專利名稱：一種測定蝙蝠蛾被毛孢菌絲體粉中蟲草素、腺苷、甘露醇的方法
技術領域：
本發明涉及一種測定蝙蝠蛾被毛孢菌絲體粉中蟲草素、腺苷、甘露醇的方法，特別是利用高效液相色譜質譜聯 用儀同時測定蝙蝠蛾被毛孢菌絲體粉中蟲草素、腺苷、甘露醇含量的方法。
背景技術：
冬蟲夏草是一種寄生真菌，學名為蝙蝠蛾被毛孢，寄生于生長在高海拔的對鱗翅目的幼蟲，在中國已被作為食品和草藥用于治療各種疾病。它不僅可以作為一種珍貴的藥物，用來治療許多疾病，如咳嗽、肺和腎臟的功能紊亂，據最近的報道，還可作為一種抗衰老的保健滋補食品。冬蟲夏草被證明含有蟲草素、腺苷、甘露醇、肌苷、腺嘌呤、蟲草素多糖等主要生物活性成分，具有抗氧化、增強免疫力和調節人體內分泌系統的功效，特別是其中三個最重要的活性成分蟲草素、腺苷、甘露醇，可視為冬蟲夏草的質量評價的指標。許多研究報道指出，人工的蟲草菌絲也具有相似的化學成分、藥理作用和臨床療效，能夠替代天然的冬蟲夏草，而且一些不法商販將一些替代品如蛹蟲草和添加劑進行銷售，使市場魚龍混雜，使人們的身體健康及生命財產受到了傷害，因此，蟲草及其產品的質量控制是非常重要的，急需一些快速、有效的檢測方法來確保其安全和功效。目前腺苷成分含量是利用薄層色譜法、高效液相色譜和毛細管電泳來檢測的，但靈敏度低、選擇性差和耗用時間長。甘露醇的定量方法主要報道如氧化還原法、高效液相色譜、氣相色譜、薄層色譜掃描等。黃光裕等曾采用LC/ESI-MS法，以2-氯腺苷為內標物來測量冬蟲夏草中腺苷的含量(Huang LF, Liang YZ, Guo FQ, Zhou ZF, Cheng BM.Simultaneous separation and determination of active components in Cordycepssinensis and Cordyceps militarris by LC/ESI-MS. J Pharm Biomed Anal 2003 Dec4;33(5):1155-62.)，但此種方法一次只能測量一種組分，不能同時檢測蟲草素、腺苷、甘露醇，并且耗時長，靈敏度不高。
發明內容
為克服上述方法的不足，本發明提供了一種用高效液相色譜質譜聯用儀同時測定蝙蝠蛾被毛孢菌絲體粉中蟲草素、腺苷、甘露醇含量的方法，與以上方法相比具有分離能力強、定性分析結果準確、檢測限低、分析時間快等優點。所采用的技術方案如下
本發明提供了一種利用高效液相色譜一質譜聯用儀快速、同時測定蝙蝠蛾被毛孢菌絲體粉中蟲草素、腺苷、甘露醇的方法，包括以下步驟
(一)樣品處理
精確稱取冬蟲夏草樣本的菌絲體粉O. 50 g，均勻研磨和混合，在IOml容量瓶瓶中用超純水定容，水浴超聲提取30分鐘，然后用O. 45 μ m過濾膜過濾，所得濾液用高效液相色譜一質譜聯用儀進行測定；
(二)高效液相色譜一質譜聯用儀的測定條件
(1)液相條件色譜柱為Thermo BioBasic-18 PIONEER (150 mm X 2. I mm, i. d. 5μπι);柱溫為30°C，進樣量為5μ I ;流動相為0.05 mol/L甲酸-甲醇混合溶液(94:6，v/V)，流速為 O. 2 ml/min ；
(2)質譜條件離子源為電噴霧離子源(ESI)，蟲草素、腺苷采用正電離模式，甘露醇采用負電離模式；保護氣體為氮氣，流速為40 A. U.;輔助氣體為氦氣,流速為5 A. U.;毛細管溫度為350°C，噴霧電壓為4. O kV,毛細管電壓是28 V ;ESI接口和質譜參數進行優化，以達到最佳；選擇性離子檢測模式(SIM)進行質譜采集； (三)繪制標準曲線
分別稱取標準品腺苷、蟲草素、甘露醇適量，用超純水溶解使腺苷、蟲草素濃度為100mg/L,甘露醇濃度為500mg/L，作為貯備液；然后分別適量儲備液，用純水稀釋，依次配置腺苷和蟲草素濃度均為 10. O mg/L、20.0 mg/L、30. O mg/L、40. O mg/L、50. O mg/L,甘露醇濃度為 100. O mg/L,200. O mg/L、300. O mg/L,400. 0 mg/L、500. 0 mg/L 的混合標準工作液，將混合標準工作液進樣IOul在所述色譜和質譜條件下進行測定，以各組分的峰面積對濃度作回歸分析，得到峰面積-濃度標準曲線；
(四)數據的分析
