專利名稱：用磁性納米粒子固定葡萄糖氧化酶測定痕量葡萄糖的方法
技術領域：
本發明涉及一種利用磁性納米粒子固定葡萄糖氧化酶的電致化學發光技術快速測定痕量葡萄糖的方法，可用于人血液中葡萄糖含量的測定。
背景技術：
葡萄糖是生物體內新陳代謝不可缺少的營養物質。它的氧化反應放出的熱量是人類生命活動所需能量的重要來源。作為人體的基本元素和最基本的醫藥原料，它的作用和用途十分廣泛，既可直接應用于人體，又可用于食品加工和醫藥化工。它能迅速增加人體能量、耐力、可用作血糖過低、感冒發燒、頭暈虛脫、四肢無力及心肌炎等癥的補充液，對癌癥也有一定的治療作用。
實現葡萄糖的快速定量檢測在生物化學、臨床化學以及食品分析等領域具有重要意義。迄今為止，已有許多有關葡萄糖檢測方法的報道，如電化學檢測，表面增強拉曼散射光譜檢測，光度法檢測，化學發光檢測和電致發光檢測等。但采用磁性納米粒子固定葡萄糖氧化酶(GOD)的電致發光檢測葡萄糖的傳感器未見報道。電致化學發光也稱為電化學發光，它是通過電化學反應直接或間接引發的化學發光現象，是一類電位控制的電極氧化還原反應。近年發展起來的電致化學發光分析方法，是將電化學技術與化學發光檢測相結合的一種分析方法，兼備二者的優點靈敏度高，線性范圍寬，反應和時空可控性好。發明內容
本發明的目的是提供一種靈敏度高、選擇性好的傳感器，對痕量(如lymol/L)的葡萄糖進行測定的方法。
構思如下研究發現魯米諾與雙氧水體系在電極電壓的作用下能產生非常強的電致化學發光，而魯米諾和雙氧水的濃度對該發光有顯著的正線性關系。當固定魯米諾的濃度，通過葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖間接產生雙氧水時，電致化學發光的強度僅與一定濃度范圍內的葡萄糖呈線性關系，在此基礎上采用磁性納米粒子固定葡萄糖氧化酶(GOD)從而建立了一種測定微量葡萄糖的電致化學發光分析方法。
本發明涉及酶促反應，屬于酶傳感器。當電極表面生成雙氧水時，溶液中的魯米諾與之發生電化學反應，從而產生能發出一定波長的光的激發態物質而發光。光的峰強度ip 在一定范圍內與葡萄糖的濃度成正比。
具體步驟如下
(1)分別截取鐵棒和玻璃管，并把鐵棒和玻璃管的兩端磨平、洗凈；將固體石蠟和碳粉按質量比為2 4 1比例混合，稍加熱至石蠟熔化，攪拌均勻，填入玻璃管中；將鐵棒插入玻璃管的一端中，用石蠟固定住，冷卻后，除去管外多余雜物，并在光滑紙上拋光表面， 為保證足夠大的磁力；玻璃管的另一端電極端為石蠟碳糊薄層，制得固體石蠟碳糊電極； 最后玻璃管石蠟碳糊的薄層的一端碳糊電極在使用前分別用體積比為11的硝酸和無水乙醇清洗，然后用二次蒸餾水沖洗干凈；
(2)稱取 FeCl3 · 6H20 和 FeSO4 · 7H20,以 Fe2+/Fe3+ =1:2 的摩爾比溶解在二次蒸餾水中得混合溶液，滴加體積百分比為25%的氨水使混合溶液pH = 9 12，室溫下攪拌 20 40分鐘，然后升溫到80°C并保持溶液pH = 9 12不變，加熱熟化20 40分鐘；制備的黑色懸浮液超聲10 30分鐘，在磁鐵分離下，用熱水洗滌到中性得磁性納米!^e3O4粒子；
