專利名稱：定量pcr的多波長熒光檢測方法及其裝置的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于定量PCR的多波長熒光檢測方法及其裝置。
背景技術：
定量PCR檢測系統工作原理是使反應物在指定的變性溫度、退火溫度和延伸溫 度之間自動循環的儀器，通過變性、退火和延伸的溫度循環可在短時間內將靶DNA擴增數 百萬倍。 定量PCR檢測系統通過使用不同波長的激發光照射試管，當試管中的試劑被激發 出特定波長熒光時，用光學傳感器，如PMT (光電倍增管)、PD (光敏二極管)、APD (雪崩光電 二極管)等采集到熒光強度信號并及時傳送到計算機進行實時數據顯示和分析。
隨著現代PCR技術發展，有時需要在同一管或同次實驗內實現多種染料熒光的檢 測，以適應試劑添加物(參照物、試劑集成度增加)不斷增多的需要。 目前主流定量PCR檢測系統(Real time PCR，實時熒光定量PCR)的多波長掃描工 作模式是采用激發光濾光片輪和熒光濾光片輪。其特征是使用步進電機，以機械傳動方 式逐一選擇需要的激發光濾光片和熒光濾光片。此模式下，濾光片輪的重復定位精度受運 動機構限制，其可靠性由于運動而降低。要實現多波長檢測，必須依次切換濾光片組，依次 控制激發光，每次只有一種波長的發光光工作，其總檢測時間相當長。以4通道為例，標準
96孔板掃描一般都需要20s以上。由于試劑酶活性受到時間和溫度的顯著影響，因此時間 的延長將不可避免地引起試劑熒光衰減和降解，并影響定量PCR的檢測結果。
針對單個PCR試管和96孔全裙板的研究表明，間隔1個標準模塊孔位(96x0. 2ml 試管用，即激發光束間距18mm)時，激發光之間的串擾基本在O. 1X以下，在PCR檢測應用上 基本可以忽略。如果激發光是相鄰孔，激發光會通過透明材質的試管傳導到相鄰孔上，形成 背景和引起誤激發，其影響在典型熒光信號強度的10%以上，就不能滿足要求。
發明內容
針對現有多波長檢測技術存在的缺陷，本發明的目的是提供一種能實現實時同步 檢測的定量PCR的多波長熒光檢測方法及其裝置。 本發明的定量PCR的多波長熒光檢測方法，其特征是設置n個相互間隔為一個模 塊標準孔位的熒光波長檢測通道，n = 2 96，每個熒光波長檢測通道具有一條光源激發光 纖路徑和一條熒光接收光纖路徑，n條光源激發光纖路徑的光源各自經過透鏡準直和激發 光濾光片獲得所需波長的激發光，再經聚焦分別沿光纖照射到n個試管底部或頂部激發試 劑樣本；n個試管中試劑樣本熒光分別進入熒光接收光纖路徑，經透鏡準直和熒光濾光片 獲得所需波長的熒光照到平面反光鏡，n條熒光接收光纖路徑的平面反光鏡將樣本熒光分 別折射到同一個多面體反光鏡的n個工作面，由多面體反光鏡將n個熒光波長檢測通道的 熒光會聚到同一個光學傳感器的光電面上，實現多波長熒光實時同步檢測。
上述的激發光和熒光濾光片的參數根據所需檢測試劑的染料光譜特性選定，以準確區分背景和信號，可以是200-900nm范圍內的任意波長。 實施本發明定量PCR的多波長熒光檢測方法的裝置，包括n個相互間隔為一個模 塊標準孔位的熒光波長檢測通道，多面體反光鏡和光學傳感器，多面體反光鏡具有n個工 作面，n = 2 96，每個熒光波長檢測通道具有一條光源激發光纖路徑和一條熒光接收光纖 路徑，在光源激發光纖路徑沿光源激發方向依次設有光源，第一透鏡、第一濾光片和第一聚 焦鏡，在熒光接收光纖路徑沿熒光傳遞方向依次設有第二透鏡、第二濾光片、第二聚焦鏡和 平面反光鏡，將n個熒光檢測通道的熒光會聚到光學傳感器的多面體反光鏡位于平面反光 鏡的反射光路上。 本發明中，所說的光源可以是發光二極管、激光二極管或鹵素燈。光電傳感器可以 是光電倍增管、光敏二極管、雪崩光電管或電荷耦合器件。第一聚焦鏡和第二聚焦鏡均可采 用棱鏡。 本發明中的光源激發光纖和熒光接收光纖可以是兩根獨立的光纖，也可以是Y狀 分叉光纖。 本發明的有益效果在于 D可實現多波長熒光實時同步檢測，檢測效率大大提高。 2)熒光波長檢測通道相互間隔一個模塊標準孔位，檢測時不產生激發光串擾。
3)最大限度縮短了檢測總時間，有利于克服試劑樣本中物質(酶，引物，內參品 等)衰變降解的影響，獲得準確的定量PCR分析結果。 4)采用的光纖沒有相對運動，不存在光纖疲勞壽命問題，便于系統集成和檢測裝 置小型化。 5)通過檢測裝置整體移動方式，可以實現對任意孔的多波長熒光檢測。
圖1是本發明裝置示意圖。
具體實施例方式
