專利名稱：一種檢測藻類溶血毒素活性的方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測方法，特別涉及一種檢測藻類溶血毒素活性的方法與應用。
背景技術：
近年來，隨著沿海經濟的高速增長和對外貿易的加強，港口的建設和遠洋運輸能力不斷增強，沿海水域富營養化急劇增加。有毒、有害赤潮呈不斷上升的趨勢，造成沿海水產養殖的重大經濟損失。有毒、有害赤潮的研究亦成為國際赤潮與海洋環境研究領域重要的議題和內容。現場觀察發現，1997年10月間發生在廣東饒平柘林灣的球形棕囊藻 (Phaeocystis globosa)赤潮使該灣養殖的魚類全部死亡,損失達六千萬人民幣；2005年 5月間發生在湛江港養殖區的同種赤潮，僅引起少數魚類死亡，在渤海灣發生的同種赤潮對魚類也沒有毒性。上述現象均說明環境因子可能影響著藻類毒素的生成。魚毒性赤潮藻溶血毒素毒性很強，傳統的檢測方法很難快速檢測該藻是否具魚毒性，且測定結果在時間上明顯滯后。當毒性實驗完成時，赤潮災害或許已經發生，雖然在某種程度上這些方法可以避免人類中毒，在保障海產品食用安全方面發揮一定作用，但不能化解和減少因赤潮毒素對養殖業帶來的巨大經濟損失。只有從毒素源頭上入手，及時、準確的預報產毒生物的消長情況，才有可能從根本上克服赤潮毒素對人類的威脅、減少因之帶來的經濟損失。赤潮毒素主要來源于赤潮藻，因此迫切需要建立快速、準確的產毒藻株鑒別技術，以實現赤潮的應急監測。三維熒光光譜法是近二十年發展起來并趨于成熟的熒光分析技術。該方法具有檢測速度快、簡單易攜、高靈敏度的特點。目前被廣泛應用于油種鑒別、水體檢測以及中藥鑒別等分析領域。目前國內外尚未有人利用三維熒光分析技術來檢測魚毒性赤潮藻溶血毒素活性的大小。
發明內容
本發明的首要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種檢測藻類溶血毒素活性的方法。本發明的另一目的在于提供所述檢測藻類溶血毒素活性的方法的應用。本發明的目的通過下述技術方案實現一種檢測藻類溶血毒素活性的方法，包含以下步驟(I)通過熒光分光光度計測定藻細胞樣品的三維熒光，激發波長為400 600nm， 發射波長為650 750nm，得到藻細胞樣品的三維熒光數據；(2)將藻細胞樣品的三維熒光數據轉換成TXT文件格式，根據Delaunay三角形方法，消除藻類三維熒光光譜的瑞利散射；再將三維熒光光譜最大歸一化，然后對其三維熒光光譜進行Coif2小波分析，選取熒光特征譜；(3)在波長 λ Em = 650 700nm，波長 λ Em = 725 750nm，波長 λ Ex = 400 425nm出現與藻類的溶血活性強弱一致的熒光強度變化，初步判斷所檢測的藻細胞樣品為魚毒性赤潮藻；若在波長λ Em = 650 700nm，波長λ Em = 725 750nm，波長λ Ex = 400 425nm沒有出現熒光光譜強度變化，初步判斷所檢測的藻細胞樣品為非魚毒性赤潮藻；(4)將步驟(2)得到的熒光特征譜進行Fisher判別，Fisher判別函數方程為Y1 = -I. 706-105. δΟδχ^θ. 273χ2+93. 118χ3_4· 311χ4+16. 307χ5_9· 476χ6_0· 173χ7+3 .866χ8+10. 436χ9_6. 751χ10-6. 511χη+94. 690χ12_104. 538χ13 ；γ2 = O. 963-112. 478χ1-51. 634χ2+62. 196χ3+76. 226χ4+15. 826χ5_8· 457χ6+4. 273χ7+ 8. 653χ8+5. 382χ9+0. 038χ10+45. 365χη_4. 937χ12_33. 386χ13 ；其中X為自變量值，即步驟(2)測得的特征熒光譜的熒光強度；y為測得的溶血活性數值；當檢測樣品時，分別計算I1和y2值，取大者為其y，根據以下標準判定藻細胞樣品毒性的大小y = 10 20HU為中毒性；y < IOHU為弱毒性；y > 20HU為強毒性。步驟⑴中所述的發射波長優選為650 680nm或725 750nm ；步驟(2)所述的三維熒光數據首先通過Matlab6. 5軟件消除瑞利散射、最大歸一化以及Coif2小波分析，再利用SPSS13. O進行Fisher判別，最后通過0rigin8. O制圖，得到熒光特征譜。