一種丙氨環丙沙星半抗原及其制備方法和用圖
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物化工技術領域，具體涉及一種環丙沙星抗原的制備方法及其應 用。
【背景技術】
[0002] 環丙沙星(Cipr〇fl〇Xacin，CIP)屬于第三代氟喹諾酮類藥物，是一種常用廣譜抗 生素類藥物，常作為抗菌劑廣泛地應用于畜禽細菌性傳染病的預防及治療。但過量使用或 濫用可導致該藥物在動物源性食品中殘留，從而對人類健康造成嚴重的威脅。因此世界各 國對環丙沙星以及其他氟喹諾酮類藥物的的殘留限量越來越嚴格，我國農業部最新修訂的 《動物性中食品中獸藥最高殘留限量》中規定牛、羊等的奶中及所有食品動物的肌肉、脂肪、 肝、腎臟中所有環丙沙星藥物的最高殘留限量lOOppb。目前，應用于環丙沙星與其他喹諾酮 類藥物檢測的常用方法有高效液相色譜(HPLC)、GC/MS、LC/MS與ELISA。免疫分析具有靈敏、 快速、操作簡單、特異性高的特點，在高通量藥物殘留篩選技術領域占據極為重要的地位。 而免疫分析方法過程中，抗原的制備又是最為關鍵的一個步驟。
[0003] 由于環丙沙星分子量較小，必須將其與載體偶聯形成完全抗原后才能制備相應抗 體，因此，合成高質量的免疫原是小分子物質免疫分析的關鍵。合成免疫原一般采用化學方 法使半抗原與載體蛋白偶聯
【發明內容】
[0004] 本發明提供了式（I)所示的丙氨環丙沙星化合物、其制備方法、以及式（I)化合物 作為半抗原/中間體，以用于制備環丙沙星包被抗原的用途和方法。
[0005]
[0006] 具體公升J式（1)化合物的制爸萬法包谷以卜步驟：
[0007] (1)取鹽酸環丙沙星0.33g，溶于1 OmlN，N-二甲基甲酰胺溶液中，80 °C攪拌；
[0008] (2)逐滴加入氫溴酸3-溴丙氨0.26g，80°C攪拌3h;
[0009] (3)將步驟(2)制備得到的反應液減壓蒸餾，得到式(I)化合物。
[0010] 以及進一步的，通過制備液相色譜對式(I)進行純化的方法;其中制備液相色譜的 色譜條件為色譜柱尺寸為150_ X 4.6mm，色譜柱的固定相填充顆粒的粒徑為3.5um;流動相 流速 1 .OmL/min，柱溫40°C ;
[0011] 所述制備色譜色譜的流動相為乙腈的三氟乙酸水溶液的梯度溶液：以體積百分比 計，1 - 9分鐘為5 % -95 %的乙腈的三氟乙酸水溶液的梯度溶液，9 -14分鐘為95 %的乙腈的 三氟乙酸水溶液，14-15分鐘為95% - 5%的乙腈的三氟乙酸水溶液的梯度溶液，其中所述 三氟乙酸水溶液為含體積濃度0.01 %的三氟乙酸的水溶液；收集制備液相色譜柱的流出 液，得純化的式(I)化合物。
[0012] 本發明公開了式（I)化合物用于制備環丙沙星包被抗原的用途，即作為制備環丙 沙星包被抗原的中間體，或者作為制備環丙沙星包被抗原的半抗原，以制備環丙沙星-丙 氨-牛血清蛋白、環丙沙星-丙氨-卵清蛋白的用途。
[0013] 具體的，本發明所述的式(I)化合物制備環丙沙星-丙氨-牛血清蛋白或環丙沙星-丙氨-牛血清蛋白抗原的用途，在于所述制備方法包含以下步驟：
[0014] (1)取式（I)化合物0 · 10g，溶于5mL 0 ·6mol/L的鹽酸溶液中，加入30mg鋅粉，80°C 水浴鍋加熱30min，得溶液A;
[0015] ⑵稱取1 〇〇mg牛血清蛋白溶解于2mL的0.02mo 1/L的磷酸鹽緩沖液中，得溶液B;
[0016] (3)將溶液A緩慢滴加到溶液B中充分混合，滴加體積濃度25 %的戊二醛水溶液 0. lml，室溫攪拌6小時；混合液裝入透析袋，PH值7.4的0 . Olmol/L的磷酸鹽緩沖液液4°C透 析72小時，得環丙沙星-丙氨-牛血清蛋白。
[0017] 同時，本發明提供了一種制備環丙沙星-丙氨-牛血清蛋白的方法，包含以下步驟：
[0018] (1)取式（I)化合物0 · 10g，溶于5mL 0 ·6mol/L的鹽酸溶液中，加入30mg鋅粉，80°C 水浴鍋加熱30min，得溶液A;
[0019 ] ⑵稱取1 〇〇mg牛血清蛋白溶解于2mL的0.02mo 1/L的磷酸鹽緩沖液中，得溶液B;
[0020] (3)將溶液A緩慢滴加到溶液B中充分混合，滴加體積濃度25 %的戊二醛水溶液 0. lml，室溫攪拌6小時；混合液裝入透析袋，PH值7.4的0.01m〇l/L的磷酸鹽緩沖液液4°C透 析72小時，得環丙沙星-丙氨-牛血清蛋白。
