專利名稱：一種紫菜可控酶解后的抗氧化活性肽的純化及分析鑒定方法
一種紫菜可控酶解后的抗氧化活性肽的純化及分析鑒定方法技術領域
一種紫菜可控酶解產抗氧化活性肽的純化及分析鑒定方法，屬于生物制品分離純化技術領域。
背景技術：
酶制劑已廣泛應用在食品、釀造、制藥、有機酸、淀粉糖、飼料工業、紡織、皮革、洗滌劑及保健品等各個領域，應用領域越來越廣泛，食品與人們的生活密切相關，因此酶在食品工業中的應用價值越來越重要，目前在烘焙、奶制品、肉類加工、新型營養食品和蛋白質的水解中得到很大的體現。
酶解蛋白質生產多肽已成為當今研究熱門，通過不同的酶切方式可以獲得不同功能的活性多肽，尤其是開發一些寡肽物質，成為蛋白質研究中的一個新領域。
紫菜具有較高的食療藥用價值，紫菜提取液具有降血脂，防止動脈粥樣硬化的功能。我國沿海大量養殖紫菜，一般末水條斑紫菜因口感較差往往售價很低。但其蛋白質含量仍然在25%左右、另外還含有多糖、瓊脂、VC、各種礦物質等。目前紫菜的主要利用途徑是制成海苔休閑食品，深加工產品較少，不斷開展對紫菜的深加工和綜合利用顯得尤為迫切和必要。
由紫菜蛋白經過酶解產生紫菜多肽，分子量介于蛋白質與氨基酸之間，是以小分子肽為主、多種功效成分共存的蛋白質水解產物，可100%吸收入血液循環。將紫菜的各類功能因子用來加工功能性食品已經成為紫菜深度開發利用的重要方向。
本實驗室研究制備的固體氨肽酶為外肽酶，可以從多肽鏈的N端解離氨基酸，該枯草芽孢桿菌所產氨肽酶酶系較為單一，它具備與多種內切性蛋白酶復配應用的潛力。經本實驗室研究該氨肽酶與中性蛋白酶復合酶解末水條斑紫菜，可得到相對較高的水解度， 具有較小分子量，穩定性好，能夠有效清除自由基的抗氧化活性肽。發明內容
本發明目的是提供一種紫菜可控酶解產抗氧化活性肽的純化及分析鑒定方法，該紫菜抗氧化活性肽具有較小分子量，穩定性好，能夠有效清除自由基，其抗氧化活性均保持在60%以上，溫度耐受性也較好，可作為食源性抗氧化劑，在保健食品，醫藥和化妝品領域有廣泛的應用前景。
本發明的技術方案枯草芽孢桿菌Zj016固體氨肽酶(中國專利201010578579. 1已公開，公開號 CN102078012A，
公開日2011-6-1)和商品化中性蛋白酶復配酶解紫菜，制備紫菜抗氧化多肽粗品。該粗品利用kphadex G-IO、DEAE-52和SOURCE 3RPC等色譜手段分離純化，得到酶解紫菜抗氧化活性肽。通過測定DPPH消除能力、清除超氧自由基能力，清除羥自由基能力和還原力來綜合反映紫菜抗氧化肽的抗氧化性。經反相高效液相(RP-HPLC)分析型色譜測定其純度，超高效液相色譜-質譜法OhTOF-MQ分析鑒定其氨基酸組成，并對其穩定性進行研究。
提取工藝為A一種枯草桿菌固體氨肽酶在紫菜復配酶解中的應用(1)將一種末水條斑紫菜撕成小塊，放入培養皿中；將培養皿放入烘箱中，于105°C的條件下烘干MT^i至恒重；取出將干品放入粉碎機中研碎，得到紫菜粉末。
(2)以紫菜粉末為底物，以pH8. 5 Na2HPO4-KH2POdl沖液為介質，底物與緩沖液的比例為1 30，中性蛋白酶加入量為E/S=lX 105-2X 105 U/g，固體氨肽酶加入量為E/ S=IXlO4-2X104U/g。50°C水解6 h，80°C滅酶15 min，加入乙醇至體系乙醇體積分數為 60%。室溫靜置12 h，10000 r/min離心10 min，得到的上清液為含抗氧化紫菜多肽的混合物。
B酶解紫菜抗氧化活性肽的分離純化及鑒定方法(1)將紫菜多肽混合物通過大孔樹脂DlOl脫色后，冷凍干燥得到淡黃色多肽粉末。將該淡黃色多肽粉末經a^phadex G-IO凝膠層析，流動相為0. 1 mol/L NaCl，流速0.1 mL/ min,收集峰組分，冷凍干燥，得到淺黃色多肽粉末。
