專利名稱：一種海洋貝類卵細胞石蠟切片方法
技術領域：
本發明涉及到一種石蠟切片的方法，具體講是一種適用于卵徑較小的海洋貝類卵細 胞石蠟切片方法。
背景技術：
石蠟切片技術是受精細胞學的重要研究手段之一，其技術成熟、方法穩定、造價低 廉、觀察方便，且有組織結構保存完好、獲得圖像對比清晰等優點，可在光鏡下清晰地 看到受精卵外部形態和內部結構的變化，尤其是紡綞體的消長和兩性原核結合時的核膜 變化，具有不同于壓片、透射電鏡和熒光顯微術的獨特優勢。石蠟切片技術已被廣泛用
于魚類受精細胞學研究中。然而，由于多數貝類的卵子個體微小，尤其是雙殼貝類，卵 徑一般僅幾十微米，如櫛孔扇貝卵徑70pm左右，文蛤80 9(^m，菲律賓蛤仔71~85nm， 而近江牡蠣、寬殼全海筍的卵徑僅有40 5(^m，如此小的卵子，肉眼不易看清，給脫水、
透蠟、包埋等過程帶來很大不便。
理論上講，石蠟切片的厚度可達5 8阿，而一個幾十微米的卵子也能被切成數片。 只要卵量大、切片和染色效果好，就能找到方向合適的卵子的切面，從而觀察到染色體 和紡錘體的變化情況，系統研究不同發育階段的核行為，為受精及早期胚胎發育機理的 深入研究和細胞工程育種提供基礎資料。但是，傳統的石蠟切片技術尚未解決卵子小而 帶來的諸多困難，所以目前用石蠟切片技術來研究雙殼貝類受精過程的報道很少，而能 獲得分裂相清晰、染色效果好的方法介紹還尚未見到。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的現狀，提供一種針對海洋貝類卵細胞 相對微小的特點，提供一種分裂相清晰、染色效果好的海洋貝類卵細胞石蠟切片方法。
本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為該海洋貝類卵細胞的石蠟切片方 法，其特征在于包括下述步驟
①樣品固定將不同發育階段的卵細胞連同海水轉移至離心管中，然后緩慢加入冷的Bouin氏液將樣品固定20-40min，待樣品自然沉降或低速離心后，除去上清液，加入新的Bouin氏液，如此更換Bouin氏液2-3次，然后轉移入70%酒精中，置4t冰箱中保存；
②卵細胞預處理向盛有卵細胞的離心管中加入幾滴1%的伊紅染液，染色1~2分鐘，使卵細胞表面被染成粉紅色，便于肉眼識別；用細針在稱量紙上刺些小孔，用稱量紙將染色后的卵細胞包起來，以使卵子在處理時不會漏出；
③脫水與透明程序將用稱量紙包好的卵細胞置于脫水機或染色缸中，用梯度乙醇脫水；先后采用70%乙醇脫水50分鐘、85%乙醇脫水50分鐘2次、95%乙醇脫水45分鐘2次、100%乙醇脫水45分鐘2次；然后用l: 1 (體積比)的無水乙醇/二甲苯過渡處理25分鐘，再用二甲苯處理20分鐘2次，使之透明；
透蠟和包埋用l: 1 (體積比)的二甲苯/石蠟過渡處理40分鐘，52~56匸熔
點的石蠟透蠟1小時2次；打開紙包，將卵子置于包埋盒中，使卵子均勻地分布于包埋
盒中部，然后加注融蠟進行包埋；
⑤切片和烤片用生物切片機切片，切片厚度5"m,蠟帶用40'C恒溫水浴展片，貼于事先涂有粘片劑的載玻片上，然后在烤片機上烘干；
◎染色與封片染色采用伊紅-蘇木精復染方法，其中用蘇木精染色6 8分鐘，伊紅染色1.5 2分鐘；然后用中性樹膠封片。
上述方法中，所述的Bouin氏液配方可以為苦味酸飽和液75mL,甲醛25mL，冰醋酸5 mL。
所述的蘇木精染液配方可以為2g蘇木精溶于250mL無水乙醇中，10g硫酸鋁溶于750mL水中，兩液混合，加熱沸騰3分鐘，稍冷卻加入碘酸鈉0. 5g，檸檬酸l.Og，溶解后即得到蘇木精染液。
所述的伊紅染液配方可以為1 g伊紅溶于99mL 70%乙醇中。
與現有技術相比較，本發明的優點在于
1、 通過簡單的預染色和紙包處理，克服了海洋貝類卵子微小帶來的操作不便；