測得蟲草素的線性范圍為1-50 μ g/ml，腺苷的線性范圍為0-500 yg/ml，甘露糖醇的線性范圍為1-50 μ g/ml，三種成分的回收率從95. 2%到103. 9%，腺苷、蟲草素、甘露醇的檢出限分別為 O. 16 μ g/ml, O. 23 μ g/ ml、7. 3 μ g/ml。本發明將色譜對樣品的高分離能力，與質譜的高選擇性、高靈敏度及能夠提供相對分子質量與結構信息的優點結合起來，具有分離能力強、定性分析結果準確、檢測限低、分析時間快等優點。
圖I為本發明標準品的蟲草素、腺苷、甘露醇的質譜圖。圖2為本發明樣品的蟲草素、腺苷、甘露醇的質譜圖。圖3為本發明標準品中的蟲草素、腺苷、甘露醇色譜圖。圖4為本發明樣品的蟲草素、腺苷、甘露醇色譜圖。圖5為本發明蟲草素的標準曲線。圖6為本發明腺苷的標準曲線。圖7為本發明甘露醇的標準曲線。
具體實施例方式I、實驗儀器及材料
(O儀器美國熱電公司生產的高效液相色譜-離子阱質譜聯用儀，型號為LCQ-Deca-XP,其配備的 LC 系統(Thermo Finnigan, San Jose, CA, U.S.A.),包括四兀泵、在線脫氣器、柱加熱器部分，自動取樣器和PDA(光電二極管陣列)檢測器和多級離子講質譜儀(Thermo Finnigan),其由一個ESI接口和一個離子講質譜分析儀,數據處理和獲取通過 Xcalibur I. 3 工作站；Milli-Q 超純水系統((Millipore Inc, Billerica , MA，U. S. A.)；電子天平,高速離心機,超聲儀；
(2)試劑甲醇(HPLC 級，Merck, Darmstadt, Germany);甲酸(分析級，Merck,Darmstadt, Germany);蟲草素標準品(純度≥99%)、腺苷標準品(純度≥99%)、甘露醇標準品(純度> 99%)、冬蟲夏草菌絲體粉膠囊。2、樣品處理
精確稱取冬蟲夏草樣本的菌絲體粉O. 50 g，均 勻研磨和混合，在IOml容量瓶瓶中用超純水定容，水浴超聲提取30分鐘，然后用O. 45 μ m過濾膜過濾，所得濾液用高效液相色譜一質譜聯用儀進行測定。3、高效液相色譜一質譜聯用儀的測定條件
(1)液相條件色譜柱為Thermo BioBasic-18 PIONEER (150 mm X 2· I mm, i. d. 5μπι);柱溫為30°C，進樣量為5μ I ;流動相為O. 05 mol/L甲酸-甲醇混合溶液(94:6，v/V)，流速為 O. 2 ml/min ；
(2)質譜條件離子源為電噴霧離子源(ESI)，蟲草素、腺苷采用正電離模式，甘露醇采用負電離模式；保護氣體為氮氣，流速為40 A. U.;輔助氣體為氦氣，流速為5 A. U.;毛細管溫度為350°C，噴霧電壓為4. O kV,毛細管電壓是28 V ;ESI接口和質譜參數進行優化，以達到最佳；選擇性離子檢測模式(SIM)進行質譜采集。4、繪制標準曲線
分別稱取標準品腺苷、蟲草素、甘露醇適量，用超純水溶解使腺苷、蟲草素濃度為100mg/L,甘露醇濃度為500mg/L，作為貯備液；然后分別適量儲備液，用純水稀釋，依次配置腺苷和蟲草素濃度均為 10. O mg/L、20.0 mg/L、30. O mg/L、40. O mg/L、50. O mg/L,甘露醇濃度為 100. O mg/L,200. O mg/L、300. O mg/L,400. 0 mg/L、500. 0 mg/L 的混合標準工作液，將混合標準工作液進樣IOul在所述色譜和質譜條件下進行測定，以各組分的峰面積對濃度作回歸分析，得到峰面積-濃度標準曲線。5、數據的分析
(1)SM模式和TIC質譜圖標準品中的蟲草素(RT = 4. 31)、腺苷(RT = 3.88)和甘露醇(RT = 2.54)，如圖I所示。SM模式和TIC質譜圖樣品中的蟲草素(RT = 4. 13)、腺苷(RT = 3.83)和甘露醇(RT = 2. 52)，如圖2所示。通過與標準的蟲草素、腺苷、甘露醇對比可判別樣品中的蟲草素、腺苷、甘露醇；
(2)樣品中的蟲草素的色譜峰保留時間(RT)在SIM模式下(質量范圍267.00--269. 00)為4. 14分鐘，這與蟲草素標準的保留時間(4. 53分鐘)相似；樣品中的腺苷的色譜峰保留時間(RT)在SM模式下(質量范圍251. 00 - -253. 00)為3. 83分鐘，這與腺苷標準的保留時間(3. 66分鐘)相似；樣品中的甘露醇的色譜峰保留時間(RT)在SIM模式下(質量范圍180. 00 - -182. 00)為2. 52分鐘，這與甘露醇標準的保留時間(2. 54分鐘)相似,如圖3和圖4所示；