以下結合附圖進一步說明本發明。 參照圖l，本發明的定量PCR的多波長熒光檢測裝置，包括n個相互間隔為一個模 塊標準孔位的熒光波長檢測通道，多面體反光鏡11和光學傳感器12，圖示實例中，n = 2， 多面體反光鏡11具有2個工作面，每個熒光波長檢測通道具有一條光源激發光纖路徑1和 一條熒光接收光纖路徑2，此例，光源激發光纖和熒光接收光纖采用Y狀分叉光纖。在光源 激發光纖路徑沿光源激發方向依次設有光源3，第一透鏡4、第一濾光片5和第一聚焦鏡6， 在熒光接收光纖路徑沿熒光傳遞方向依次設有第二透鏡7、第二濾光片8、第二聚焦鏡9和 平面反光鏡IO，多面體反光鏡11位于平面反光鏡10的反射光路上，將2個熒光檢測通道的 熒光會聚到光學傳感器12的光電面上。 圖示實例工作時，2個光源同時點亮，光源各自經過第一透鏡準直和激發光濾光片 獲得所需波長的激發光，再經第一聚焦鏡聚焦后沿光纖照射到試管1和試管3底部或頂部 激發試劑樣本。2個試管中試劑樣本熒光分別進入熒光接收光纖路徑，經第二透鏡準直和第 二熒光濾光片獲得所需波長的熒光照到平面反光鏡的2個工作面，由平面反光鏡將2個熒光檢測通道的熒光會聚到光學傳感器12的光電面上，實現對2個熒光波長檢測通道實時同 步檢測。圖中時刻，試管2未被檢測，但通過檢測裝置整體移動方式，可以實現對對標準模 塊(96x0. 2ml孔試管板)任意孔的多波長熒光同步檢測，無需機械切換，并且所用光纖并不 活動，也消除了光線纖運動疲勞造成的可靠性問題。 激發光和熒光濾光片的參數根據所需檢測試劑的染料光譜特性選定，以準確區分 背景和信號，可以是200-900nm范圍內的任意波長。
權利要求
定量PCR的多波長熒光檢測方法，其特征是設置n個相互間隔為一個模塊標準孔位的熒光波長檢測通道，n＝2～96，每個熒光波長檢測通道具有一條光源激發光纖路徑和一條熒光接收光纖路徑，n條光源激發光纖路徑的光源各自經過透鏡準直和激發光濾光片獲得所需波長的激發光，再經聚焦分別沿光纖照射到n個試管底部或頂部激發試劑樣本；n個試管中試劑樣本熒光分別進入熒光接收光纖路徑，經透鏡準直和熒光濾光片獲得所需波長的熒光照到平面反光鏡，n條熒光接收光纖路徑的平面反光鏡將樣本熒光分別折射到同一個多面體反光鏡的n個工作面，由多面體反光鏡將n個熒光波長檢測通道的熒光會聚到同一個光學傳感器的光電面上，實現多波長熒光實時同步檢測。
2. 根據權利要求1所述的定量PCR的多波長熒光檢測方法，其特征是所說的波長為 200-900nm范圍內的任意波長。
3. —種實施權利要求1所述定量PCR的多波長熒光檢測方法的裝置，其特征是包括n 個相互間隔為一個模塊標準孔位的熒光波長檢測通道，多面體反光鏡(11)和光學傳感器 (12)，多面體反光鏡(11)具有n個工作面，n = 2 96，每個熒光波長檢測通道具有一條 光源激發光纖路徑(1)和一條熒光接收光纖路徑(2)，在光源激發光纖路徑沿光源激發方 向依次設有光源(3)，第一透鏡(4)、第一濾光片(5)和第一聚焦鏡(6)，在熒光接收光纖路 徑沿熒光傳遞方向依次設有第二透鏡(7)、第二濾光片(8)、第二聚焦鏡(9)和平面反光鏡 (10)，將n個熒光檢測通道的熒光會聚到光學傳感器(12)的多面體反光鏡(11)位于平面 反光鏡(10)的反射光路上。
4. 根據權利要求3所述的定量PCR的多波長熒光檢測裝置，其特征是光源(3)為發光 二極管、激光二極管或鹵素燈。
5. 根據權利要求3所述的定量PCR的多波長熒光檢測裝置，其特征是光源激發光纖和 熒光接收光纖是兩根獨立的光纖，或是Y狀分叉光纖。
6. 根據權利要求3所述的定量PCR的多波長熒光檢測裝置，其特征是光電傳感器(12) 是光電倍增管、光敏二極管、雪崩光電管或電荷耦合器件。
7. 根據權利要求3所述的定量PCR的多波長熒光檢測裝置，其特征是第一聚焦鏡和第 二聚焦鏡均為棱鏡。
全文摘要
本發明公開了定量PCR的多波長熒光檢測方法和裝置，設置n個相互間隔為一個模塊標準孔位的熒光波長檢測通道，每個熒光波長檢測通道具有一條光源激發光纖路徑和一條熒光接收光纖路徑，n條光源激發光纖路徑的光源各自經過透鏡準直和激發光濾光片獲得所需波長的激發光，再經聚焦照射到n個試管激發試劑樣本；n個試管試劑樣本熒光分別進入熒光接收光纖路徑，經透鏡準直和熒光濾光片獲得所需波長的熒光照到平面反光鏡，經平面反光鏡折射到同一個多面體反光鏡的n個工作面，由多面體反光鏡將n個熒光波長檢測通道的熒光會聚到光學傳感器的光電面上，實現多波長熒光實時同步檢測。采用本發明可大大提高檢測效率，且檢測時不產生激發光串擾，定量PCR分析結果準確。
文檔編號G01N21/64GK101705280SQ20091015387
公開日2010年5月12日 申請日期2009年11月16日 優先權日2009年11月16日
發明者劉志華, 呂才樹, 李社剛, 王勇, 項偉平 申請人:杭州博日科技有限公司