專利名稱：同時測定多維氨基酸咀嚼片中多種成分含量的方法
技術領域：
本發明屬于分析化學領域，涉及定量測定制劑中L 一谷氨酰胺、鹽酸半胱氨酸和維生素B2含量的方法，具體地說是一種同時測定多維氨基酸咀嚼片中多種成分含量的方法。
背景技術：
國內研究用HPLC法測定藥品、保健品、食品等中維生素的含量的較多，但對多維氨基酸咀嚼片中氨基酸(L 一谷氨酰胺，鹽酸半胱氨酸)和維生素(VB2)在同一個體系中，一起測定含量的液相方法研究較少。目前，國內文獻沒有這方面的報道。傳統檢測制劑中氨基酸的含量用專門的氨基酸柱和特制的試劑配制流動相，比較復雜，成本可觀。
發明內容
本發明要解決的技術問題，針對多維氨基酸咀嚼片中L-谷氨酰胺、鹽酸半胱氨酸和維生素B2的含量測定，由于現在文獻沒有這方面的記載，國家也沒有現成的標準可參考， 因此制定并驗證了此方法，該方法屬于HPLC法，本方法具有簡便、準確、重復性好、專屬性強等特點。本發明以常用的十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的柱子，用離子對試劑做為流動相的一部分，就能在同一個系統中把氨基酸和維生素B2同時檢測出，方法簡單，專屬性強， 精密度和重復性良好。為解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案是
一種同時測定多維氨基酸咀嚼片中多種成分含量的方法，它是利用HPLC法同時測定多維氨基酸咀嚼片中L-谷氨酰胺、鹽酸半胱氨酸和VB2含量，該方法的色譜條件為
(1)色譜柱島津VP-ODS (250mm X 4. 6mm，5 μ m);
(2)流動相為混合比例為1090的乙腈和離子對試劑的水溶液；
(3)紫外檢測器的檢測波長為215nm。作為本發明的一種限定，所述的離子對試劑的水溶液為庚烷磺酸鈉的的水溶液或辛烷磺酸鈉的水溶液。作為上述限定的進一步限定，所述的離子對試劑的水溶液為辛烷磺酸鈉的水溶液。作為上述限定的再次限定，所述的辛烷磺酸鈉的水溶液濃度為O. 0865%。作為上述限定的最后限定，所述的辛烷磺酸鈉的水溶液用85%的磷酸調節pH值至 2. 5。作為本發明的另一種限定，該方法的色譜條件為所用流動相的流速為1.2mL/ min，進樣體積為20 μ L，柱溫為35°C。通過本方法測定多維氨基酸咀嚼片中L-谷氨酰胺、鹽酸半胱氨酸和維生素B2的含量，分析結果真實、準確。
由于采用了上述的技術方案，本發明與現有技術相比，所取得的技術進步在于采用HPLC法檢測多維氨基酸咀嚼片中L-谷氨酰胺、鹽酸半胱氨酸和維生素B2的含量，操作簡單，提高了檢測的靈敏度和準確度，并可以適用于有顏色干擾的樣品。本發明適于多維氨基酸咀嚼片中L-谷氨酰胺、鹽酸半胱氨酸和維生素B2的含量測定。
圖I為本發明實施例溶劑干擾性試驗的HPLC圖2為本發明實施例空白輔料干擾性試驗的HPLC圖3為本發明實施例對照品L-谷氨酰胺的HPLC圖4為本發明實施例對照品鹽酸半胱氨酸的HPLC圖5為本發明實施例對照品維生素B2的HPLC圖6為本發明實施例L-谷氨酰胺，鹽酸半胱氨酸和維生素B2對照品混合物的HPLC圖； 圖7為本發明實施例樣品的HPLC圖8為本發明實施例對照品進樣量為5 μ L線性測定的HPLC圖9為本發明實施例對照品進樣量為10 μ L線性測定的HPLC圖10為本發明實施例對照品進樣量為20 μ L線性測定的HPLC11為本發明實施例對照品進樣量為30 μ L線性測定的HPLC12為本發明實施例對照品進樣量為40 μ L線性測定的HPLC13為本發明實施例對照品進樣量為50 μ L線性測定的HPLC14為本發明實施例耐用性考察所使用的型號為Agilent (250*4. 6mm，5 μ m)色譜柱的HPLC圖15為本發明實施例耐用性考察所使用的型號為Diamonsil C18(2) (150*4. 6mm, 5 μ m)色譜柱的HPLC圖16為本發明實施例耐用性考察所使用的型號為月旭W elchorm C18 (250*4. 6mm,
