCAR-PCR產物的檢測結果采用檢測弓丨物SCAR-A和SCAR-B對甘蔗進行SCAR-PCR 擴增，結果如圖I所示，只有抗褐銹病甘蔗出現分子量為680 bp的DNA條帶，而感褐銹病甘鹿不出現680 bp的DNA條帶。我們取8個待檢測抗褐銹病性的甘蔗品種用SCAR標記方法鑒定和田間抗性鑒定的結果進行比較，結果是一致的。如圖I所示，出現分子量為680 bp的DNA條帶的甘蔗品種，經田間抗性鑒定均為抗褐銹病品種；未出現分子量為680 bp的DNA條帶的甘蔗品種，經田間抗性鑒定均為感褐銹病品種。本發明采用的主要試劑如下(所有化學試劑均為分析純)
1、SDS提取液NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na2HPO4 I. 44 g、KH2 PO4 0. 24 g、SDS 2 g、甘油 50 ml,滅菌去離子I L, pH值7· 4 ;
2、TE溶液10 mmol/L Tris-HCl, I mmol/L EDTA ；
3、上樣緩沖液0.I %溴酚藍，40 %蔗糖；
4、0.5 X TBE 緩沖液44. 5 mmol/L Tris, 50 mmol/L HBO3,1 mmol/L EDTA ；
5、PCR擴增試劑購自大連寶生物公司。本發明所使用的儀器主要如下
1、PCR擴增儀德國Eppendorf5331 PCR擴增儀；
2、電泳儀北京六一儀器廠DYCZ-20ADNA序列分析電泳儀；
3、離心機德國Eppendorf5810/5810R多功能臺式離心機；
4、凝膠成像系統美國BIO-RADGel Doc 2000凝膠成像系統。以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋范圍。
權利要求
1 一種利用SCAR標記鑒定甘蔗抗褐銹病性的方法，包括基因組DNA的提取、SCAR-PCR 標記的檢測體系建立和SCAR-PCR產物的檢測，其特征在于Cl) SCAR-PCR標記的檢測使用的檢測引物是甘蔗SCAR-A和SCAR-B，其中，SCAR-A 是 5’-ACTCGGTGTCCTAGTTGTGT-3'，SCAR-B 是 5’-GGACTCGGTATAGGACATCA-3’ ；(2)SCAR-PCR標記的檢測建立SCAR-PCR擴增體系為總體積25 μ I，內含2. 5 μ I 10XPCR 緩沖液，2. 5 μ I 25 mmol/L MgCl2,0. 5 μ I 10 mmol/L dNTP, 10 mmol/L 的檢測引物 SCAR-A 和 SCAR-B 各 1.0 μ I, I. 25 U Taq DNA Polymerase, 20-50 ng 基因組 DNA， ddH20 補足到 25 μ I ;SCAR-PCR 擴增程序如下94 °C 4 min ；94 °C I min, 56 °C I min, 72 0C 2 min，30個循環；72 °C 10 min ;所述 10XPCR緩沖液組成成分為 100 mmol/L pH8. 5 Tris-HCl，500 mmol/L KCl 和 15 mmol/L MgCl2 ；(3)SCAR-PCR產物的檢測電泳檢測的SCAR-PCR擴增圖譜中，在分子量為680bp的位置出現DNA條帶,為甘鹿抗褐銹病的標志。
全文摘要
本發明涉及一種利用SCAR標記鑒定甘蔗抗褐銹病性的方法，包括基因組DNA的提取、SCAR-PCR標記的檢測體系建立和SCAR-PCR產物的檢測。本發明的利用SCAR標記鑒定甘蔗抗褐銹病性的方法，具有靈敏度高，所需要的DNA用量少的特點；與常規的抗性鑒定相比，具有操作簡便、檢測時間短、準確性高、容易判斷、重復性好和不受環境條件影響等優點。為甘蔗種質資源的評價和新品種的審定工作，提供了更為簡便有效的抗褐銹病性鑒定體系，對加強我國抗褐銹病甘蔗育種和抗褐銹病甘蔗種質資源的保護工作具有重要意義。
文檔編號C12Q1/68GK102586460SQ20121007046
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月17日 優先權日2012年3月17日
發明者許莉萍, 闕友雄, 陳如凱, 黃寧 申請人:福建農林大學