[0021] 進一步的，本發明公開了上述制備方法得到的環丙沙星-丙氨-牛血清蛋白產品， 及環丙沙星-丙氨-牛血清蛋白包被抗原；以及以所述環丙沙星-丙氨-卵清蛋白作為抗原免 疫新西蘭兔制備環丙沙星抗體、進而制備環丙沙星檢測試劑盒的用途。
[0022] 此外，本發明還具體的提供了所述的式（I)化合物制備環丙沙星-丙氨-卵清蛋白 或環丙沙星-丙氨-卵清蛋白抗原的用途，在于所述制備方法包含以下步驟：
[0023 ] (1)式（I)化合物0.10g，溶于N，N-二甲基甲酰胺，得溶液C;
[0024] (2)取1-(3 -二甲氨基丙基）-3 -乙基碳二亞胺鹽酸鹽30mg，溶于4mL蒸餾水，緩慢滴 加至溶液C中，室溫攪拌24小時，得溶液D;
[0025] (3)將步驟(2)制備的溶液D離心，取上清液，緩慢滴加至5mL含50mg卵清蛋白的碳 酸鈉緩沖水溶液中，所述碳酸鈉緩沖水溶液的濃度為〇. lmol/L，4°C攪拌72小時，得環丙沙 星-丙氨-卵清蛋白。
[0026] 同時，本發明提供了一種制備環丙沙星-丙氨-卵清蛋白的制備方法，包含以下步 驟：
[0027] (1)式（I)化合物0.10g，溶于N，N-二甲基甲酰胺，得溶液C;
[0028] (2)取1-(3 -二甲氨基丙基）-3 -乙基碳二亞胺鹽酸鹽30mg，溶于4mL蒸餾水，緩慢滴 加至溶液C中，室溫攪拌24小時，得溶液D;
[0029] (3)將步驟(2)制備的溶液D離心，取上清液，緩慢滴加至5mL含50mg卵清蛋白的碳 酸鈉緩沖水溶液中，所述碳酸鈉緩沖水溶液的濃度為〇. lmol/L，4°C攪拌72小時，得環丙沙 星-丙氨-卵清蛋白。
[0030] 進一步的，本發明公開了上述制備方法得到的環丙沙星-丙氨-卵清蛋白，或作為 環丙沙星-丙氨-卵清蛋白抗原和環丙沙星-丙氨-卵清蛋白包被抗原；以及以所述環丙沙 星-丙氨-卵清蛋白作為抗原免疫新西蘭兔制備環丙沙星抗體，進而制備環丙沙星檢測試劑 盒的用途。
[0031] 本發明合成了丙氨環丙沙星半抗原，經過ESI-MS、IR和1H-NMR與 13C-匪R對合成的 半抗原進行了確證，為進一步建立的ELISA檢測方法提供了必要的半抗原結構信息。該半抗 原可利用其遠離抗原決定簇結合位點的-NH 2與蛋白載體上氨基的偶聯，制備出理想的人工 抗原。
[0032] 同時，本發明合成了環丙沙星-丙氨-卵清蛋白抗原，以及環丙沙星-丙氨-牛血清 蛋白抗原，并通過紫外吸收光譜法鑒定了結構。可將本發明制備的人工抗原免疫新西蘭白 兔，獲得環丙沙星抗體，以制備環丙沙星檢測試劑盒。
[0033]抗體通常對遠離聯結位點的半抗原部分具有較好的識別能力，因此半抗原與載體 蛋白的偶聯位置最好遠離重要的抗原決定簇。環丙沙星母環上的6位F原子、4位羰基和3位 羧基官能團是抗體識別過程中起重要作用的部分，在哌嗪環上鏈接一個側鏈，使偶聯位置 遠離抗原決定簇有利于獲得效價高、特異性好的抗體。因此，在制備環丙沙星免疫原的過程 中，我們保留了環丙沙星的的6位F原子、4位羰基和3位羧基官能團。本發明通過在遠離6位 F、4位羰基和3位羧基官能團的哌嗪環位點鏈接一個側臂(又稱間隔臂)后得到半抗原后，再 制備環丙沙星抗原。
[0034]包被抗原中的半抗原和蛋白載體(BSA、0SA等）間的間隔臂長度對特異性抗體的產 生有較大影響，選擇適當的間隔臂可進一步促進免疫系統對半抗原部分的識別，進而產生 更高特異性的抗體。本發明的合成包被原，由于選擇了恰當的間隔臂形式(丙氨）制備得到 了半抗原，以及采用特定的制備包被抗原的方法，這與直接使用環丙沙星制備得到的包被 抗原、以及與環丙沙星其他形式的半抗原制備得到的包被抗原相比，經過免疫新西蘭兔，得 到了專屬性和靈敏度更高的抗血清和抗體，顯著提高了ELISA檢測的準確度和靈敏度。 [0035] 說明書【附圖說明】：
[0036]圖1丙氨環丙沙星的紅外光譜
[0037]圖2:丙氨環丙沙星的電噴霧質譜圖譜(ESI-MS)
[0038]圖3:丙氨環丙沙星的碎片m/z389的電噴霧質譜圖譜(ESI-MS)
[0039] 圖4丙氨環丙沙星的1H-核磁共振圖譜PH-NMR)
[0040] 圖5丙氨環丙沙星的13c-核磁共振圖譜(I3c--NMR)
[0041] 圖6:環丙沙星-丙氨、環丙沙星-丙氨-牛血清蛋白、牛血清蛋白的紫外吸收光譜
[0042] 圖7:環丙沙星-丙氨、環丙沙星-丙氨-卵清蛋白、卵清蛋白的紫外吸收光譜 [0043]以下為【具體實施方式】
[0044]實施例1、丙氨環丙沙星的制備
[0045] 取鹽酸環丙沙星0.33g(lmmol)，溶于lOmlDMF溶液中，80°C攪拌溶解，逐滴加入氫 溴酸3-溴丙氨0.26g(l.2mmol)，80°