(2) DEAE-52離子交換層析步驟(1)所得多肽粉末進行離子交換層析，采用階段洗脫的方法，流動相0 250 min 0.1 mol/L NaCl, 250^400 min 0.2 mol/L NaCl, 40(T550min 0. 3 mol/L NaCl 和 550 650min 0. 4 mol/L NaCl 的 ρΗ8· 5 Na2HPO4-KH2PO4 緩沖液，進樣量為20 mL，流速1 mL/min，檢測波長為220 nm，收集峰組分，冷凍干燥；(3)SOURCE 3RPC ST4. 6/100反相層析步驟( 所得多肽粉末進行反相層析，流動相為A 含0. 1%三氟乙酸的10%-15%乙腈溶液；B 含0. 1%三氟乙酸的80%-75%乙腈溶液；梯度洗脫程序0 20 min 100% A ;20 40 min 100%A 100%B ;40 60 min 100%B，進樣量為 2 mL，流速1.5 mL/min，檢測波長為220 nm，收集濃縮的峰組分，得到酶解紫菜抗氧化活性肽；(4)利用反相高效液相(RP-HPLC)分析型色譜測定該白色的酶解紫菜抗氧化活性肽純度達87. 44%。超高效液相色譜一質譜法Ο -TOF-MS)分析鑒定為一種六肽DGVGYG (Asp-Gly-Val-Gly-Tyr-Gly) 結果如圖 2。
C酶解紫菜抗氧化活性肽的穩定性紫菜抗氧化活性肽分別在60°C，8(TC及100°C的水浴環境中放置2小時，立即用冰水冷卻，其抗氧化活性均保持在60%以上，溫度耐受性較好。結果如圖3，圖4。
氨肽酶的酶活LNA法測定。測定時，首先配1Tris-HCl緩沖液，取6. 075g 1Tris溶于900mL蒸餾水，用濃 HCl調至pH8. 5，然后定容至1L。以L-亮氨酸對硝基苯胺L-leu-pNA作為底物，取0. Ig底物溶于ImL酒精，然后用Tris-HCl緩沖液定容到100mL。取0. Ig固體氨肽酶粉用Tris-HCl 緩沖液定容到IOOmL作為待測酶液。加入2mL的Tris-HCl緩沖液和ImL底物(L-亮氨酸對硝基苯胺L-leu-pNA)，一個加入ImL酶液，另一個加入ImL Tris-HCl緩沖液作為對照， 在50°C水浴反應IOmin后，405nm比色測定酶活。
酶活公式酶活=AX105.7X4Xn/10其中A為待測酶液的吸光度；η為待測酶液的稀釋倍數。
酶活力定義50°C，每分鐘分解L-亮氨酸-對硝基苯胺產生1微摩爾的對硝基苯胺所需酶量即為一個酶活單位。
測定樣品對DPPH (二苯代苦味胼基)自由基的清除率采用消除DPPH自由基法。取2mL待測樣品，加入2mL質量濃度為0. 04g/L的DPPH 無水乙醇溶液，混合均勻后反應20min，在轉速3500 r/min下，離心lOmin，取上清液，在波長517nm處測其吸光度為Ai ；另取2mL待測樣品于試管中，分別加入無水乙醇2 mL，反應 20min,在轉速3500r/min下離心lOmin，取上清液，在波長517nm處測其吸光度為Aj ；以2mL 質量濃度0. 04g/L的DPPH ·無水乙醇溶液和2mL無水乙醇反應作為參比，其在波長517nm 處吸光度記為Atl，按照下列式子計算樣品對DPPH自由基的清除率
權利要求
