一種高效液相色譜法測定細菌對菲的降解的方法
【技術領域】
[0001 ] 本發明屬于高效液相色譜法測定細菌對菲的降解的方法技術領域。
【背景技術】
[0002] 回收率是評價一種從前處理到色譜測定結束的分析方法可靠程度的直接指標。現 有的用高效液相色譜方法測定多環芳烴（包括菲）的方法，多為測定環境水體或者土壤中 的多環芳烴含量，也有相應測定水體或土壤的國標方法。此類方法涉及到的環境水體或土 壤在前處理過程中，幾乎沒有乳化的現象，所以國標方法得到的回收率通常較高。而在實驗 室人工培養細菌對菲的降解實驗中，由于菲濃度設定的高，加之細菌生長過程中代謝復雜， 產生大量代謝物質，使得萃取過程中產生高度乳化形象，乳化層蓄留了大量菲，若按照檢測 水體中菲的國標方法進行，最后的回收率大多不足50%。此外，現有的測定方法提及的多為 采用二氯甲烷或正己烷作為助溶劑，添加到培養基后助溶劑揮干后難溶性的菲會析出為固 體漂浮在液面，與細菌接觸并不充分，不均勻，從而會影響細菌對菲的利用程度。
【發明內容】
[0003] 本發明通過多次實驗設計，獲得了一套適宜的前處理方法，解決此類科研實驗中 現有技術存在的問題，且提高了方法的回收率，本發明采用如下技術方案實現：
[0004] (1)活化菌種：從平板中挑取少量芽孢桿菌（Bacillus. sp)Y2菌株到牛肉膏蛋白 胨液體培養基，置于人工氣候振蕩培養箱培養；
[0005] (2)接種培養：將細菌活化擴大培養后，用無機鹽培養基洗滌并重懸，然后接種到 無機鹽培養基的三角瓶中，置于人工氣候振蕩培養箱培養；
[0006] (3)取樣：定時取樣20ml~50ml的菌液到分液漏斗中，向漏斗中加入一定量的用 乙醇溶解完全的菲；
[0007] ⑷液液萃取：向分液漏斗中加入2~5ml的二氯甲燒，上下劇烈搖動5分鐘左右， 期間不斷放氣。靜置2~6分鐘后，收集有機相于玻璃瓶中，重復三次萃取；最后一次收集 有機相后，棄水相，用1~2ml二氯甲烷沖洗分液漏斗。
[0008] (5)濃縮定容：將收集到的有機相用旋轉蒸發儀揮干后，加入甲醇充分溶解固體 物質。濃縮甲醇定容到〇. 5~lml，經0. 22um有機濾頭過濾后，用高效液相色譜檢測菲的含 量。
[0009] (6)定量：配制一系列濃度的菲標準品溶液，相同色譜條件檢測菲的含量，采用外 標法求得樣品的菲含量，與理論值作對比，求得降解率。
[0010] 本發明涉及到的一種高效液相色譜法測定細菌對菲的降解情況的方法，在振蕩萃 取過程中會產生高度乳化現象，蓄留了大量菲，本方法采用離心破乳，收集乳化層于離心管 中，4°C離心10~20min ;離心后明顯的分為了雜質層和有機相層，用吸管吸取有機相到玻 璃瓶中；棄雜質，用1~2ml二氯甲烷沖洗離心管，有機相匯集到玻璃管中。
[0011] 本發明涉及到的一種高效液相色譜法測定細菌對菲的降解情況的方法，經過液相 色譜檢出后，回收率可達到80 %以上。
[0012] 本發明涉及到的一種高效液相色譜法測定細菌對菲的降解情況的方法，用乙醇作 為助溶劑溶解菲，再添加到培養基中，不會析出形成白色固體漂浮物，這樣可以增大菲于細 菌的接觸，同時乙醇濃度不高于〇. 05%時，對細菌生長幾乎沒有影響。
[0013] 本發明至少具有以下優點：第一，本法提高了實驗方法的回收率，保證方法的可靠 可行；第二，在振蕩萃取過程中會產生高度乳化現象，蓄留了大量菲，本方法采用離心破乳， 收集乳化層于離心管中，低溫離心10~20min，離心后明顯的分為了雜質層和有機相層，盡 可能收集有機相；第三，用乙醇作為助溶劑溶解菲，再添加到培養基中，不會析出形成白色 固體漂浮物，這樣可以增大菲與細菌的接觸，同時乙醇濃度不高于0. 05%時，對細菌生長幾 乎沒有影響。
【具體實施方式】