步驟(4)所述的Fisher判別優選通過SPSS 13. O進行；所述檢測藻類溶血毒素活性的方法在海洋赤潮水體毒性檢測中應用；所述的藻類優選為魚毒性赤潮藻，更優選為海洋卡盾藻、卵圓卡盾藻或米氏凱倫藻中的至少一種。本發明的原理藻類溶血毒素主要成分為糖脂類和多不飽和脂肪酸類，而這些物質的合成直接與光合作用有關，葉綠素熒光可以全面反映光合作用全過程，本發明以光合作用為中心點，把糖脂類的合成與藻類的葉綠素熒光變化聯系起來。通過藻類活體熒光特征的識別，可以判定糖脂類物質的變化，從而確定該藻類細胞的溶血活性大小。本發明首先通過傳統的洋地黃皂甙溶血活性測定方法分別測定不同溶血性的魚毒性赤潮藻與非魚毒性赤潮藻的溶血毒素，再將之與魚毒性赤潮藻與非魚毒性赤潮藻的三維熒光進行分析，最終確定三維熒光數據的處理過程，從而與傳統的洋地黃皂甙溶血活性測定方法得到的數據對應。本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果本發明成功解決了傳統檢測方法時間滯后的難題，在我國實屬首創。本發明改變傳統檢測方法時間滯后、被動的窘境，現場的操作性強，化解和減少因赤潮毒素對養殖業帶來的巨大的經濟損失，促進海產品安全體系的建立。
圖I是魚毒性赤潮藻與非魚毒性赤潮藻的Fisher判別圖。圖2是魚毒性赤潮藻溶血活性高低的Fisher判別圖。圖3是卵圓卡盾藻小波分解后的熒光特征譜圖；其中，a表不培養液中鐵濃度為IX 10_5mol/L ;b表不培養液中鐵濃度為 O. 5 X 10_8mol/L ;c表示培養液中鐵濃度為I X 10^mol/L ;d表示培養液中鐵濃度為2 X105mol/L。圖4是海洋卡盾藻(香港株)小波分解后的熒光特征譜圖；其中，a表示培養液中鐵濃度為I X l(T5mol/L ;b表示培養液中鐵濃度為 O. 5 X 10_8mol/L ;c表示培養液中鐵濃度為I X 10^mol/L ;d表示培養液中鐵濃度為 2 X105mol/L。圖5是海洋卡盾藻(日本株)小波分解后的熒光特征譜圖； 其中，a表不培養液中鐵濃度為IX 10_5mol/L ;b表不培養液中鐵濃度為 O. 5 X 10_8mol/L ;c表示培養液中鐵濃度為I X 10^mol/L ;d表示培養液中鐵濃度為 2 X105mol/L。圖6是米氏凱倫藻小波分解后的熒光特征譜圖；其中，a表示培養液中鐵濃度為IX l(T5mol/L O. 5 X l(T8mol/L ;c表示培養液中鐵濃度為I X l(T7mol/L 2 X105mol/L。圖7是東海原甲藻小波分解后的熒光特征譜圖；其中，a表示培養液中鐵濃度為IX l(T5mol/L
O.5 X l(T8mol/L ;c表示培養液中鐵濃度為I X l(T7mol/L 2 X105mol/L。圖8是錐狀斯氏藻小波分解后的熒光特征譜圖；其中，a表示培養液中鐵濃度為IX l(T5mol/L
O.5 X l(T8mol/L ;c表示培養液中鐵濃度為I X l(T7mol/L 2 X105mol/L。
;b表不培養液中鐵濃度為 ;(1表示培養液中鐵濃度為
;b表不培養液中鐵濃度為 ;(1表示培養液中鐵濃度為
;b表不培養液中鐵濃度為 ;(1表示培養液中鐵濃度為
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。實施例I(I)分別培養海洋卡盾藻香港株(已在“海洋卡盾藻(香港株)溶血毒素的提取和分離”公開)、海洋卡盾藻日本株(已在“海洋卡盾藻日本株過氧化氫產生的影響因素”公開)、卵圓卡盾藻(已在“五種赤潮藻單克隆抗體的制備”公開)、米氏凱倫藻(已在“米氏凱倫藻溶血毒素的溶血反應特征”公開)、東海原甲藻(已在“混合培養條件下幾種赤潮藻對無機氮源的競爭生長研究”公開)和錐狀斯氏藻(已在“多氯聯苯對2種微藻的急性毒性研究”公開)。以上藻類均來自暨南大學赤潮與水環境研究中心。①培養基的制備先將自然海水用O. 45 μ m微孔濾膜過濾，收集I. 2L濾液于2L錐形瓶中，121 °C、15psi下滅菌25min，冷卻到室溫，然后加入f/2培養液改良配方(如表I所示)，根據下表得到的培養基鐵離子濃度為lX10_5mOl/L。由于鐵離子的濃度影響藻的溶血活性，因此，再分別制備得到鐵離子濃度為O. 5X 10_8mol/L、l X 10_7mol/L和2X 10_5mol/L 的培養基。使用不同鐵離子濃度的培養基分別培養藻類。表I f/2培養基