1. 一種紫菜可控酶解后的抗氧化活性肽的分離純化、鑒定方法，其特征在于(1)以烘干到恒重的末水條斑紫菜粉末為底物，以PH8.5 Na2HPO4-KH2PO4緩沖液為介質，底物與緩沖液的質量比例為1:30，中性蛋白酶加入量為E/S=lX 105-2X 105U/g，固體氨肽酶加入量為E/S=lX 104 -2X 104U/g，5(rC水解6 h，80°C滅酶15min，加入乙醇至體系乙醇體積分數為60%，室溫靜置12h，10000 r/min離心lOmin，得到的上清液為含紫菜抗氧化多肽粗品；(2)將紫菜抗氧化多肽粗品通過大孔樹脂DlOl脫色后，冷凍干燥得到淡黃色多肽粉末，將該淡黃色多肽粉末依次經過kphadex G-10、DEAE-52和SOURCE 3RPC ST4. 6/100進一步分離純化后，得到紫菜抗氧化活性肽；a)Sephadex G_10凝膠層析脫色后的多肽粉末進行凝膠層析，流動相為0. 1 mol/L NaCl，流速0. 1 mL/min，收集峰組分，冷凍干燥，得到淺黃色多肽粉末；b)DEAE-52離子交換層析步驟a)所得多肽粉末進行離子交換層析，采用階段洗脫的方法，流動相:0 250 min 0. 1 mol/L NaCl,250^400 min 0.2 mol/L NaCl，400 550min 0.3 mol/L NaCl 和 550 650min 0.4 mol/L NaCl 的 pH8. 5 Na2HPO4-Iffl2PO4 緩沖液，進樣量為 20 mL，流速1 mL/min，檢測波長為220 nm，收集峰組分，冷凍干燥；c)SOURCE 3RPC ST4. 6/100反相層析步驟b)所得多肽粉末進行反相層析，流動相為 A 含0. 1%三氟乙酸的10%-15%乙腈溶液；B 含0. 1%三氟乙酸的80%-75%乙腈溶液；梯度洗脫程序0 20 min 100% A ；20 40 min 100%A 100%B ；40 60 min 100%B，進樣量為 2 mL, 流速1. 5 mL/min，檢測波長為220 nm，收集濃縮的峰組分，得到酶解紫菜抗氧化活性肽；當其濃度為100 μ g/mL時，對超氧自由基、DPPH和羥自由基的清除率依次為超過20%， 45%，45%，還原能力為VC的1倍以上，有很強的抗氧化性；(3)分析鑒定將所得酶解紫菜抗氧化活性肽進行反相高效液相RP-HPLC分析型色譜測定，其純度達85%以上；超高效液相色譜一質譜法Q-TOF-MS分析鑒定為一種六肽 DGVGYG=Asp-Gly-Val-Gly-Tyr-Gly ；(4)溫度耐受性將所得酶解紫菜抗氧化活性肽分別在60°C，80°C及100°C的水浴環境中放置2小時，立即用冰水冷卻，其抗氧化活性均保持在60%以上。
全文摘要
一種紫菜可控酶解后的抗氧化活性肽的純化及分析鑒定方法，屬于生物制品分離純化技術領域。本發明涉及枯草芽孢桿菌Zj016氨肽酶和中性蛋白酶復配酶解一種成本低廉的末水條斑紫菜，得到紫菜抗氧化多肽粗品。該粗品利用SephadexG-10、DEAE-52和SOURCE3RPC等色譜手段分離純化，得到酶解紫菜抗氧化活性肽。通過測定DPPH消除能力，清除超氧自由基能力，清除羥自由基能力和還原力來綜合反映紫菜抗氧化活性肽的抗氧化性。經RP-HPLC分析型色譜測定其純度，Q-TOF-MS分析鑒定其氨基酸組成，并對其抗氧化活性的穩定性進行研究。該紫菜抗氧化活性肽具有較小分子量，穩定性好，能夠有效清除自由基，可作為食源性抗氧化劑，在保健食品，醫藥和化妝品領域有廣泛的應用前景。
文檔編號G01N1/34GK102495169SQ20111036265
公開日2012年6月13日 申請日期2011年11月16日 優先權日2011年11月16日
發明者姚翔, 田亞平 申請人:江南大學