[0014] 下面就具體實驗結果對本發明做進一步闡釋和補充，如下。
[0015] 1、實施例一
[0016] (1)活化菌種：從平板中挑取少量芽孢桿菌（Bacillus. sp)Y2菌株到牛肉膏蛋 白胨液體培養基，置于人工氣候振蕩培養箱培養，培養環境為：溫度30 °C，150r/min，培養 12h〇
[0017] (2)接種培養：將細菌活化擴大培養后0D600達到0. 8,用無機鹽培養基洗滌并 重懸后，接種到無機鹽培養基的三角瓶中，以空白不加菲為對照，設置三個平行，細菌接種 量為10ml，總體積為200ml，助溶劑乙醇比例為0. 05%。置于搖床培養，培養環境為：溫度 30°C，150r/min，培養時間為 72h ;
[0018] (3)取樣：在0h，24h，48h，72h取樣30ml菌液到125ml聚四氟乙烯分液漏斗中，向 其中加入一定量的菲，使其終濃度為50ug/L。
[0019] ⑷液液萃取：向分液漏斗中加入5ml二氯甲烷。上下劇烈搖動5分鐘，期間不斷 放氣。靜置5分鐘后，收集有機相于20ml玻璃瓶中，重復三次萃取。最后一次收集有機相 后，棄水相，用2ml二氯甲烷沖洗分液漏斗。
[0020] (5)離心破乳：在振蕩萃取過程中產生高度乳化層，收集乳化層于離心管中， 10000r/min，4°C離心15min。離心后明顯的分為了雜質層和有機相層，用吸管吸取有機相到 玻璃瓶中。棄雜質，用2ml二氯甲烷沖洗離心管，有機相匯集到玻璃瓶中。
[0021] (6)濃縮定容：將收集到的有機相用旋轉蒸發儀揮干后，加入甲醇充分溶解固體 物質。濃縮甲醇定容到〇. 5ml，經0. 22um有機濾頭過濾后，用液相色譜檢測菲含量。
[0022] (7)高效液相色譜檢測，條件如下：
[0023] 流動相：0min 80%甲醇+20%雙蒸水
[0024] 15min 100% 甲醇+0%雙蒸水
[0025] 流速：lml/min 波長：254nm 進樣量：50ul 柱溫：35°C
[0026] (8)定量：配制濃度為 10ug/L，20ug/L，30ug/L，40ug/L，50ug/L，60ug/L 的菲標準 品溶液，相同色譜條件檢測菲的含量，采用空白加標法求得樣品的菲含量，與理論值投入值 作對比，求得回收率。
[0027] 本發明在菲濃度為50ug/L時，在細菌生長Oh測得回收率為81. 58%，在24h時測 得回收率為82. 36%，在48h時測得回收率為83. 43%，在72h時測得回收率為81. 97%，平 均回收率為82. 335%。
[0028] 2、實施例二
[0029] (1)活化菌種：從平板中挑取少量芽孢桿菌（Bacillus. sp)Y2菌株到牛肉膏蛋 白胨液體培養基，置于人工氣候振蕩培養箱培養，培養環境為：溫度30 °C，150r/min，培養 12h〇
[0030] (4)接種培養：將細菌活化擴大培養后0D600達到0. 8,用無機鹽培養基洗滌并 重懸后，接種到無機鹽培養基的三角瓶中，以空白不加菲為對照，設置三個平行，細菌接種 量為10ml，總體積為200ml，助溶劑乙醇比例為0. 05%。置于搖床培養，培養環境為：溫度 30°C，150r/min，培養時間為 72h ;
[0031] (5)取樣：在0h，24h，48h，72h取樣30ml菌液到125ml聚四氟乙烯分液漏斗中，向 其中加入一定量的菲，使其終濃度為500ug/L。
[0032] ⑷液液萃取：向分液漏斗中加入5ml二氯甲烷。上下劇烈搖動5分鐘，期間不斷 放氣。靜置5分鐘后，收集有機相于20ml玻璃瓶中，重復三次萃取。最后一次收集有機相 后，棄水相，用2ml二氯甲烷沖洗分液漏斗。
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