同時檢測食品中氟喹諾酮類藥物和氯霉素類藥物的方法

專利名稱：同時檢測食品中氟喹諾酮類藥物和氯霉素類藥物的方法
同時檢測食品中氟喹諾酮類藥物和氯霉素類藥物的方法
技術領域：
本發明涉及本發明屬于食品安全領域，涉及一種同時檢測食品中13種氟喹諾酮 類藥物和3種氯霉素類藥物的方法和建立13種氟喹諾酮類藥物和3種氯霉素類藥物的液 質譜庫的方法。
背景技術：
氟喹諾酮(fluoroquinolones)是第三代喹諾酮類藥物，該類藥物對細菌的DNA螺 旋酶(DNA-gyrase)具有選擇性抑制作用，從而抑制細菌的DNA合成，導致DNA降解及死亡。 該類藥物抗菌譜廣、高效、低毒、組織穿透能力強，抗菌作用是磺胺類的近千倍，可與第三代 頭孢類抗生素相媲美。對水產魚類的消化道及鰓細菌性疾病也有良好的防治作用，自八十 年代起成為治療魚類疾病的主要抗菌藥物，由于長期使用氟喹諾酮抗生素易導致動物群體 體內致病菌產生耐藥性，某些氟喹諾酮類化合物還可能有潛在的致癌作用，該類藥物在動 物性食品中的殘留問題已經成為人們關注的焦點。我國以及世界衛生組織、歐盟、美國、日 本等國家和組織都將氟喹諾酮類藥物列入限制使用的獸藥藥物名單中，并制訂出相關的最 高殘留限量MRL。隨著國際間的技術壁壘的逐年增高，氟喹諾酮藥物的殘留限量迅速降低， 水產品行業的風險正日益增加。在我國，恩諾沙星、環丙沙星、諾氟沙星、氟哌酸、氧氟沙星 等氟喹諾酮類藥物在蜂產品中的殘留量不得超過10 μ g/kg;美國聯邦法規關于鯰魚中氟 喹諾酮的殘留限量標準為5ppb，但阿拉巴馬州和密西西比州作為美國鯰魚加工的主要地 區，則規定鯰魚中不得檢出氟喹諾酮殘留，即“零限量”標準。日本肯定列表規定，在蜂產品 中，恩諾沙星、諾氟沙星、環丙沙星、氧氟沙星四種氟喹諾酮類藥物的限量均為 2. 5μ g/kg ；歐盟規定，恩諾沙星、諾氟沙星、環丙沙星、氧氟沙星四種氟喹諾酮類藥物的限 量均為5μ g/kg ；美國和加拿大規定，氟喹諾酮類藥物為養蜂業禁用藥物，在蜂王漿中各種 氟喹諾酮類藥物MRL為5μ g/kg。日本2006年5月29日開始實施“肯定列表制度”后，除有 暫定標準的物質如雙氟沙星、恩諾沙星、噁喹酸等外，其余沙星類藥物均按10 μ g/kg的“一 律標準”。06年廣東省出口日本烤鰻恩諾沙星超標事件，07年美國、韓國對中國水產品氟喹 諾酮藥物預警事件等都對我國水產品行業造成重大損失，水產品中氟喹諾酮藥物的殘留問 題已成為制約我國水產品生產和出口的一個重要因素。氯霉素(Chloramphenicol，CAP)，是廣譜抗生素，常用于預防與治療動物疾病，在 水產品養殖業曾廣泛使用。氯霉素存在毒副作用，能抑制骨髓造血功能，引起再生障礙性 貧血、細胞減少性貧血、血小板減少和粒狀白細胞減少。作為蛋白質合成抑制劑，會防礙紅 細胞的產生[1]。氯霉素使用對人類健康潛在的危害已引起國際組織和世界上許多國家 和地區的高度重視。歐盟、美國等均在法規中規定CAP殘留限量標準為“零容許量”(Zero tolerance)，即不得檢出。甲砜霉素(Thiamphenicol，TAP)、氟甲砜霉素(Florfenicol，FF) 與氯霉素同屬于一類化合物。人們已知甲砜霉素、氟甲砜霉素的毒性很低，甲砜霉素作為氯 霉素的可行替代品用于食用動物已獲得公認。氟甲砜霉素是最新合成的此類化合物，在治療那些已對其他抗菌素產生抗藥性的傳染病時，氟甲砜霉素可作為氯霉素和甲砜霉素的一 種替代品。甲砜霉素的最大殘留限量MRL(maximumrequired limits)值為50 μ g/kg，氟甲 砜霉素的MRL值為100-3000 μ g/kg。氯霉素的最低要求執行限MRPL(minimum required performance limit)值為 0.3yg/kgo目前氟喹諾酮類藥物和氯霉素類藥物殘留的測定方法可以概括地劃分為微生物 抑制法、免疫分析技術、色譜分析技術和液相色譜-質譜聯用技術等。微生物抑制法是一種 價格低廉、操作簡便的初篩方法。但這種方法在較低限量水平時不夠靈敏，且由于具備抑菌 作用的抗生素種類繁多，干擾因素較多，假陽性較高。