專利名稱：一種馬鏈球菌獸疫亞種的酶聯免疫檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發明屬于流行病學和衛生檢測領域。具體而言，本發明涉及一種快速檢測馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcus equi subsp. zoo印idemicus)的酶聯免疫吸附試驗(ELISA) 快速檢測試劑盒，以及使用該試劑盒進行檢測的方法。
背景技術：
馬鏈球菌獸疫亞種是我國豬鏈球菌病的主要病原，屬于蘭氏分群中的C群鏈球菌，該菌主要引起馬、豬、牛、犬、貓等多種動物下呼吸道感染，并引起敗血癥、腦膜炎、關節炎、肺炎的癥狀，嚴重時會引起突發性死亡。人與發病動物接觸或食用該菌污染的食品，亦可發病，因此該菌為一種重要的人畜共患病的病原。但是，目前尚缺乏快速、敏感的血清學檢測方法。因此，研制快速、敏感的新型檢測試劑盒是當務之急。馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白(&P)高度抗酸，具有多種生物學功能。其表面有調理素表位，能刺激機體產生抗調理素抗體；能抑制補體Ob在菌體表面沉積，從而抑制機體補體系統的活化；能結合機體的纖維蛋白原，使其具有抗吞噬細胞的吞噬活性。類M蛋白是該菌重要的毒力因子和保護性抗原，而馬鏈球菌獸疫亞種無毒菌株不表達類M蛋白。基于上述原因，本發明人選取馬鏈球菌獸疫亞種的類M蛋白為目標，通過大量實驗，建立了檢測感染馬鏈球菌獸疫亞種的動物(主要是豬)的抗體的血清學方法。并在此基礎上進一步優化，開發出了馬鏈球菌獸疫亞種間接ELISA檢測試劑盒。所述方法和試劑盒不僅可以用于該病原的抗體檢測，還可以區分動物感染不同病原的血清學差別。
發明內容
本發明的目的在于提供馬鏈球菌獸疫亞種快速檢測的間接ELISA診斷方法。一方面，一種用于檢測馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcus equi subsp. Z00印idemicus)的酶聯免疫試劑盒，其中包括馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白重組抗原和酶標二抗。本發明所述試劑盒進一步還包括馬鏈球菌獸疫亞種的標準陽性血清、陰性血清、 洗滌液、封閉液、終止液、底物顯色劑、濃縮樣品稀釋液和酶標板。。在本發明中，所述酶標二抗的酶為辣根過氧化物酶。在一個具體實施方案中，所述的酶標二抗為HRP-SPA。在本發明的一個優選實施方案中，所述的洗滌液為含有0. 5%吐溫-20磷酸鹽緩沖液。在本發明的一個優選實施方案中，所述的底物顯色劑由顯色劑A和顯色劑B組成， 顯色劑A為過氧化氫或過氧化脲，顯色劑B為鄰苯二胺或四甲基聯苯胺。在本發明的一個優選實施方案中，所述的濃縮樣品稀釋液為濃縮樣品稀釋液為含 0. 5%吐溫一 20的磷酸鹽緩沖液。在本發明的一個優選實施方案中，所述的封閉液為含有5%的脫脂乳的磷酸鹽緩沖液。在本發明的一個優選實施方案中，所述的馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白重組抗原的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。另一方面，本發明還提供了一種檢測馬鏈球菌獸疫亞種的酶聯免疫方法，該方法包括下列步驟(1)將本發明所述的馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白重組抗原，用包被液稀釋抗原至工作濃度1 640，100 μ L/孔包被酶標板，37°C作用1小時后，4°C包被過夜，用洗滌液洗滌三次，每次5分鐘，甩干；(2)加入封閉液，200 μ L/孔，37°C作用2小時后，用洗滌液洗滌三次，每次5分鐘，