(3)稱取45-55mg步驟⑵所得的磁性納米狗304粒子超聲分散在15_25mL無水乙醇中，攪拌下加入0. 1 0.3mL體積百分濃度為98% Y -氨丙基三乙氧基硅烷，室溫下攪拌反應9 20小時，收集的磁性粒子分別用無水乙醇和二次蒸餾水超聲清洗后定容得氨基化后的磁性納米!^e3O4粒子；
(4)用磁鐵吸住步驟(1)制得的固體石蠟碳糊電極的鐵棒端，取步驟C3)制得的氨基化后的磁性納米!^e3O4粒子滴加在步驟(1)制得的電極表面，晾干后，滴加體積百分濃度為0. 25%的戊二醛在修飾電極表面，放入4°C冰箱1小時后，用水淋洗并吹干，然后滴加葡萄糖氧化酶溶液，放入4°C冰箱中過夜；使用前，把電極置于攪動的蒸餾水中清洗5 10分鐘；每次使用后，移去磁鐵，用蒸餾水沖洗，洗去磁性納米復合葡萄糖氧化酶粒子以便更新電極；電極不用時放入4°C冰箱中保存；
(4)檢測方法
室溫下，選取掃描速率為50mV/s，掃描范圍為+0. 2 +1. 4V(vs. SCE)，光電倍增管高壓600v，采樣速率10T/S，放大級數3，測量時間60s進行循環伏安法試驗，測量不同濃度葡萄糖在含0. 5mmol/L魯米諾的pH為8. 00.的lmol/L硼酸鈉緩沖溶液的電致化學發光的強度，繪制工作曲線；葡萄糖在1.0X10—5 1.0X10-2mol/L濃度范圍內與電致化學發光峰強度呈良好的線性關系ip = 65. 4C+23.9，相關系數R = 0. 9987，檢測限為1 μ mol/L。
本發明克服了現有技術存在過于復雜等諸多缺點，靈敏度高，對于葡萄糖的檢測易于自動化。
圖1為本發明實施例葡萄糖含量與電致化學發光峰強度ip的關系圖。
圖2為本發明實施例溶液pH值對電致化學發光峰強度ip的影響。
圖3為本發明實施例魯米諾的含量與電致化學發光峰強度ip的關系圖。
具體實施方式
實施例
(1)分別截取鐵棒和玻璃管，并把鐵棒和玻璃管的兩端磨平、洗凈；將固體石蠟和碳粉按質量比為3 1比例混合，稍加熱至石蠟熔化，攪拌均勻，填入玻璃管中；將鐵棒插入玻璃管的一端中，用石蠟固定住，冷卻后，除去管外多余雜物，并在光滑紙上拋光表面，為保證足夠大的磁力；玻璃管的另一端電極端為石蠟碳糊薄層，制得固體石蠟碳糊電極；最后玻璃管石蠟碳糊的薄層的一端碳糊電極在使用前分別用體積比為11的硝酸和無水乙醇清洗，然后用二次蒸餾水沖洗干凈；
(2)稱取 FeCl3 ·6Η20 和 FeSO4 ·7Η20，以 Fe2+/Fe3+ =1:2 的摩爾比溶解在二次蒸餾水中得混合溶液，滴加體積百分比為25%的氨水使混合溶液pH = 11，室溫下攪拌30分鐘，然后升溫到80°C并保持溶液pH = 11不變，加熱熟化30分鐘；制備的黑色懸浮液超聲 20分鐘，在磁鐵分離下，用熱水洗滌到中性得磁性納米!^e3O4粒子；
(3)稱取48mg步驟⑵所得的磁性納米狗304粒子超聲分散在20mL無水乙醇中， 攪拌下加入0. 2mL體積百分濃度為98 % γ -氨丙基三乙氧基硅烷，室溫下攪拌反應12小時，收集的磁性粒子分別用無水乙醇和二次蒸餾水超聲清洗后定容得氨基化后的磁性納米 Fe3O4粒子；