免疫分析技術靈敏度較高、快速簡便， 但存在交叉反應及假陽性問題。色譜分析技術最常見的有采用熒光檢測的高效液相色譜 法，近年來，隨著液相色譜_質譜聯用技術的發展，這種技術靈敏度高、定性準確，可實現多 種物質的同時定量與確證，越來越廣泛地應用在了氟喹諾酮類藥物和氯霉素類藥物殘留的 分析中。但該兩類化合物需要分別檢測，且缺乏譜庫檢索，本發明選擇13種常見的氟喹諾 酮類藥物和3種氯霉素類藥物為研究對象，建立該兩類藥物的LC-MS/MS (液相色譜-質譜 聯用)譜庫，并利用譜庫檢索建立水產品中同時檢測13種常見的氟喹諾酮類藥物和3種氯 霉素類藥物的快速LC-MS/MS (液相色譜-串聯質譜)篩選方法，這對保障我國水產品進出 口安全具有重要意義。

發明內容本發明的目的是提供一種同時檢測食品中氟喹諾酮類藥物和氯霉素類藥物的方 法，同時提供了建立氟喹諾酮類藥物和氯霉素類藥物的液質譜庫的方法，其中氟喹諾酮類 藥物為環丙沙星、單諾沙星、二氟沙星、恩諾沙星、洛美沙星、麻保沙星、萘啶酸、諾氟沙星、 氧氟沙星、惡喹酸、培氟沙星、沙拉沙星、氟甲喹，氯霉素類藥物為氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜 霉素。本發明檢測方法檢測13種氟喹諾酮類藥物的檢測限為0. 5ppb，3種氯霉素類藥物的 檢測限為0. Ippb，回收率大于80%。上述目的通過以下技術方案實現一種同時檢測食品中氟喹諾酮類藥物和氯霉素類藥物的方法，其特征在于，所述 方法按如下步驟進行1)提取稱取樣品至離心管中，加入內標物溶液，再加入N，N-二甲基甲酰胺-乙 腈，經均質、水浴超聲、12000r/min離心后，吸取上清液，在45 50°C氮氣保護下濃縮，再加 入水，于渦旋振蕩器振蕩，得提取液；2)凈化將所述提取液過HLB固相萃取小柱，先后以水、20%甲醇淋洗，棄去淋洗 液，抽干，用5%氨甲醇溶液洗脫，收集洗脫液于瓶，50°C旋轉蒸發至干，上述殘渣加10%乙 腈溶解，于渦旋振蕩器振蕩，過濾膜，得凈化液；3)將所述凈化液進行液相色譜-串聯質譜測定，液相色譜條件31) C18色譜柱，xdb-c8保護柱，柱溫35°C，進樣量10 μ L，流動相流速0. 3mL/min, 流動相乙酸銨緩沖溶液和純乙腈組成，采用線性梯度流動相洗脫；32)質譜條件掃描方式正負掃描方式，離子源電噴霧離子源；霧化氣氮氣，流速65mL/min ；氣簾氣氮氣，流速20mL/min ；輔助加熱氣氮氣，流速70L/min，溫度700°C ；碰撞氣氮氣， 流速5mL/min ；電離電壓5. 5kV ；監測方式多級反應監測；通過多級反應監測進行定量分 析；33)檢測模式多級反應監測一自動信息關聯掃描一增強離子掃描一譜庫檢索。一種建立氟喹諾酮類藥物和氯霉素類藥物的譜庫的方法，其特征在于，所述方法 按如下步驟進行1)將氟喹諾酮類藥物和氯霉素類藥物標準品進行液相色譜_串聯質譜測定，液相色譜條件C18色譜柱，xdb-c8保護柱，柱溫35°C，進樣量10 μ L，流動相流速0. 3mL/min，流 動相乙酸銨緩沖溶液和純乙腈組成，采用線性梯度流動相洗脫；質譜條件掃描方式正負掃描方式，離子源電噴霧離子源；霧化氣氮氣，流速65mL/min ； 氣簾氣氮氣，流速20mL/min ；輔助加熱氣氮氣，流速70L/min，溫度700°C ；碰撞氣氮氣， 流速5mL/min ；電離電壓5. 5kV ；監測方式多級反應監測；2)分別用高(30ev)、中(20ev)、低(IOev)三種碰撞能量對氟喹諾酮類藥物和氯霉 素類藥物標準品分別進行EPI掃描，分別得出二級質譜掃描圖，從而建立譜庫。本發明建立了 13種氟喹諾酮類藥物和3種氯霉素類藥物的液質譜庫和LC-MS/MS 檢測方法，該前處理簡單，重復性好，結合本發明建立的液質譜庫，能同時實現對13種氟喹 諾酮類藥物和3種氯霉素類藥物的快速定量定性分析，分析時間縮短了一倍，非常適合進 出口快速確證工作。