甩干；(3)加入用血清稀釋液稀釋過的待檢血清和標準陰、陽性血清，100 μ L/孔，37°C 作用2小時后，用洗滌液三次，每次5分鐘；(4)加入1 5000稀釋的酶標抗體，100 μ L/孔，37°C，90分鐘，用PBST洗板三次， 每次5分鐘；(5)加入TMB可溶性單組份顯色液，各加100 μ L/孔，室溫避光顯色30分鐘；(6)加入終止液100 μ L/孔，酶聯免疫檢測儀測OD45tl值，根據與建立的判定標準的比對來判定陰性或陽性值。其中所述的建立的判定標準是指檢測沒有免疫鏈球菌疫苗，中和試驗抗體檢測為陰性的血清50份，求得其平均值為X = O. 202 ；標準偏差SD = 0. 061 ；確定陰陽臨界點為 X+3SD = 0. 202+3X0. 061 = 0. 385，即待檢血清OD450值高于0. 385判為陽性，OD450值低于 0. 35判為陰性。本發明中，所述的馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白重組抗原是通過基因工程重組表達并純化得到的。其中所述的基因工程重組表達的步驟包括(a)針對馬鏈球菌獸疫亞種的類M蛋白編碼基因的保守區片段設計并合成上下游引物上游引物Pl 5，-GCATGCGCATATGGCCCTCTTGGTTGGTGTGGCAGCTG-3，下游引物P2 5，-GGCACGTCTCGAGGTTTTCTTTGCGTCTTGTTGACACTGC-3，(b)按照擴增程序94 V變性4分鐘，94 V 30秒、55 °C 30秒、72 °C 30秒、共30個循環，72°C延伸10分鐘，PCR擴增獲得類M蛋白編碼基因片段；(c)將步驟(b)擴增產物連接入表達載體PetjSa (+)，并將重組載體轉化到大腸桿菌感受態細胞BL21中進行原核表達。獲得大小為56KD的重組蛋白。(d)大量誘導表達重組菌，4°C，IOOOOg離心lOmin，收集菌體，用高壓滅菌的磷酸鹽緩沖液洗滌菌體，重復3次。菌體用1/10菌液體積的超聲裂解液重懸，進行超聲波破碎菌體，功率200W，工作5s，間隔10s，直至懸液較澄清。超聲波裂解后的懸液4°C，IOOOOg離心 20min，分別收集上清和沉淀，用10%的SDS-PAGE電泳分析，檢測目的蛋白的表達形式，即以上清蛋白形式或包涵體蛋白形式。結果表明本試驗中的類M蛋白以上清蛋白形式表達。本發明所述的純化馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白重組抗原的步驟，包括(1)將上清蛋白用0. 45 μ m的濾膜過濾；(2)用5-10倍體積的超純水清洗帶有His2+標簽的親和層析柱；
(3)用5-10倍體積的溶解緩沖液平衡帶有His2+標簽的親和層析柱；(4)將步驟(1)中過濾后的蛋白樣品加到帶有His2+標簽的親和層析柱，并收集流出液；(5)將5-10倍體積的溶解緩沖液加到His蛋白純化柱，并收集流出液，做好標記， 所述溶解緩沖液的組成為20mM Na3PO4 · 12H20+0. 5NaCl+20mM咪唑；(6)用洗脫緩沖液洗脫蛋白樣品，收集蛋白樣品，所述洗脫緩沖液的組成為 20mMNa3P04 · 12H20+0. 5NaCl+500mM 咪唑。本發明中純化馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白重組抗原的方法包括但不限于親和層析、凝膠過濾層析、離子交換層析等。
圖1圖示的是ffestern-blot印跡試驗檢測蛋白質免疫原性的結果。圖2圖示的是血清最佳反應時間的確定圖3圖示的是酶標抗體最佳反應時間的確定圖4圖示的是底物反應時間的確定
實施例提供下述實施例是為了更好地進一步理解本發明，而決不對本發明的內容和保護范圍構成任何限制。除另有說明外，本申請中的所有科技術語都具有與本發明所屬領域普通技術人員通常理解相同的含義。本申請中引用的任一專利、專利申請和出版物在此引入作為參考。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常采用常規條件例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(第三版)(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press,) 中所述的條件，或按照制造廠商所建議的方法。