專利名稱：高流通量分子轉子黏度測定法測定的制作方法
技術領域：
本組合物和方法涉及實時測定懸液中黏度變化的速率。該組合物和方法具有廣泛的應用，包括測量淀粉酶介導的淀粉懸液的液化。
背景技術：
旋轉黏度計是實驗室中用于評估a-淀粉酶的淀粉液化性能的標準工具。但是，獲得旋轉黏度計數據的過程緩慢，且需要大量的酶，使得旋轉黏度計測定不適于用作エ業 蛋白質工程的主要篩選方法。備選的直接測量黏度變化的小規模測定常給出錯誤或不可預測的結果，也使得它們不適于用作主要篩選方法。因此，存在對更方便、更準確和更可重復的黏度測定的需要。
發明概述所描述的是用于實時測定懸液黏度變化的高流通量分子轉子(molecular rotor)黏度測定法測定。該方法一般涉及將分子轉子加至包含能夠轉化為產物的底物的懸液，其中底物向產物的轉化改變了懸液的黏度；將酶或化學催化劑加至懸液以起始底物向產物的轉化；和測量分子轉子的熒光(RFU);其中可以使分子轉子的熒光變化與懸液的黏度變化相關。此黏度變化可以進一歩用于測定黏度變化的速率、底物向產物轉化的速率、轉化為產物的底物的量等。在一方面，提供用于實時測定懸液黏度變化的方法，其包括向包含底物的懸液加入分子轉子分子，和能夠將底物轉化為產物的酶或化學催化劑，該底物能夠轉化為產物，該分子轉子分子的熒光量子產率依賴于懸液自由體積；和實時測量懸液中分子轉子分子的熒光；其中底物向產物的轉化改變了通過測量分子轉子分子的熒光測定的懸液自由體積，且其中懸液自由體積的變化與溶液黏度的變化相關。在一些實施方案中，用懸液黏度的變化來測定底物向產物轉化的速率。在ー些實施方案中，用懸液黏度的變化來測定轉化為產物的底物的量。在一些實施方案中，該懸液是淀粉懸液。在一些實施方案中，該懸液是玉米支鏈淀粉懸液。在其他實施方案中，該懸液是纖維素懸液，或混合的淀粉和纖維素懸液。在一些實施方案中，該酶是糖類加工酶。在一些實施方案中，該酶是淀粉酶、葡糖淀粉酶、支鏈淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶或其組合。在具體實施方案中，該酶是淀粉酶。在一些實施方案中，底物向產物的轉化是淀粉酶介導的產生低分子量葡聚糖的淀粉懸液的液化。在一些實施方案中，該分子轉子分子是9-(2-羧基-2-氰基こ烯基)-久洛尼定(CCVJ)。
在一些實施方案中，以多孔形式進行該方法。在具體實施方案中，以6孔、12孔、24孔或96孔形式進行該方法。組合物和方法的這些和其他方面及實施方案將由于描述和附圖
而顯而易見。
附圖簡述圖I顯示淀粉水解反應中分子轉子熒光(RFU)的減少作為時間(秒)的函數的曲線。突光減少與淀粉水解引起的懸液黏度減小相關。圖2顯示用常規旋轉黏度計測定獲得的峰值黏度數據，其確認了用分子轉子黏度 測定法測定獲得的結果。
發明詳述
I.定義在詳細描述本組合物和方法之前，為了清楚而定義以下術語和短語。應賦予未定義的術語和短語它們在本領域中使用的普通含義。本文中使用的“分子轉子分子”或簡單的“分子轉子”是熒光化學實體，其熒光量子產率(即發射的光子數除以吸收的光子數)依賴于其微環境，例如懸液中的自由體積。本文中使用的術語“實時”指在事件發生時對它進行測量。本文中使用的術語“淀粉”指包含具有通式(C6HltlO5)n的多糖的物質，其中多糖的糖取代基主要通過a -D-(I — 4)和/或a -D-(I — 6)糖苷鍵連接。本文中使用的術語“纖維素”指包含具有通式(C6HltlO5)n的多糖的物質，其中多糖的糖取代基主要通過β -D-(I — 4)糖苷鍵連接。本文中使用的術語“糖類加工酶”指能夠水解存在于淀粉和/或纖維素組合物中的至少一種成分的任意酶。示例性酶包含淀粉酶、葡糖淀粉酶、支鏈淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶及其組合。本文中使用的術語“淀粉酶”或“淀粉分解酶”指能夠催化淀粉的降解等的酶。淀粉酶是切割淀粉中a -D-(I — 4) O-糖苷鍵的水解酶。一般而言，α -淀粉酶(EC 3. 