圖1為本發明的檢測方法的示意圖；圖2為恩諾沙星陽性可疑樣品重構離子色譜圖；圖3為恩諾沙星陽性可疑樣品EPI掃描圖；圖4為恩諾沙星陽性可疑樣品譜庫檢索結果圖；圖5-20分別為環丙沙星、單諾沙星、二氟沙星、恩諾沙星、洛美沙星、麻保沙星、萘 啶酸、諾氟沙星、氧氟沙星、惡喹酸、培氟沙星、沙拉沙星、氟甲喹、甲砜霉素、氟甲砜霉素、氯 霉素的二級質譜掃描圖； 圖21為13種沙星類藥物標準品MRM色譜圖；圖22為3種氯霉素標準品MRM色譜圖；圖23A和圖23B為沙拉沙星兩組重構離子色譜圖；圖24A和圖24B為二氟沙星兩組重構離子色譜圖；圖25A和圖25B為氧氟沙星兩組重構離子色譜圖；圖26A和圖26B為單諾沙星兩組重構離子色譜圖；圖27A和圖27B為環丙沙星兩組重構離子色譜圖；圖28A和圖28B為氟甲喹重兩組構離子色譜圖；圖29A和圖29B為萘啶酸兩組重構離子色譜圖30A和圖30B為氟甲砜霉素兩組重構離子色譜圖；圖31A和圖31B為甲砜霉素兩組重構離子色譜圖；圖32A和圖32B為氯霉素兩組重構離子色譜圖；圖33A和圖33B為麻保沙星兩組重構離子色譜圖；圖34A和圖34B為恩諾沙星兩組重構離子色譜圖；圖35A和圖35B為培氟沙星兩組重構離子色譜圖；圖36A和圖36B為諾氟沙星重構離子色譜圖；圖37A和圖37B為惡喹酸兩組重構離子色譜圖；圖38A和圖38B為洛美沙星兩組重構離子色譜圖。
具體實施方式本發明檢測方法主要是用來檢測食物中的13種氟喹諾酮類藥物和3種氯霉素類 藥物，其中，13種氟喹諾酮類藥物為環丙沙星、單諾沙星、二氟沙星、恩諾沙星、洛美沙星、麻 保沙星、萘啶酸、諾氟沙星、氧氟沙星、惡喹酸、培氟沙星、沙拉沙星、氟甲喹，3種氯霉素類藥 物為氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素。在本說明書中，二級質譜掃描圖都是EPI掃描圖。[檢測過程]參見圖1本發明檢測方法包括以下步驟1、樣品處理提取準確稱取5. Og樣品(準確至0. Olg)至50mL離心管中，加入100 μ g/L的同 位素標記的氯霉素內標(ChloramphenicoI-D5)溶液和1000 μ g/L的同位素標記的環丙沙 星內標(Ciprofloxacin-D8)和1000 μ g/L的同位素標記的諾氟沙星內標(Norfloxacin-D5) 混合溶液各20yL，再加入25mL N，N-二甲基甲酰胺-乙腈(2+8，V/V)，均質30s，水浴超聲 IOmin, 12000r/min高速離心5min ；吸取IOmL上清液，45 50°C氮氣濃縮至1ml，加入5mL 水，于渦旋振蕩器振蕩30s，待凈化。凈化將上述提取液以約1 2mL/min的流速全部過Oasis HLB(6ml,200mg)固相 萃取小柱，先后以6mL水、6mL 20%甲醇淋洗，棄去淋洗液，抽干，用6mL 5%氨甲醇溶液洗 脫，收集洗脫液于25mL雞心瓶，50°C旋轉蒸發至干，上述殘渣加lmL10%乙腈溶解，于渦旋 振蕩器振蕩lmin，過0. 22 μ m濾膜，供液相色譜-串聯質譜測定。2、液相色譜條件儀器設備=Agilent 1200液相色譜色譜柱YMCC18 2. 1 X 150mm, 3 μ m ；保護柱zorbax xdb_c8 2. 1 X 12. 5mm ；流動相溶劑A是5mmol/L乙酸銨緩沖溶液，溶劑B是純乙腈；梯度洗脫在O至5min內，溶劑A體積分數從95 %線性減少到55 %，溶劑B體積分 數相應地從5%線性升到55% ；然后保持8min，在13. Imin時溶劑A的體積分數改至95% 和溶劑B體積分數相應地改至5%，并平衡7min ；流動相流速0·3mL/min ；柱溫35°C ；柱溫是指柱溫箱的溫度，色譜柱和保護柱在柱溫箱里。進樣量10μ L。
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3、質譜條件儀器設備API4000QTrap掃描方式正負掃描方式監測方式多級反應監測；離子源(Ion Source)電噴霧離子源(Electron spray Ionization ESI)；霧化氣氮氣，流速65mL/min ；氣簾氣氮氣，流速20mL/min ；輔助加熱氣氮氣，流速70L/min，溫度700°C ；碰撞氣氮氣，流速5mL/min ；電離電壓5.5kV;16種物質的MRM具體參數包括去簇電壓(declustering potential,DP)、碰撞能 (collision energy, CE)見表一。表一氟喹諾酮類藥物、氯霉素類藥物的質譜參數