(4)用磁鐵吸住步驟(1)制得的固體石蠟碳糊電極的鐵棒端，取步驟C3)制得的氨基化后的磁性納米I^e3O4粒子滴加在步驟(1)制得的電極表面，晾干后，滴加體積百分濃度為0. 25%的戊二醛在修飾電極表面，放入4°C冰箱1小時后，用水淋洗并吹干，然后滴加葡萄糖氧化酶溶液，放入4°C冰箱中過夜。使用前，把電極置于攪動的蒸餾水中清洗8分鐘。每次使用后，移去磁鐵，用蒸餾水沖洗，洗去磁性納米復合葡萄糖氧化酶粒子以便更新電極。電極不用時放入4°C冰箱中保存。
(4)檢測方法
室溫下，選取掃描速率為50mV/s，掃描范圍為+0. 2 +1. 4V(vs. SCE)，光電倍增管高壓600v，采樣速率10T/S，放大倍數3，測量時間60s進行循環伏安法試驗，測量不同濃度葡萄糖在含0. 5mmol/L魯米諾的0. lmol/L硼酸鈉緩沖溶液(pH 8. 0)的電致化學發光的強度，繪制工作曲線，其結果見附圖1。葡萄糖在1X10—5 1.0X10-2mol/L濃度范圍內與電致化學發光強度呈良好的線性關系ip = 65. 4C+23. 9，相關系數R = O. 9987，檢測限為 1 μ mol/L0
pH值和溫度的影響
魯米諾的ECL反應需在堿性條件下進行(pH 8. 5 10. 0)，考慮到葡萄糖氧化酶的生物活性受PH值影響較大，本文考察了 pH = 7. 0 9. 5的范圍內，電致化學發光強度的變化。在魯米諾濃度為0. lmmol/L，葡萄糖濃度為lmmol/L時，pH值的影響結果見附圖2。從圖中可以看出，當pH = 8. 0時，魯米諾的ECL強度最大，實驗選擇測定在pH = 8. 0的硼酸鈉緩沖溶液中進行。
同時，酶的催化活性與溫度也有很大關系，實驗用集熱式恒溫加熱磁力攪拌器控制水浴溫度，考察了 20 60°C范圍內酶電極的電流響應，發現當溫度達到40°C時，電流響應最大，隨著溫度的升高，電流有下降的趨勢。考慮到溫度過高，葡萄糖氧化酶因變性而影響酶電極的使用壽命，實驗均在室溫25°C下進行。
魯米諾的濃度的影響
固定其他條件不變，在0. 01 1. 2mmol/L范圍內考察了魯米諾的濃度對電致化學發光強度的影響。所得結果見附圖3。由圖可見，葡萄糖濃度是lmmol/L時，隨著魯米諾的濃度由0. Olmmol/L增大到0. 5mmol/L時，溶液的ECL值快速增大，當魯米諾的濃度大于 0. 5mmol/L時，ECL的強度趨于平穩。因此，實驗中魯米諾的用量為0. 5mmol/L。
電極在分析測試中的應用
對人血清中葡萄糖的含量進行了測定，結果表明，該方法和醫院采用的臨床分析方法所得結果相吻合。為進一步驗證該方法的準確性，采用標準加入法測定了樣品的回收率，結果見表1。可見，該方法用于臨床樣品的分析測定，結果令人滿意。
表1 人血清中葡萄糖的測定及回收率試驗結果(n = 5)
權利要求