實施例1 類M蛋白的制備1. IPCR擴增類M蛋白的編碼基因片段根據GeneBank公布的馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246類M蛋白的基因序列(登錄號為AY^3781)利用I^rimerS. O軟件自行設計出一對引物，同時在引物兩端分別添加BiolI 和Nde I酶切位點和保護性堿基，引物由上海英駿生物技術公司合成。上游引物(Pl)5，-GCATGCGCATATGGCCCTCTTGGTTGGTGTGGCAGCTG-3，下游引物(P2)5'-GGCACGTCTCGAGGTTTTCTTTGCGTCTTGTTGACACTGC-3，PCR 循環參數為94°C變性 ^iin 后，進入循環，94°C 30s，55°C 30s，72°C 30s，共進行30個循環，最后72°C延伸lOmin。獲得大小為1140bp的基因片段。測序表明其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。1. 2原核表達質粒的構建將PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后，紫外燈下切割目的條帶，用DNA快速純化試劑盒回收凝膠中的目的片段。將回收的PCR產物用B10II和Nde I進行雙酶切，提取質粒卩討-觀￡1(+)，進行)01011和而6 I雙酶切。并將酶切后的產物用T4DNA連接酶進行連接。將連接產物轉化到DH5 α大腸桿菌感受態細胞中，通過PCR鑒定和雙酶切鑒定，確定了原核表達質粒構建成功。
1.3類M蛋白基因的誘導表達將重組質粒轉化到大腸桿菌BL21中，隔夜挑取單菌落接種到LB培養基中，37°C搖振培養4小時，至OD63tl值為1. 0時，加入IPTG至終濃度為Immol/mL，繼續劇烈搖振培養4小時，離心去上清。于沉淀中加入SDS-PAGE上樣緩沖液煮沸5分鐘。含Petj8a(+)的BL21 按同樣方法處理，作為陰性對照。最后進行SDS-PAGE，結果樣品組有56KD條帶出現，與預計大小一致。大量誘導表達重組菌，4°C，IOOOOg離心lOmin，收集菌體，用高壓滅菌的磷酸鹽緩沖液洗滌菌體，重復3次。菌體用1/10菌液體積的超聲裂解液重懸，進行超聲波破碎菌體，功率200W，工作5s，間隔10s，直至懸液較澄清。超聲波裂解后的懸液4°C，IOOOOg離心 20min，分別收集上清和沉淀，用10%的SDS-PAGE電泳分析，檢測目的蛋白的表達形式，即以上清蛋白形式或包涵體蛋白形式。結果表明本試驗中的類M蛋白以上清蛋白形式表達。1.4類M蛋白的純化用帶有His2+tag的親和層析柱對類M蛋白進行純化，所需各種溶液的配方如下溶解緩沖液20mMNa3PO4 · 12H20+0. 5NaCl+20mM 咪唑洗脫緩沖液20mMNa3PO4 · 12H20+0. 5NaCl+500mM 咪唑純化的過程為(1)將上清蛋白用0. 45 μ m的濾膜過濾；(2)用5倍于層析柱體積的超純水清洗帶有His標簽的蛋白層析柱；(3)用5倍于層析柱體積的溶解緩沖液平衡帶有His標簽的蛋白層析柱；(4)取步驟(1)中過濾后的蛋白樣品5ml加到帶有His2+標簽的親和層析柱，并收集流出液；(5)將5-10ml的溶解緩沖液加到His蛋白純化柱，并收集流出液；(6)用洗脫緩沖液洗脫蛋白樣品，收集蛋白樣品。將收集的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳檢測，條帶大小為56KD且為單一條帶，表明獲得了較高純度的類M蛋白。實施例2對類M蛋白免疫原性的檢測對純化后的類M蛋白進行免疫印跡分析，具體步驟如下(1)將純化的類M蛋白蛋白進行10% SDS-PAGE電泳。(2)剪1張PVDF膜和4張濾紙，與2孔凝膠大小一致。濾紙置轉移緩沖液中平衡 lOmin, PVDF膜置于甲醇溶液中平衡。(3)在夾板面由下至上依次放入4張濾紙、PVDF膜、凝膠、4張濾紙，各層均排盡氣泡，精準對齊。