5μ m)色譜柱的HPLC圖17-圖22分別為本發明實施例對照品精密度試驗測定的HPLC圖23為本發明實施例樣品穩定性試驗標準品Oh測定的HPLC圖24為本發明實施例樣品穩定性試驗標準品4. 5h測定的HPLC圖25為本發明實施例樣品穩定性試驗標準品6h測定的HPLC圖26為本發明實施例樣品穩定性試驗標準品7h測定的HPLC圖27為本發明實施例樣品穩定性試驗標準品8. 5h測定的HPLC圖28為本發明實施例對照品穩定性試驗標準品Oh測定的HPLC圖29為本發明實施例對照品穩定性試驗標準品4. 5h測定的HPLC圖30為本發明實施例對照品穩定性試驗標準品6h測定的HPLC圖31為本發明實施例對照品穩定性試驗標準品7h測定的HPLC圖32為本發明實施例對照品穩定性試驗標準品8. 5h測定的HPLC圖。本發明下面將結合說明書附圖和具體實施例作進一步詳細說明。
具體實施例方式以下實施例只用于說明本發明，并不限定本發明。實施例一種同時測定多維氨基酸咀嚼片中多種成分含量的方法
本測量方法是利用HPLC法同時測定多維氨基酸咀嚼片中L-谷氨酰胺、鹽酸半胱氨酸和VB2含量。該方法的色譜條件為
(1)色譜柱島津VP-ODS (250mm X 4. 6mm，5 μ m);
(2)流動相是混合比例(體積比)為1090的乙腈和離子對試劑的水溶液；流動相的流速為I. 2mL/min,進樣體積為20 μ L，柱溫為35°C。其中
離子對試劑的水溶液為按照O. 865g辛烷磺酸鈉加IOOOmL 二次去離子水的比例溶解制得的O. 0865%的辛烷磺酸鈉的水溶液(也可以用庚烷磺酸鈉的水溶液替代)，用85%的磷酸調節pH值至2.5。(3)紫外檢測器的檢測波長為215nm。一、本發明方法的建立過程
1、儀器與試劑
儀器島津LC-2010A高效液相色譜儀(LC-2010型號檢測器，LC-2010型號泵，LC-2010 柱溫箱，LC-2010自動進樣器)，LCsolution色譜工作站。試劑乙腈(色譜級)、水(二次去離子水)、辛烷磺酸鈉(優級純，離子對試劑)、 本申請人生產提供的多維氨基酸咀嚼片(樣品)、L-谷氨酰胺對照品(SIGMA公司，批號 0001410840含量99. 5%)、鹽酸半胱氨酸一水物對照品(日本東京任成工業株式會社，批號V4XRL，含量以鹽酸半胱氨酸計為91. 0%)、VB2對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號 100369-200502，含量 98. 7%)。2、含量測定方法的建立
2.I、波長的選擇
根據L 一谷氨酰胺、鹽酸半胱氨酸和VB2紫外光吸收具有的特性，測定了它的水溶液在紫外光下的吸收圖譜，在波長為215nm處三種物質均有良好的吸收，因此確定檢測波長為 215nm。2. 2、溶液的配制
維生素B2對照品貯備溶液的配制精密稱取VB2對照品15mg，置于IOOmL棕色容量瓶中，加入大約20mL的二次去離子水和O. 5mL冰乙酸，100°C水浴溶解，放冷后用二次去離子水定容，搖勻，即得。對照品溶液的配制精密稱取L-谷氨酰胺對照品50mg和鹽酸半胱氨酸一水物對照品16. 25mg，置于同一 IOOmL的棕色容量瓶中，精密量取VB2對照品貯備液20mL，置于上述棕色容量瓶中，用二次去離子水溶解并稀釋置刻度，搖勻，即得對照品溶液M。樣品溶液的配制取樣品10片精密稱定，研細，精密稱取細粉I. 25g (大約相當于 50mgL-谷氨酰胺、15mg鹽酸半胱氨酸和30mg的維生素B2),置于IOOml的棕色容量瓶中，加入二次去離子水60mL，100°C水浴溶解后，冷卻至室溫，用二次去離子水稀釋至刻度，搖勻， 即得樣品溶液N。2. 3、溶劑、空白輔料的干擾性試驗和L 一谷氨酰胺、鹽酸半胱氨酸和VB2定性為排除色譜圖中有溶劑和空白輔料干擾L 一谷氨酰胺、鹽酸半胱氨酸和VB2峰的出現，