(3)如圖5、圖6和圖7所示，測得蟲草素的線性范圍為1-50μ g/ml，腺苷的線性范圍為0-500 μ g/ml，甘露糖醇的線性范圍為1-50 μ g/ml，所得峰面積-濃度標準曲線分別為
蟲草素Y=l. 68925e+0. 07+1. 90848e+0. 07*X, R2=O. 9931 ；腺苷Y=5. 81761e+0. 06+1. 77824e+0. 06*X, R2=O. 9919 ；
甘露醇Y=-2. 01439e+0. 07+895246*X, R2=O. 9957 ；
測定的蟲草素，腺苷和甘露糖醇的樣品濃度平均值分別為1.09 mg/L, 37.2 mg/L和253 mg/L ；(4)腺苷蟲、草素和甘露醇的檢出限分別為O. 16 μ g/ml、0. 23 μ g/ ml和7. 3 μ g/ml,三種成分的回收率從95. 2%到103.9%。
權利要求
1.一種測定蝙蝠蛾被毛孢菌絲體粉中蟲草素、腺苷、甘露醇的方法，其特征在于利用高效液相色譜一質譜聯用儀同時測定蝙蝠蛾被毛孢菌絲體粉中的蟲草素、腺苷、甘露醇。
2.如權利要求I所述一種測定蝙蝠蛾被毛孢菌絲體粉中蟲草素、腺苷、甘露醇的方法，其特征在于包括以下步驟 (一)樣品處理 精確稱取冬蟲夏草樣本的菌絲體粉O. 50 g,均勻研磨、混合，在容量瓶中用超純水定容，水浴超聲提取30分鐘，然后用0.45 μ m過濾膜過濾，所得續濾液用高效液相色譜一質譜聯用儀進行測定； (二)高效液相色譜一質譜聯用儀的測定條件(1)液相條件色譜柱為Thermo BioBasic-18 PIONEER (150 mm X 2. I mm, i. d. 5μπι);柱溫為30°C，進樣量為5μ I ;流動相為O. 05 mol/L甲酸-甲醇混合溶液(94:6，v/V)，流速為 O. 2 ml/min ； (2)質譜條件離子源為電噴霧離子源(ESI)，蟲草素、腺苷采用正電離模式，甘露醇采用負電離模式；保護氣體(N2)，流速為40 A. U.;輔助氣體(He)，流速為5 A. U.;毛細管溫度為350°C，噴霧電壓為4. O kV,毛細管電壓是28 V ;ESI接口和質譜參數進行優化，以達到最佳； (三)繪制標準曲線 分別稱取標準品腺苷、蟲草素、甘露醇適量，用超純水溶解使腺苷和蟲草素的濃度為100mg/L,甘露醇的濃度為500mg/L，作為貯備液；然后分別適量儲備液，用純水稀釋，依次配置腺苷和蟲草素濃度均為 10. O mg/L、20.0 mg/L、30. O mg/L、40. O mg/L、50. O mg/L,甘露醇濃度為 100. O mg/L,200. O mg/L、300. O mg/L,400. 0 mg/L、500. 0 mg/L 的混合標準工作液，將混合標準工作液進樣IOul在所述色譜和質譜條件下進行測定，以各組分的峰面積對濃度作回歸分析，得到峰面積-濃度標準曲線。
3.如權利要求I或2所述的一種測定蝙蝠蛾被毛孢菌絲體粉中蟲草素、腺苷、甘露醇的方法，其特征在于樣品和標準品的測定采用選擇性離子檢測模式(SIM)進行質譜采集。
全文摘要
本發明涉及一種測定蝙蝠蛾被毛孢菌絲體粉中蟲草素、腺苷、甘露醇的方法，特別是利用高效液相色譜質譜聯用儀來同時測定蝙蝠蛾被毛孢菌絲體粉中蟲草素、腺苷、甘露醇含量的方法，包括樣品和標準品的前處理、高效液相色譜質譜聯用儀的條件優化及樣品測定、數據的分析等步驟，最終確定流動相為甲酸-甲醇混合物(94:6,v/v)，色譜柱為ThermoBioBasic-18PIONEER(150mm×2.1mm,i.d.5μm)，采用選擇性離子檢測模式(SIM)，對三個活性組分進行定性、定量分析。本方法結合了色譜和質譜的優點，測定過程簡單快速，測定結果準確、靈敏度高，適用于蝙蝠蛾被毛孢菌絲體粉中的蟲草素、腺苷、甘露醇的分析檢測。
文檔編號G01N30/02GK102967670SQ20121047635
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月22日 優先權日2012年11月22日
發明者黃宏南 申請人:黃宏南