2. I. I ；a-D-(I— 4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)定義為以隨機方式切割淀粉分子內a-D-(l —4)O-糖苷鍵的內切酶。相反，外切淀粉分解酶，如β-淀粉酶(EC 3. 2. 1.2 ;a-D-(l —4)-葡聚糖麥芽糖水解酶)和一些產物特異性淀粉酶，如產麥芽糖a -淀粉酶(EC 3. 2. I. 133)從底物的非還原端切割淀粉分子。β -淀粉酶、a -葡糖苷酶(EC 3. 2. 1.20 ； a -D-葡糖苷葡糖水解酶)、葡糖淀粉酶(EC 3.2. 1.3 ；a -D-(I — 4)-葡聚糖葡糖水解酶)和產物特異性淀粉酶可以從淀粉產生特定長度的麥芽糖寡糖。本文中使用的術語“纖維素酶”或“纖維素分解酶”指能夠將纖維素聚合物水解為較短的纖維寡糖寡聚物、纖維二糖和/或葡萄糖的一類酶。本文中使用的術語“多孔形式”指涉及常見固相支持體，例如6孔板、12孔板、24孔板或96孔板上的樣品矩陣的測定排列。除非另有說明，冠詞“一”、“一個”和“該”指單數指代物和復數指代物二者。本文中引用的所有參考文獻在此以其整體引入作為參考。
II.高流通量分子轉子黏度測定法測定用市售分子轉子研發了高流通量分子轉子黏度測定法測定來監測淀粉底物的液化。一般而言，分子轉子是熒光種類，其量子產率(即發射的光子數除以吸收的光子數)依賴于與微環境黏度相關的微環境自由體積。對于這類分子，從激發態弛豫的優選方式是分子內旋轉，分子內旋轉以與微環境黏度成比例的量受抑制。能量平衡通過可以測量的輻射弛豫(熒光發射)逸散，從而允許計算微環境黏度。為了測量由對底物的酶活性引起的黏度降低的速率，將分子轉子CCVJ(9-(2-羧基-2-氰基こ烯基)久洛尼定)摻入玉米支鏈淀粉的緩沖懸液，然后將其分配至96孔板的孔。然后將一定量的許多a -淀粉酶多肽之一加至含有CCVJ/玉米支鏈淀粉懸液的不同孔，以起始酶促淀粉水解反應。在室溫下在以動態模式運行的Spectramax M2 96孔突光計中進行反應，實時進行數據收集。測定中使用的試劑的配制和實驗方案描述于實施例中。通過測量來自CCVJ的熒光信號的降低速率來測定由酶促淀粉水解引起的黏度降低速率。Spectramax儀器的配套軟件Softmax Pro自動將突光信號降低的動態速率計算為“Vmax (毫單位/分鐘)”。圖I中顯示了涉及酶介導的熒光(黏度)降低的原始動力學數據對時間的曲線。熒光(RFU，y軸)減少的速率與淀粉酶介導的黏度降低的速率成比例。就淀粉水解活性而言，更低的值指示更好的性能。27個變體a-淀粉酶在分子轉子測定中顯示優于野生型酶的性能。 為了確定分子轉子測定的結果是否準確反映了變體a -淀粉酶的淀粉水解活性，用常規旋轉黏度計測定評價了相同的變體a-淀粉酶。顯示酶劑量和所獲得的峰值黏度值的表格顯示于圖2中。用更麻煩的旋轉黏度計測定確認了在分子轉子測定中顯示優越性能的27個變體中的24個具有優越的性能。這些結果顯示了該方法的功效和準確性。用于本測定中的示例性分子轉子包括但不限于9-(2-羧基-2-氰基こ烯基)-久洛尼定(CCVJ)和9-( ニ氰基こ烯基)-久洛尼定(DCVJ)及其烷基酷、I-(2-羥こ基)-6_[ (2, 2_ 二氛)こ稀基]-2, 3,4_ 二氧喧琳(DCQ)、4,4' -ニ氣-4-砸 _3a, 4a_ 重氣基-s-indacene、硫黃素T(ThT)、對-[(2-氰-2-丙ニ醇酯)こ烯基]ニ甲基苯胺等。
用途本測定允許直接實時監測懸液中黏度降低的動態速率。速度、簡單性、穩健性、重復性和自動化可行性使得該測定很適于高流通量篩選，其中可以以比常規旋轉黏度計測定快約1，000倍的速率產生數據。該測定的用途包括測量產生反應混合物懸液黏度變化的酶介導的反應和其他反應中的黏度變化。示例性反應是淀粉酶介導的產生低分子量葡聚糖的淀粉懸液的液化。相關反應涉及葡糖淀粉酶、支鏈淀粉酶、淀粉酶或其組合介導的淀粉懸液的液化，及纖維素酶、半纖維素酶或其組合介導的纖維素懸液的液化。