2、 操作簡單，毋需增加專門的儀器，便于推廣應用；
3、 脫水、透明、透蠟程序間均有過渡步驟，程序內多為兩步處理，使試劑逐漸完全地進入組織，完好地保存組織的原有結構；
4、 采用改進的伊紅-蘇木精染色，獲得的卵子切片清晰、對比度大，便于觀察。
圖1為本發明實施例1中文蛤卵子及二細胞期胚胎切片，其中，A.文蛤成熟未受精卵，示染色體(CHS)、紡錘體(SD);B. 第二次成熟分裂中期，示第一極體(PB1);
C. 兩性原核形成期，示第二極體(PB2)、雌原核(FPN)、雄原核(MPN);
D. 二細胞期，示卵裂溝(CF);
圖2為本發明實施例2是寬殼全海筍受精卵及二細胞期胚胎切片，其中，
A. 第二次成熟分裂中期，示第一極體(PB1)、紡錘體(SD)、精核(SN);
B. 兩性原核形成期，示第二極體(PB2)、雌原核(FPN)、雄原核(MPN);
C. 第一次卵裂后期，示染色體(CHS);
D. 二細胞期，示染色體(CHS)、卵裂溝(CF)。
具體實施例方式
以下附圖結合實施例對本發明作進一步詳細描述。
首先配制Bouin氏固定液、蘇木精染液和伊紅染液。
Bouin氏固定液取苦味酸飽和液75 mL、甲醛25 mL和冰醋酸5 mL，混合均勻得 到Bouin氏固定液；
蘇木精染液將2g蘇木精溶于250 mL無水乙醇中，10g硫酸鋁溶于750 raL水中， 兩液混合，加熱沸騰3分鐘，稍冷卻加入碘酸鈉O. 5g和檸檬酸1.0g，溶解后即得到蘇 木精染液；
伊紅染液將l g伊紅溶于99mL 70%的乙醇中即得到伊紅染液。 實施例1
1、 樣品固定取山東群體文蛤，在浙江溫州的省海洋水產養殖研究所清江科研基 地進行催產和胚胎發育研究。取不同發育階段的文蛤卵細胞于5mL的離心管中，受精 0-60 min每隔5 min取樣一次，60 - 120 min，每隔10 min取樣一次，緩慢加入冷的 Bouin氏固定液2-3mL,固定30分鐘，待樣品沉降后，更換二次固定液；用Bouin氏液 固定5小時后，移入70%酒精中，置4'C冰箱保存。
2、 卵細胞預處理向盛有卵細胞的離心管中加入2滴1%的伊紅染液，染色1-2分 鐘，使卵細胞表面被染成粉紅色；取正方形的稱量紙，用細針在紙上刺些小孔，然后將 紙折好，把染色后的卵細胞包起來，保證卵子不會漏出。
3、 脫水與透明程序將包好的卵細胞置于染色缸中，用梯度乙醇脫水，采用70% 乙醇脫水50分鐘、85%乙醇脫水50分鐘2次、95%乙醇脫水45分鐘2次、100%乙醇脫 水45分鐘2次；透明前，用無水乙醇二甲苯(體積比l: 1 )過渡處理25分鐘，然 后用二甲苯20分鐘2次透明。4、 透蠟程序和包埋用二甲苯石蠟(體積比1: 1 )過渡處理40分鐘，56°C熔點的石蠟透蠟1小時2次；將紙包打開，用尖頭鑷子將卵子置于包埋盒中，并使卵子均勻地分布于包埋盒中部，然后加注融蠟進行包埋。
5、 切片和烤片采用金華益迪YD-1508A型切片機連續切片，切片厚度5wm，蠟帶用4(TC恒溫水浴展片，貼于事先涂有粘片劑的載玻片上，烤片機烘干即可染色；
6、 染色與封片染色采用伊紅-蘇木精復染方法，其中蘇木精染色8分鐘，伊紅染
色1.5分鐘；然后用中性樹膠封片。
7、 觀察拍照與受精細胞學研究在Nikon E-600顯微鏡的油鏡下(XI 000)觀察，CCD拍照。觀察結果表明，文蛤成熟未受精卵呈卵圓形，卵徑90ixm左右，核相處于第一次成熟分裂中期，受精后5-10 min，精子進入卵內并明顯膨脹，激活卵子啟動兩次成熟分裂；在受精后20min、 30min，先后排出第一、第二極體；受精后40 - 45 min，受精卵分裂成2個大小不等的卵裂球;受精后55 - 60 min，分裂為4細胞;受精后80 - 90min，分裂為8細胞。發育過程中出現了多精入卵和多極分離現象。該文蛤卵細胞石蠟切片清晰、對比度大、觀察方便。