權利要求
一種同時檢測食品中氟喹諾酮類藥物和氯霉素類藥物的方法，其特征在于，所述方法按如下步驟進行1)提取稱取樣品至離心管中，加入內標物溶液，再加入N，N 二甲基甲酰胺 乙腈，經均質、水浴超聲、12000r/min離心后，吸取上清液，在45～50℃氮氣保護下濃縮，再加入水，于渦旋振蕩器振蕩，得提取液；2)凈化將所述提取液過HLB固相萃取小柱，先后以水、20％甲醇淋洗，棄去淋洗液，抽干，用5％氨甲醇溶液洗脫，收集洗脫液于瓶，50℃旋轉蒸發至干，上述殘渣加10％乙腈溶解，于渦旋振蕩器振蕩，過濾膜，得凈化液；3)將所述凈化液進行液相色譜 串聯質譜測定，31)液相色譜條件C18色譜柱，xdb c8保護柱，柱溫35℃，進樣量10μL，流動相流速0.3mL/min，流動相乙酸銨緩沖溶液和純乙腈組成，采用線性梯度流動相洗脫；32)質譜條件掃描方式正負掃描方式，離子源電噴霧離子源；霧化氣氮氣，流速65mL/min；氣簾氣氮氣，流速20mL/min；輔助加熱氣氮氣，流速70L/min，溫度700℃；碰撞氣氮氣，流速5mL/min；電離電壓5.5kV；監測方式多級反應監測；33)檢測模式多級反應監測→自動信息關聯掃描→增強離子掃描→譜庫檢索。
2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟1)中的內標物溶液具體為 100 μ g/L的同位素標記的氯霉素內標Chloramphen Icol-D5溶液和1000 μ g/L的同位 素標記的環丙沙星內標CiprofloxaCin-D8和1000 μ g/L的同位素標記的諾氟沙星內標 Norfloxacin-D5 混合溶液。
3.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟3)中的線性梯度流動相洗脫具 體為在O至5min內，乙酸銨緩沖溶液體積分數從95%線性減少到55%，純乙腈體積分數 相應地從5%線性升到55% ；然后保持8min，在13. Imin時乙酸銨緩沖溶液的體積分數改 至95%和純乙腈體積分數相應地改至5%，并平衡7min。
4.一種建立氟喹諾酮類藥物和氯霉素類藥物的液質譜庫的方法，其特征在于，所述方 法按如下步驟進行1)將氟喹諾酮類藥物和氯霉素類藥物標準品進行液相色譜-串聯質譜測定，液相色譜條件C18色譜柱，xdb-c8保護柱，柱溫35°C，進樣量10 μ L，流動相流速0. 3mL/min,流動相 乙酸銨緩沖溶液和純乙腈組成，采用線性梯度流動相洗脫；質譜條件掃描方式正負掃描方式，離子源電噴霧離子源；霧化氣氮氣，流速65mL/min ；氣簾 氣氮氣，流速20mL/min ；輔助加熱氣氮氣，流速70L/min，溫度700°C ；碰撞氣氮氣，流速 5mL/min ；電離電壓5. 5kV ；監測方式多級反應監測；2)分別用30eV、20eV、IOev三種碰撞能量對氟喹諾酮類藥物和氯霉素類藥物標準品分 別進行EPI掃描，分別得出二級質譜掃描圖，從而建立液質譜庫。
全文摘要
本發明建立了13種沙星類藥物和3種氯霉素類藥物的液質譜庫和LC-MS/MS檢測方法，該前處理簡單，重復性好，結合本發明建立的液質的譜庫，能同時實現對13種氟喹諾酮類藥物類藥物和3種氯霉素類藥物的快速定量定性分析，分析時間縮短了一倍，非常適合進出口快速確證工作。
文檔編號G01N30/06GK101957348SQ20101028518
公開日2011年1月26日 申請日期2010年9月17日 優先權日2010年9月17日
發明者馮家望, 周新朋, 彭玉芬, 梁玉英, 蔡勤仁, 蔡杰, 薛良辰, 錢振杰 申請人:中華人民共和國珠海出入境檢驗檢疫局