(4)將靠上方的電極放于夾層物上，連接電源，15V轉印15min。然后斷開電源，從上到下拆卸轉移裝置，逐一掀去各層。(5)將PVDF膜放入盛有5%脫脂乳的PBST封閉液的平皿中，放在平緩搖動的搖床上于室溫孵育過夜。棄去封閉液，PBST漂洗3次，每次lOmin。(6)將含有馬鏈球菌獸疫亞種的抗體的豬血清按1 1000的比例用5%脫脂乳的PBST稀釋，將PVDF膜放入其中孵育池，棄去含陽性血清的封閉液，PBST漂洗3次，每次 IOmin0(7)將HRP-SPA按1 2000的比例用5%脫脂奶粉的PBST稀釋，將洗滌好的PVDF膜放入其中，平放在平緩搖動的搖床平臺上于室溫溫孵池。棄去二抗封閉液，PBST漂洗3 次，每次IOmin0(8) PVDF膜放入含有DAB的顯色液中顯色lOmin，并拍照保存。Western-blot印跡試驗結果如圖1所示，結果表明本發明的重組蛋白具有良好的免疫原性。實施例3 =ELISA反應最佳條件的確立與檢測方法的建立3. 1抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的確定采用方陣滴定法，用0.05mol/L pH9. 6碳酸鹽緩沖液將馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白抗原作 20μ g/ml,10y g/ml,5y g/ml,2. 5μ g/ml,l. 25μ g/ml，0. 625μ g/ml，0. 312 μ g/ ml倍比稀釋，分別加入到96孔酶標板左側第1-12列的第1_6行，每孔100μ L，37°C作用1 小時后，置4°C過夜。取出用洗滌液(含有0.5%Tween-20的磷酸鹽緩沖液)洗滌3次后， 每孔加入200 μ L封閉液(含有5%的脫脂乳的磷酸鹽緩沖液)，37°C作用2小時后，棄孔內的封閉液；用血清稀釋液(含有5%脫脂乳、0. 5% Tween-20的磷酸鹽緩沖液)將馬鏈球菌獸疫亞種的陽性血清和陰性血清在酶標板橫向上進行1 20、1 40,1 80,1 160倍比稀釋后，進行ELISA檢測。當0D450值接近1. 0時，P/N值高，此時的誤差最小，反應最靈敏，為最佳包被濃度與血清最佳稀釋度。
抗原濃度
抗體稀釋度
(μ g/ml)1201401:801:16040Poutoutout2.972.8952.9632.4092.559N0.1010.1010.0540.060.0670.0760.1160.04520P2.4812.5492.3772.4171.4991.4261.2361.147N0.0170.0840.0590.0480.1060.0780.0990.08210P2.3462.4082.1112.2191.2281.1571.130.932N0.0850.0720.0690.0680.0780.0910.0310.041表 5P2.2312.3641.972.0630.9250.8820.8240.706N0.0750.0720.0540.0540.0970.0930.0580.0392.5P1.9471.9961.9831.8230.790.8130.4960.586N0.0840.060.0710.0780.0590.0620.4590.5341.25P1.8741.8761.5491.5970.5820.5190.4930.476N0.0650.0560.0480.050.050.0470.0320.0410.625P1.1451.2011.0361.0380.4030.3970.2470.194N0.060.0580.0450.0450.0640.0590.0370.040.313P0.5090.4870.3210.3210.2470.1960.1990.186N0.0430.0420.0310.0330.0520.0410.0290.034最后確定血清最適稀釋度為1 40，抗原最佳包被濃度為0. 625μ g/mlο
3. 2封閉液的確定