實施例通過將186 U L ニ 甲基亞諷加至含有 5mg 凍干 CCVJ (Sigma Aldrich Corporation,St. Louis, MO)的管中來制備IOOmM的CCVJ儲液。CCVJ儲液在室溫下避光保存，并在使用前檢查沉淀。將90g來自玉米的支鏈淀粉(MP Biomedicals LLC, Solon, 0H)加至2，850 y L蒸餾水，恒速攪拌加熱至沸騰，支鏈淀粉在該條件下逐漸膠凝化和溶解。將產生的黏度均一的5%膠凝化支鏈淀粉懸液從熱源移開，并在它回到室溫時繼續攪拌，此時加入150mLIMこ酸鈉緩沖液(pH 5. 8)(之前通過用IMこ酸滴定IMこ酸鈉配制)，然后加入150 u LTween-80 (Sigma Aldrich Corporation, St. Louis,MO) Tween-80完全溶解時，加入 150 u LIOOmM CCVJ儲液并溶解(5 μ M終濃度)，此時完成支鏈淀粉/CCVJ試劑配制備用。該試劑在室溫下保存于透明玻璃瓶中，在完成黏度測定法篩選測定所需的三天期間恒速攪拌。通過裝配了能夠同時對96孔微量滴定板的全部96個孔進行移液的多通道頭部的Biomek FXp機器人來進行所有液體操作。向黑色未處理的聚苯乙烯96孔微量滴定板(Corning Incorporated, Corning, NY)的各孔加入60 μ L支鏈淀粉/CCVJ試劑。吸取30 μ L酶(IOOppma -淀粉酶)樣品至其頂部,并立即在如下設置的Spectramax M2e突光計(Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA)上讀數頂部讀數突光模式；激發波長435納米(nm);發射波長495nm ;臨界波長455nm ;動態讀數模式，24秒讀數間隔；最初讀數前振動15秒，讀數間振動3秒；192秒總讀數時間，20秒停滯期(從各動態速率計算去除所收集的9個數據中的第一個)。典型的結果顯示在圖I中。根據用分子轉子黏度測定獲得的結果，將27個α-淀粉酶變體鑒定為具有高水平的淀粉液化活性。將數據與用標準旋轉黏度計測定獲得的那些比較，這確認了變體中的24個具有高水平的淀粉液化活性(圖2)，表明分子轉子測定的準確性。 本組合物的其他特征、方面和實施方案將由于描述和附圖而顯而易見。
權利要求
1.用于實時測定懸液黏度變化的方法，其包括 向包含底物的懸液加入分子轉子分子，和能夠將底物轉化為產物的酶或化學催化劑，所述底物能夠轉化為產物，所述分子轉子分子的熒光量子產率依賴于懸液自由體積；和實時測量懸液中分子轉子分子的熒光； 其中底物向產物的轉化改變了通過測量分子轉子分子的熒光測定的懸液自由體積，且其中懸液自由體積的變化與溶液黏度的變化相關。
2.權利要求I的方法，其中用懸液黏度的變化來測定底物向產物轉化的速率。
3.權利要求I的方法，其中用懸液黏度的變化來測定轉化為產物的底物的量。
4.前述權利要求中任一項的方法，其中所述懸液是淀粉懸液。
5.前述權利要求中任一項的方法，其中所述懸液是玉米支鏈淀粉懸液。
6.前述權利要求中任一項的方法，其中所述酶是糖類加工酶。
7.權利要求6的方法，其中所述酶是淀粉酶。
8.權利要求I的方法，其中所述底物向產物的轉化是淀粉酶介導的產生低分子量葡聚糖的淀粉懸液液化。
9.前述權利要求中任一項的方法，其中所述分子轉子分子是9-(2-羧基-2-氰基乙烯基)-久洛尼定(CCVJ)。
10.前述權利要求中任一項的方法，其以多孔方式進行。
全文摘要
用于實時測定懸液黏度變化的方法，其包括向包含底物的懸液加入分子轉子分子，和能夠將底物轉化為產物的酶或化學催化劑，該底物能夠轉化為產物，該分子轉子分子的熒光量子產率依賴于懸液自由體積；和實時測量懸液中分子轉子分子的熒光；其中底物向產物的轉化改變了通過測量分子轉子分子的熒光測定的懸液自由體積，且其中懸液自由體積的變化與溶液黏度的變化相關。
文檔編號G01N11/14GK102803924SQ201080024294
公開日2012年11月28日 申請日期2010年5月25日 優先權日2009年6月5日
發明者S-K·李, S·W·拉默, A·R·托波扎達 申請人:丹尼斯科美國公司