5對單獨的溶劑和空白輔料進行專屬性試驗和三種物質的定性以增加檢測的準確性。溶劑的影響將二次去離子水濾過，取20 μ L照上述色譜條件進樣，記錄色譜圖， 如圖I所示，溶劑色譜圖中沒有干擾峰出現，表明溶劑對測定沒有影響。空白樣品影響按照制劑配方規定的比例，除L 一谷氨酰胺、鹽酸半胱氨酸、維生素民外，其他組分和輔料稱取一定量，混勻，研細，精密稱取細粉I. 25g，置于IOOmL的棕色容量瓶中，用二次去離子水溶解并稀釋至刻度，搖勻，過濾；取續濾液20 μ L照上述色譜條件進樣，記錄色譜圖，如圖2所示，空白樣品色譜圖中沒有干擾峰出現，表明空白樣品對測定沒有影響。谷氨酰胺的定性精密稱取L-谷氨酰胺對照品25mg，置于50mL棕色容量瓶中，用二次去離子水溶解并稀釋至刻度，搖勻。取20 μ L照上述色譜條件進樣，記錄色譜圖，如圖 3所示。鹽酸半胱氨酸的定性精密稱取鹽酸半胱氨酸一水物對照品16mg，置于IOOmL棕色容量瓶中，用二次去離子水溶解并稀釋至刻度，搖勻。取20 μ L照上述色譜條件進樣，記錄色譜圖，如圖4所示。維生素B2的定性精密量取2. 2項下的維生素B2對照品貯備液20mL，置于IOOmL 棕色容量瓶中，用二次去離子水稀釋至刻度，搖勻。取20 μ L照上述色譜條件進樣，記錄色譜圖，如圖5所示。取2. 2項下的對照品溶液M 20 μ L，按照上述色譜條件進樣，記錄色譜圖，如圖6所
/Jn ο取2. 2項下的樣品溶液N 20 μ L，按照上述色譜條件進樣，記錄色譜圖，如圖7所
/Jn ο說明對照品溶液的色譜圖中L-谷氨酰胺、鹽酸半胱氨酸和維生素B2與樣品溶液的色譜圖中L-谷氨酰胺、鹽酸半胱氨酸和維生素B2保留時間一致。2. 4、樣品的測定
取三批批號為10072801、10080501、10072601的樣品，依照方法2. 2制備樣品溶液，每批樣品做兩個平行樣，按上述色譜條件精密量取20 μ L進樣，按面積外標法計算L-谷氨酰胺、鹽酸半胱氨酸和維生素B2的含量，樣品測定結果見表I。試驗測定結果顯示L 一谷氨酰胺，鹽酸半胱氨酸和VB2含量均在標示量的90. 0%-110. 0%范圍內，說明此檢測方法可行。
權利要求
1.一種同時測定多維氨基酸咀嚼片中多種成分含量的方法，其特征在于它是利用 HPLC法同時測定多維氨基酸咀嚼片中L-谷氨酰胺、鹽酸半胱氨酸和VB2含量，該方法的色譜條件為(1)色譜柱島津VP-ODS (250mm X 4. 6mm，5 μ m);(2)流動相是混合比例為1090的乙腈和離子對試劑的水溶液；(3)紫外檢測器的檢測波長為215nm。
2.根據權利要求I所述的同時測定多維氨基酸咀嚼片中多種成分含量的方法，其特征在于所述的離子對試劑的水溶液為庚烷磺酸鈉的水溶液或辛烷磺酸鈉的水溶液。
3.根據權利要求2所述的同時測定多維氨基酸咀嚼片中多種成分含量的方法，其特征在于所述的離子對試劑的水溶液為辛烷磺酸鈉的水溶液。
4.根據權利要求3所述的同時測定多維氨基酸咀嚼片中多種成分含量的方法，其特征在于所述的辛烷磺酸鈉的水溶液濃度為O. 0865%。
5.根據權利要求4所述的同時測定多維氨基酸咀嚼片中多種成分含量的方法，其特征在于所述的辛烷磺酸鈉的水溶液用85%的磷酸調節pH值至2. 5。
6.根據權利要求1-5中任一項所述的同時測定多維氨基酸咀嚼片中多種成分含量的方法，其特征在于該方法的色譜條件為所用流動相的流速為1.2mL/min，進樣體積為 20 μ L，柱溫為 350C ο
全文摘要
本發明公開了一種同時測定多維氨基酸咀嚼片中多種成分含量的方法，即利用HPLC法同時測定多維氨基酸咀嚼片中L-谷氨酰胺、鹽酸半胱氨酸和VB2含量，該方法的色譜條件為(1)色譜柱島津VP-ODS(250mm×4.6mm，5μm)；(2)流動相為混合比例為1090的乙腈和離子對試劑的水溶液；(3)紫外檢測器的檢測波長為215nm；所用流動相的流速為1.2mL/min，進樣體積為20μL，柱溫為35℃。本發明的測定方法操作簡單，提高了檢測的靈敏度和準確度，并可以適用于有顏色干擾的樣品。本發明適于多維氨基酸咀嚼片中L－谷氨酰胺、鹽酸半胱氨酸和VB2含量的測定。
文檔編號G01N30/02GK102590393SQ20121007020
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月16日 優先權日2011年11月30日
發明者張江艷, 王付平, 田會彥, 魏桂香 申請人:河北科星藥業有限公司