分別用含0. 1% BSA.0. 5% BSA、1 % BSA、5%脫脂乳的磷酸鹽緩沖液作為封閉液， 分別對標準陰陽性血清進行ELISA檢測，判定標準為陽性值/陰性值(P/N)最大者為最合適的封閉液。而這四種溶液的P/N值分別為5. 82、5. 51、7. 1、10. 4。
權利要求
1.—禾中求禾中(Streptococcusequi subsp. zooepidemicus)白勺酶聯免疫試劑盒，其中包括馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白重組抗原和酶標二抗。
2.根據權利要求1所述的酶聯免疫試劑盒，其中所述試劑盒還包括馬鏈球菌獸疫亞種的標準陽性血清、陰性血清、洗滌液、封閉液、終止液、底物顯色劑、濃縮樣品稀釋液和酶標板。
3.根據權利要求1和2所述的酶聯免疫試劑盒，其中所述的酶標二抗的酶為辣根過氧化物酶。
4.根據權利要求3所述的酶聯免疫試劑盒，其中所述的酶標二抗為HRP-SPA。
5.根據權利要求2所述的酶聯免疫試劑盒，其中所述的洗滌液為含有0.5%吐溫-20 磷酸鹽緩沖液。
6.根據權利要求2所述的酶聯免疫試劑盒，其中所述的底物顯色劑由顯色劑A和顯色劑B組成，顯色劑A為過氧化氫或過氧化脲，顯色劑B為鄰苯二胺或四甲基聯苯胺。
7.根據權利要求2所述的酶聯免疫試劑盒，其中所述的濃縮樣品稀釋液為含0.5%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液。
8.根據權利要求1至7中任一項所述的酶聯免疫試劑盒，其中所述的馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白重組抗原的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
9.一種檢測馬鏈球菌獸疫亞種的酶聯免疫方法，該方法包括下列步驟(1)將權利要求1中所述的重組蛋白抗原，用PH9. 6的0. 05mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋至工作濃度1 640，100 μ L/孔包被酶標板，37°C作用1小時后，4°C包被過夜，用洗滌液洗滌三次，每次5分鐘，甩干；(2)加入封閉液，200μ L/孔，37°C作用2小時后，用洗滌液洗滌三次，每次5分鐘，甩干；(3)加入用血清稀釋液稀釋過的待檢血清和標準陰、陽性血清，IOOyL/孔，37°C作用2 小時后，用洗滌液三次，每次5分鐘；(4)加入1 5000稀釋的酶標抗體，100 μ L/孔，370C，90分鐘，用PBST洗板三次，每次 5分鐘；(5)加入TMB可溶性單組份顯色液，各加100μ L/孔，室溫避光顯色30分鐘；(6)加入終止液100μ L/孔，酶聯免疫檢測儀測OD45tl值，根據與建立的判定標準的比對來判定陰性或陽性值。
10.權利要求9所述的檢測馬鏈球菌獸疫亞種的酶聯免疫方法，其中所述的建立的判定標準是指檢測沒有免疫鏈球菌疫苗，中和試驗抗體檢測為陰性的血清50份，求得其平均值為X = O. 202 ；標準偏差SD = 0. 061 ；確定陰陽臨界點為X+3SD = 0. 202+3X0. 061 = 0. 385，即待檢血清OD450值高于0. 385判為陽性，OD450值低于0. 35判為陰性。
全文摘要
本發明屬于流行病學和衛生檢測領域。本發明公開了一種快速檢測馬鏈球菌獸疫亞種的ELISA快速檢測試劑盒及方法。具體而言，本發明所述試劑盒包括重組馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白抗原和酶標二抗。本發明還公開了一種檢測馬鏈球菌獸疫亞種的間接ELISA方法，該方法快速簡便，可直接對待檢血清進行檢測。本發明所述檢測試劑盒和檢測方法的敏感度高，特異性強。
文檔編號G01N33/569GK102565392SQ20121000234
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月5日 優先權日2012年1月5日
發明者周瑾, 范紅結, 陸承平 申請人:周瑾, 范紅結, 陸承平