權利要求
1.一種檢測藻類溶血毒素活性的方法，其特征在于包含以下步驟(1)通過熒光分光光度計測定藻細胞樣品的三維熒光，激發波長為400 600nm，發射波長為650 750nm，得到藻細胞樣品的三維熒光數據；(2)將藻細胞樣品的三維熒光數據轉換成TXT文件格式，根據Delaunay三角形方法，消除藻類三維熒光光譜的瑞利散射；再將三維熒光光譜最大歸一化，然后對其三維熒光光譜進行Coif2小波分析，選取熒光特征譜；(3)在波長λ Em = 650 700nm，波長 λ Em = 725 750nm，波長 λ Ex = 400 425nm 出現與藻類的溶血活性強弱一致的熒光光譜強度變化，初步判斷所檢測的藻細胞樣品為魚毒性赤潮藻；若在波長λ Em = 650 700nm，波長λ Em = 725 750nm，波長λ Ex = 400 425nm沒有出現熒光光譜強度變化，初步判斷所檢測的藻細胞樣品為非魚毒性赤潮藻；(4)將步驟(2)得到的熒光特征譜進行Fisher判別，Fisher判別函數方程為Y1 = -I. 706-105. δΟδχ^θ. 273χ2+93. 118χ3_4. 311χ4+16. 307χ5_9. 476χ6_0. 173χ7+3. 866 χ8+10. 436χ9_6. 751χ10-6. 511χη+94. 690χ12_104. 538χ13 ；Y2 = O. 963-112. 478χ1-51. 634χ2+62. 196χ3+76. 226χ4+15. 826χ5_8. 457χ6+4. 273χ7+8. 65 3χ8+5. 382χ9+0. 038χ10+45. 365χη_4. 937χ12_33. 386χ13 ；其中X為自變量值，即步驟(2)測得的特征熒光譜的熒光強度；y為測得的溶血活性數值；當檢測樣品時，分別計算Y1和y2值，取大者為其y，根據以下標準判定藻細胞樣品毒性的大小y = 10 20HU為中毒性；y < IOHU為弱毒性；y > 20HU為強毒性。
2.根據權利要求I所述的檢測藻類溶血毒素活性的方法，其特征在于步驟(I)中所述的發射波長為650 680nm或725 750nm。
3.根據權利要求I所述的檢測藻類溶血毒素活性的方法，其特征在于步驟(2)所述的三維熒光數據首先通過Matlab6. 5軟件消除瑞利散射、最大歸一化以及Coif2小波分析， 再通過SPSS13. O進行Fisher判別，最后通過0rigin8. O制圖，得到熒光特征譜。
4.根據權利要求I所述的檢測藻類溶血毒素活性的方法，其特征在于步驟(4)所述的Fisher判別通過SPSS 13. O進行。
5.權利要求I 4任一項所述的檢測藻類溶血毒素活性的方法在赤潮水體魚毒性的檢測中應用。
6.根據權利要求5所述的檢測藻類溶血毒素活性的方法在赤潮水體魚毒性的檢測中應用，其特征在于所述的藻類為魚毒性赤潮藻。
7.根據權利要求6所述的檢測藻類溶血毒素活性的方法在赤潮水體魚毒性的檢測中應用，其特征在于所述的魚毒性赤潮藻為海洋卡盾藻、卵圓卡盾藻或米氏凱倫藻中的至少一種。
全文摘要
本發明公開一種檢測藻類溶血毒素活性的方法與應用。該方法通過熒光分光光度計測定藻細胞樣品的三維熒光，得到藻細胞樣品的三維熒光數據；再將藻細胞樣品的三維熒光數據轉換成TXT文件格式，根據Delaunay三角形方法，消除藻類三維熒光光譜的瑞利散射；再將三維熒光光譜最大歸一化，然后對其三維熒光光譜進行Coif2小波分析，選取熒光特征譜；根據熒光特征譜初步判斷所檢測的藻細胞樣品為魚毒性赤潮藻與非魚毒性赤潮藻；再將熒光特征譜進行Fisher判別，從而判定藻細胞樣品毒性的大小。本發明成功解決了傳統檢測方法時間滯后的難題，在我國實屬首創。本發明改變傳統檢測方法時間滯后、被動的窘境，有利于現場檢測赤潮藻的魚毒性。
文檔編號G01N21/64GK102608085SQ201210005410
公開日2012年7月25日 申請日期2012年1月9日 優先權日2012年1月9日
發明者吳霓, 李支薇, 杜克梅, 桓清柳, 江天久 申請人:暨南大學