實施例2
取溫州洞頭縣海區的寬殼全海筍親貝。受精后固定不同發育時期的受精卵，由于寬殼全海筍卵子直徑僅40-50 nm，更換固定液容易損失，所以固定卵量應該大些，用離心機低速離心來加速沉降。
相比較實施例l，稱量紙上用針刺的孔應小些，以減少脫水、透明、透蠟等過程中卵子的損失。
其余未涉及部分與實施例1相同。
觀察制得的寬殼全海筍卵細胞的石蠟切片，結果表明，寬殼全海筍成熟未受精卵核相處于第一次成熟分裂前期，有明顯的生發泡和核仁；受精后6-9min，生發泡逐漸萎縮、破裂；受精后20min、 30min，受精卵先后排出第一、第二極體；受精后50 min,受精卵分裂成2個大小不等的卵裂球；受精后65 - 70min，分裂為4細胞。實驗中也發現了少量的多精入卵和多極分離現象。
權利要求
1、一種海洋貝類卵細胞的石蠟切片方法，其特征在于包括下述步驟①樣品固定先用冷的Bouin氏液將樣品固定20-40min，待樣品自然沉降或低速離心后，用吸管除去上清液，至少更換二次固定液，然后再用Bouin氏液固定5小時后，移入70％酒精中，置4℃冰箱中保存；②卵細胞預處理向盛有卵細胞的離心管中加入幾滴1％的伊紅染液，染色1-2分鐘；用細針在稱量紙上刺些小孔，然后用稱量紙將染色后的卵細胞包起來，以使卵子在處理時不會漏出；③脫水與透明程序將用稱量紙包好的卵細胞置于脫水機或染色缸中，用梯度乙醇脫水；先后采用70％乙醇脫水50分鐘、85％乙醇脫水50分鐘2次、95％乙醇脫水45分鐘2次、100％乙醇脫水45分鐘2次；然后用1∶1(體積比)的無水乙醇/二甲苯過渡處理25分鐘，再用二甲苯處理20分鐘2次，使之透明；④透蠟和包埋用1∶1(體積比)的二甲苯∶石蠟過渡處理40分鐘，52～56℃熔點的石蠟透蠟1小時2次；將紙包打開，將卵子置于包埋盒中，加注融蠟進行包埋；⑤切片和烤片用生物切片機切片，切片厚度5μm，蠟帶用40℃恒溫水浴展片，貼于事先涂有粘片劑的載玻片上，然后在烤片機上烘干；⑥染色與封片染色采用伊紅-蘇木精復染方法，其中用蘇木精染色6～8分鐘，伊紅染色1.5～2分鐘；然后用中性樹膠封片。
2、 根據權利要求1所述的海洋貝類卵細胞的石蠟切片方法，其特征在于所述的Bouin氏液配方為苦味酸飽和液、甲醛和冰醋酸的混合溶液，三者的體積比冰醋酸甲醛苦味酸飽和液為h 5: 15。
3、 根據權利要求l所述的海洋貝類卵細胞的石蠟切片方法，其特征在于所述的蘇木精染液配方為2g蘇木精溶于250mL無水乙醇中，10g硫酸鋁溶于750mL水中，兩液混合，加熱沸騰3分鐘，稍冷卻加入碘酸鈉0. 5g,檸檬酸1.0g，溶解后即得到蘇木精染液。
4、 根據權利要求1所述的海洋貝類卵細胞的石蠟切片方法，其特征在于所述的伊紅染液為1%的伊紅溶液，用70%乙醇溶解。
全文摘要
本發明涉及一種海洋貝類卵細胞的石蠟切片方法，其包括固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、染色、封片等步驟，其特點是克服了貝類卵子體積小而難以浸蠟和包埋的問題，改進了蘇木精-伊紅染色方法，獲得了良好的切片和染色效果。本方法簡單易行，毋需增加儀器設備，可對直徑≥40微米的大多數海洋貝類的卵細胞進行石蠟切片，其中脫水、透明、透蠟步驟間均有過渡步驟，多為兩步處理，使試劑逐漸完全地進入組織，完好地保存組織的原有結構，為貝類受精及早期胚胎發育研究提供了有效的研究手段。
文檔編號G01N1/28GK101650273SQ20091010134
公開日2010年2月17日 申請日期2009年7月30日 優先權日2009年7月30日
發明者林志華, 董迎輝 申請人:浙江萬里學院