1. 一種測定痕量葡萄糖的方法，其特征在于具體步驟為(1)分別截取鐵棒和玻璃管，并把鐵棒和玻璃管的兩端磨平、洗凈；將固體石蠟和碳粉按質量比為2 4 1比例混合，稍加熱至石蠟熔化，攪拌均勻，填入玻璃管中；將鐵棒插入玻璃管的一端中，用石蠟固定住，冷卻后，除去管外多余雜物，并在光滑紙上拋光表面，為保證足夠大的磁力；玻璃管的另一端電極端為石蠟碳糊薄層，制得固體石蠟碳糊電極；最后玻璃管石蠟碳糊的薄層的一端碳糊電極在使用前分別用體積比為11的硝酸和無水乙醇清洗，然后用二次蒸餾水沖洗干凈；(2)稱取FeCl3·6Η20和FeSO4 ·7Η20，以Fe2+/Fe3+ =1:2的摩爾比溶解在二次蒸餾水中得混合溶液，滴加體積百分比為25%的氨水使混合溶液pH = 9 12，室溫下攪拌20 40分鐘，然后升溫到80°C并保持溶液pH = 9 12不變，加熱熟化20 40分鐘；制備的黑色懸浮液超聲10 30分鐘，在磁鐵分離下，用熱水洗滌到中性得磁性納米!^e3O4粒子；(3)稱取45 55mg步驟⑵所得的磁性納米狗304粒子超聲分散在15_25mL無水乙醇中，攪拌下加入0. 1 0.3mL體積百分濃度為98% Y -氨丙基三乙氧基硅烷，室溫下攪拌反應9 20小時，收集的磁性粒子分別用無水乙醇和二次蒸餾水超聲清洗后定容得氨基化后的磁性納米!^e3O4粒子；(4)用磁鐵吸住步驟(1)制得的固體石蠟碳糊電極的鐵棒端，取步驟C3)制得的氨基化后的磁性納米!^e3O4粒子滴加在步驟(1)制得的電極表面，晾干后，滴加體積百分濃度為 0. 25%的戊二醛在修飾電極表面，放入4°C冰箱1小時后，用水淋洗并吹干，然后滴加葡萄糖氧化酶溶液，放入4°C冰箱中過夜；使用前，把電極置于攪動的蒸餾水中清洗5 10分鐘；每次使用后，移去磁鐵，用蒸餾水沖洗，洗去磁性納米復合葡萄糖氧化酶粒子以便更新電極；電極不用時放入4°C冰箱中保存；(4)檢測方法室溫下，選取掃描速率為50mV/s，掃描范圍為+0. 2 +1. 4V(vs. SCE)， 光電倍增管高壓600v，采樣速率10T/S，放大級數3，測量時間60s進行循環伏安法試驗，測量不同濃度葡萄糖在含0.5!1111101/1魯米諾的？!1為8.00.的lmol/L硼酸鈉緩沖溶液的電致化學發光的強度，繪制工作曲線；葡萄糖在1.0\10-5 1.0\10-2!1101/1濃度范圍內與電致化學發光峰強度呈良好的線性關系ip = 65. 4C+23. 9，相關系數R = O. 9987，檢測限為 1 μ mol/L0
全文摘要
本發明公開了一種用磁性納米粒子固定葡萄糖氧化酶測定痕量葡萄糖的方法。在碳糊電極表面，通過磁性納米粒子而修飾固定在電極表面的葡萄糖氧化酶氧化溶液中的葡萄糖生成雙氧水，雙氧水與魯米諾溶液形成電致化學發光體系。該體系在電極電壓的作用下產生非常強的電致化學發光信號和電化學信號。光信號強度在一定范圍內與溶液中的葡萄糖濃度成正比。據此建立了一種測定葡萄糖的電致化學發光分析方法。在+0.2～+1.4V(vs.SCE)電位范圍內進行循環伏安掃描，葡萄糖在1×10-5～1.0×10-2mol/L濃度范圍內與電致化學發光峰強度ip呈良好的線性關系。本發明克服了現有技術存在過于復雜等諸多缺點，靈敏度高，對于葡萄糖的檢測易于自動化。
文檔編號G01N21/76GK102495047SQ20111039100
公開日2012年6月13日 申請日期2011年11月29日 優先權日2011年11月29日
發明者李建平, 熊志剛 申請人:桂林理工大學